Name: Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Poznaj model niedokrwienia i reperfuzji w trzydniowym zarodku pisklęcia. Ta opłacalna metoda pozwala badać mechanizmy patofizjologiczne udaru i testować interwencje terapeutyczne w tkankach tętniczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy wyrazić naszą wdzięczność Hari Shankarowi za jego krytyczny wkład podczas filmowania i montażu, Panu Baqer Hussainowi za podkładanie głosu, Panu Asgharowi Rizvi za montaż wideo, Panu Mohammadowi Haiderowi za sesje wideo, Panu Mohammadowi Danish Siddiqui za pomoc podczas eksperymentów.

Instytucjonalna Komisja Etyki Zwierząt w Erze w Lucknow Medical College and Hospital wydała pisemne zrzeczenie się stwierdzające, że nie jest wymagane żadne formalne zatwierdzenie do przeprowadzenia tych eksperymentów zgodnie z Komitetem ds. Celów Kontroli i Nadzoru nad Eksperymentami na Zwierzętach (CPCSEA). Przestrzegano jednak standardowych procedur operacyjnych, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia zaburzeń embrionalnych.
1. Przygotowanie buforu (Tabela 1)
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Ringera
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór Ringera, rozpuścić 0,72 g NaCl (123 mM), 0,017 g CaCl2 (1,53 mM), 0,037 g KCl (4,96 mM) w 70 ml sterylnego destylowanegoH2O, o końcowej objętości 100 ml. Dostosować pH do 7,4. Pozwól mu całkowicie się rozpuścić i autoklawować. Następnie przefiltruj przez filtr 0,22 μm, podziel na ilości jednorazowego użytku (około 10 ml) i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sól fizjologiczną (0,9% chlorek sodu, NaCl).
	<ol>
		<li>W 70 ml sterylnego destylowanegoH2Orozpuścić 0,9 g NaCl (154 mM). Uzupełnić objętość do 100 ml. Autoklaw przez 15 minut w temperaturze 121 °C. W razie potrzeby doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 0,1 N HCl lub 0,1 N NaOH. Przygotować 10 ml porcji w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 70% etanolu (v/v).
	<ol>
		<li>Zmieszać 70 ml czystego etanolu (masowo 46,07 g/l) z 30 ml sterylnegoH2O. Przygotować w razie potrzeby lub przechowywać w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby sterylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1x Bufor Fosforanowy Soli Fizjologicznej (1x PBS).
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml 1x PBS, dodając 0,144 g Na2HPO4·7H2O (5,37 mM), 0,8 g NaCl (136,8 mM), 0,2 g KCl (26,8 mM), 0,2 g KH2PO4 (14,6 mM) do 70 ml wody destylowanej. Rozpuścić i uzupełnić objętość do objętości 100 ml i sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Doprowadzić pH do 7,4, dodając kilka kropli 0,1 N HCl lub 0,1 N NaOH, jeśli to konieczne. Przygotować porcje 10 ml w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dzień 1
<ol>
	<li>Ułóż wszystkie narzędzia niezbędne do sterylizacji jaj (70% etanol, chusteczki czyszczące, stojak na jajka i marker OHP).</li>
	<li>Oczyść jajka 0-day z 70% etanolem za pomocą chusteczek bibułkowych. Używaj tylko komórki jajowej 0-day, ponieważ starsze jaja mogą nie dać zarodka.</li>
	<li>Na jajach należy zapisać aktualną datę za pomocą markera OHP.</li>
	<li>Umieść jaja w inkubatorze do jaj ustawionym na temperaturę 36-37 °C i wilgotność 60%-65%. Inkubuj jaja przez następne 24 godziny.</li>
</ol>
3. Dzień 2
<ol>
	<li>Zorganizuj niezbędny sprzęt do pobrania 5-6 ml albuminy (nożyczki z ostrymi krawędziami, strzykawka 5 ml, igła 18 G, odrzutnik strzykawki i taśma klejąca).</li>
	<li>Przetrzyj nożyczki chirurgiczne 70% etanolem lub wysterylizuj w autoklawie po przetarciu ich 70% etanolem.</li>
	<li>Teraz wyjmij jajko z inkubatora do jaj w temperaturze 37 °C w celu ułożenia warstw</li>.
	<li>Umieść jajko na czystym stojaku na jajka.</li>
	<li>Przymocuj mały kawałek taśmy klejącej (rozmiar: około 1 cala długości x szerokości) do krawędzi jajka.</li>
	<li>Zrób mały otwór w krawędzi skorupki jajka za pomocą nożyczek o ostrych krawędziach. Włożyć strzykawkę o pojemności 5 ml pod przybliżonym kątem 75°. 
	UWAGA: Do strzykawki o pojemności 5 ml dołączona jest igła 24 G x 1 (sterylna), ale dobrze jest wymienić igłę 24 G x 1 na igłę 18 G x 1,5 (sterylna). Igła 18 G x 1,5 ma szerokość 1,25 x 38 mm. W związku z tym ułatwi usuwanie albuminy.</li>
	<li>Po wbiciu igły do woreczka żółtkowego powoli pobrać 5-6 ml albuminy. 
	UWAGA: Zapewnia to zarodkowi podłoże, na którym może rosnąć. Wycofanie albuminy zapobiega nadmiernemu rozlewaniu się albuminy podczas tworzenia okna. Wreszcie, ryzyko uszkodzenia zarodka podczas okienkowania jest zmniejszone poprzez wyeliminowanie 5-6 ml albuminy.</li>
	<li>Po usunięciu albuminy ponownie zakleić otwór taśmą klejącą i pozostawić jaja do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
</ol>
4. Dzień 4
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Ringera, 0,9% soli fizjologicznej i 1x PBS, jak opisano w sekcji 1 protokołu. Następnie przeprowadź trzy roztwory w autoklawie. Po sterylizacji w autoklawie umieść odpowiedni roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć jajko z inkubatora do jaj w temperaturze 37 °C i pokroić skorupkę w okrągły kształt. Przed przecięciem skorupki jajka przykryj obszar do cięcia taśmą klejącą. 
	UWAGA: Zakrycie obszaru okna taśmą klejącą zapobiega rozbijaniu skorupki jajka w niepożądane miejsca. Jeśli jednak włamiesz się w niechciane miejsce, uszczelnij to miejsce taśmą klejącą. Zaklejenie miejsc do cięcia taśmą klejącą zapobiega spadaniu kawałków skorupy na woreczek żółtkowy.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek o ostro zakończonych krawędziach wykonaj mały otwór w skorupce jajka w miejscu, w którym pożądane jest okienko, i zacznij wycinać okrągły otwór. Ten proces jest znany jako windowing. 
	UWAGA: Upewnij się, że okrągłe nacięcie jest wystarczająco duże, aby umożliwić łatwy dostęp do zarodka z dowolnego kierunku. W razie potrzeby zmień pozycję komórki jajowej, aby dostosować się do pozycji zarodka.</li>
	<li>Następnie, za pomocą mikroskopu chirurgicznego z zoomem stereoskopowym, zlokalizuj prawą tętnicę żółciową (RVA). 
	UWAGA: Zarodki kurczaków zwykle ulegają skręceniu klatki piersiowej (wraz ze zgięciem szyjki macicy itp.) w miarę rozwoju, tak że lewa strona głowy przylega do żółtka w fazie 72 godzin. Bardziej doogonowo, tam, gdzie tętnice witelinowe wychodzą z ciała, zarodek nie jest zbytnio skręcony, a ta część ciała leży brzuszną stroną w dół w kierunku żółtka. Tak więc, patrząc bezpośrednio, prawo od embrionu znajduje się po prawej stronie badacza.</li>
	<li>Po zlokalizowaniu RVA utwórz dwa małe otwory po lewej i prawej stronie RVA za pomocą igły 26 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść sondę do obrazowania przepływu krwi Dopplera nad RVA. Upewnij się, że sonda do obrazowania przepływu krwi metodą Dopplera jest umieszczona w odległości 5 ± 1 mm od miejsca niedokrwienia i w kierunku dystalnego końca RVA. Odczytuj strumień przez 2 minuty i 30 s (lub dłużej, jeśli chcesz). Będzie to odczyt fazy normoksycznej.</li>
	<li>W międzyczasie, za pomocą szczypiec do nosa i kleszczyków zębatych, ręcznie uformuj krawędź igły rdzeniowej w kształt haczyka (Rysunek 3). W tym celu należy zginać krawędź igły rdzeniowej na około 1 mm. Większy rozmiar utrudni wkładanie i wyjmowanie igły rdzeniowej podczas zabiegu I/R.</li>
	<li>Wbić igłę rdzeniową bezpośrednio pod prawą tętnicę żółciową za pomocą mikromanipulatora. 
	UWAGA: Wbij igłę rdzeniową z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć uszkodzenia RVA lub sąsiednich tętnic. Optymalna technika polega na wyregulowaniu specjalnie zaprojektowanego haka igły rdzeniowej dokładnie nad prawą stroną otworu RVA, a następnie stopniowym wprowadzaniu specjalnie zaprojektowanej krawędzi igły rdzeniowej do woreczka żółtkowego za pomocą mikromanipulatora pod kierunkiem mikroskopu chirurgicznego stereo zoom przez prawy otwór. Gdy haczyk igły rdzeniowej znajdzie się w woreczku żółtkowym, stopniowo reguluj haczyk pod RVA tak, aby jego krawędź znajdowała się dokładnie poniżej lewego otworu. Nadszedł czas, aby podnieść igłę rdzeniową.</li>
	<li>Teraz, za pomocą mikromanipulatora, stopniowo podnoś tętnicę, aż dopplerowski strumień przepływu krwi wskaże minimalny spadek przepływu tętniczego o 80%.</li>
	<li>Po osiągnięciu spadku strumienia dopplerowskiego o 80% lub więcej, pozostaw igłę rdzeniową uniesioną (ciągnącą tętnicę do góry) na 5 minut. Będzie to okres niedokrwienia w RVA. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest monitorowanie strumienia dopplerowskiego w czasie trwania niedokrwienia. Jeśli zostanie stwierdzona znaczna fluktuacja, zakończ testy.</li>
	<li>Po 5-minutowym okresie niedokrwienia stopniowo uwalniaj tętnicę, aby przywrócić prawidłowy poziom przepływu krwi. Upewnij się, że odczyt przepływomierza krwi Dopplera wyświetla wartości porównywalne z tymi uzyskanymi podczas normoksji. Będzie to okres reperfuzji w RVA (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Po zabiegu I/R nanieś kilka kropli (2-3) 1x PBS na zarodek i obserwuj go przez 2-3 min. 
	UWAGA: Stosowanie 1x PBS pomaga zapobiegać wysychaniu zarodka.</li>
	<li>Na koniec ponownie uszczelnij okno taśmą klejącą i umieść jajo z powrotem w inkubatorze na 5 godzin i 55 minut.</li>
	<li>Po 5 godzinach i 55 minutach wyjmij jajo z inkubatora, umieść je na stojaku na jajka, ponownie otwórz okno i postępuj zgodnie z protokołem dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
5. Zabiegi
<ol>
	<li>W przypadku leczenia tętnic lekami, aktywatorami lub inhibitorami, RVA należy wyciąć po 1 godzinie procesu I/R.</li>
	<li>W przypadku dalszych badań należy najpierw usunąć zarodek ze skorupki jaja, umieszczając go na sterylnej szalce Petriego o średnicy 90 mm.</li>
	<li>Gdy zarodek zostanie uwolniony na szalkę Petriego, wytnij RVA za pomocą tęczówki oka pod kierunkiem stereoskopowego mikroskopu chirurgicznego</li>.
	<li>Upewnij się, że wymiar wycięcia RVA wynosi do 15 ± 1 mm (dystalnie od tułowia), 5 ± 1 mm po lewej i prawej stronie tętnicy oraz 2 ± 1 mm w kierunku tułowia. 
	UWAGA: Do pomiaru powierzchni do wycięcia można użyć linijki (opcjonalnie).</li>
	<li>Po wycięciu RVA umyj go 1x PBS na sterylnej szalce Petriego zawierającej 1x PBS.</li>
	<li>W celu uzyskania pożądanych zabiegów należy umieścić tętnicę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (wysterylizowanej) wypełnionej 500 μl roztworu Ringera. Umieścić RVA w probówce wirówkowej i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 godzin i 55 minut. 
	UWAGA: W zależności od zabiegów, należy stosować roztwór Ringera bez żadnego leczenia lub stosować leczenie pożądaną objętością i stężeniem leku, aktywatora lub inhibitora.</li>
	<li>Po 5 godzinach i 55 minutach inkubacji wyjąć RVA z inkubatora laboratoryjnego o temperaturze 37 °C i przystąpić do żądanych zabiegów.</li>
</ol>

<ol><li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Embryo%3A+A+Preclinical+Model+for+Understanding+Ischemia-Reperfusion+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034(2018).</li>
<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+naringenin+is+mediated+through+suppression+of+NF-%CE%BAB+signaling+pathway+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke.</a> Neuroscience. 29 (230), 157-171 (2013).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperidin+ameliorates+functional+and+histological+outcome+and+reduces+neuroinflammation+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hesperidin ameliorates functional and histological outcome and reduces neuroinflammation in experimental stroke.</a> Brain Research. 28 (1420), 93-105 (2011).</li>
<li>Raza, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silymarin+protects+neurons+from+oxidative+stress+associated+damages+in+focal+cerebral+ischemia%3A+a+behavioral%2C+biochemical+and+immunohistological+study+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Silymarin protects neurons from oxidative stress associated damages in focal cerebral ischemia: a behavioral, biochemical and immunohistological study in Wistar rats.</a> Journal of the Neurological Sciences. 15 (1-2), 45-54 (2011).</li>
<li>Fan, L., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AG490+protects+cerebral+ischemia%2Freperfusion+injury+via+inhibiting+the+JAK2%2F3+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">AG490 protects cerebral ischemia/reperfusion injury via inhibiting the JAK2/3 signaling pathway.</a> Brain and Behavior. 11 (1), 01911(2021).</li>
<li>Wu, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Mechanistic+Concepts+in+Ischemia+and+Reperfusion+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Current Mechanistic Concepts in Ischemia and Reperfusion Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 46 (4), 1650-1667 (2018).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Allen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+in+vitro+models+for+drug+screening+and+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Cell lines as in vitro models for drug screening and toxicity studies.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 31 (8), 757-768 (2005).</li>
<li>Schmeer, C., Gamez, A., Tausch, S., Witte, O. W., Isenmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+modulate+heat+shock+protein+expression+and+enhance+retinal+ganglion+cell+survival+after+transient+retinal+ischemia%2Freperfusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Statins modulate heat shock protein expression and enhance retinal ganglion cell survival after transient retinal ischemia/reperfusion in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (11), 4971-4981 (2008).</li>
<li>Huang, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+of+acupuncture+for+improving+learning+and+memory+ability+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis of acupuncture for improving learning and memory ability in animals.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 16 (1), 297(2016).</li>
<li>Sommer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).</li>
<li>Yang, W., Chen, J., Meng, Y., Chen, Z., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+targets+for+treating+ischemia-reperfusion+injury+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel targets for treating ischemia-reperfusion injury in the liver.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1302(2018).</li>
<li>Seabra, R., Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+research+using+early+life+stage+models%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">In vivo research using early life stage models.</a> In Vivo. 24 (4), 457-462 (2010).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+peptide+alleviates+oxidative+stress+and+NLRP3+inflammasome+activation+after+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+by+regulating+AMPK%2FGSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Adiponectin peptide alleviates oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation after cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating AMPK/GSK-3beta.</a> Experiments in Neurology. 329, 113302(2020).</li>
<li>Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M., Pazoki Toroudi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lavender+oil+%28Lavandula+angustifolia%29+attenuates+renal+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+through+suppression+of+inflammation%2C+oxidative+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 110, 9-19 (2019).</li>
<li>Wallert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+preserves+cardiac+function+by+reducing+oxidative+stress+and+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol preserves cardiac function by reducing oxidative stress and inflammation in ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biology. 26, 101292(2019).</li>
<li>Ashafaq, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catechin+hydrate+ameliorates+redox+imbalance+and+limits+inflammatory+response+in+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia.</a> Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Abt, M. A., Grek, C. L., Ghatnekar, G. S., Yeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lung+metastasis+in+mouse+mammary+tumor+models+by+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lung metastasis in mouse mammary tumor models by quantitative real-time PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53329(2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+aggravates+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury+via+activating+TLR4+signaling+and+P2X%287%29R%2FNLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating TLR4 signaling and P2X(7)R/NLRP3 inflammasome.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 139, 75(2020).</li>
<li>Franke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NLRP3+inflammasome+drives+inflammation+in+ischemia%2Freperfusion+injury+after+transient+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behaviour+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The NLRP3 inflammasome drives inflammation in ischemia/reperfusion injury after transient middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Behaviour and Immunity. 92, 223(2021).</li>
<li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), 001651(2009).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pterostilbene+attenuates+astrocytic+inflammation+and+neuronal+oxidative+injury+after+ischemia-reperfusion+by+inhibiting+NF-kappaB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pterostilbene attenuates astrocytic inflammation and neuronal oxidative injury after ischemia-reperfusion by inhibiting NF-kappaB phosphorylation.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2408(2009).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sivelestat-loaded+nanostructured+lipid+carriers+modulate+oxidative+and+inflammatory+stress+in+human+dental+pulp+and+mesenchymal+stem+cells+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Sivelestat-loaded nanostructured lipid carriers modulate oxidative and inflammatory stress in human dental pulp and mesenchymal stem cells subjected to oxygen-glucose deprivation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 120, 111700(2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enhances+autophagy+in+stem+cells+through+Erk1%2F2+signaling+pathway+-+implications+for+neurotransplantations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enhances autophagy in stem cells through Erk1/2 signaling pathway - implications for neurotransplantations.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-coated+polycaprolactone+nanoparticle-mediated+naringenin+delivery+rescue+human+mesenchymal+stem+cells+from+oxygen+glucose+deprivation-induced+inflammatory+stress%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gelatin-coated polycaprolactone nanoparticle-mediated naringenin delivery rescue human mesenchymal stem cells from oxygen glucose deprivation-induced inflammatory stress.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (2), 683-695 (2019).</li>
<li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+effects+of+carvacrol+on+ischemia%2Freperfusion-induced+hippocampal+neuronal+impairment+by+ferroptosis+mitigation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective effects of carvacrol on ischemia/reperfusion-induced hippocampal neuronal impairment by ferroptosis mitigation.</a> Life Science. 235, 116795(2019).</li>
<li>Jin, Z., Guo, P., Li, X., Ke, J., Wang, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+irisin+against+cerebral+ischemia%2F+reperfusion+injury+via+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of irisin against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Notch signaling pathway.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 120, 109452(2019).</li>
<li>Wainrach, S., Sotelo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+the+developing+chick+embryo+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fur+Zellforschung+und+mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of the developing chick embryo heart.</a> Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische Anatomie. 55, 622-634 (1961).</li>
<li>Joshi, V. C., Wilson, A. C., Wakil, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+the+terminal+enzyme+of+the+stearoyl+coenzyme+A+desaturase+system+using+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Assay for the terminal enzyme of the stearoyl coenzyme A desaturase system using microsomes.</a> Journal of Lipid Research. 18 (1), 32-36 (1977).</li>
<li>Kain, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+as+an+expanding+experimental+model+for+cancer+and+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research.</a> Development Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).</li>
<li>Mann, R. A., Moore, K. L., Persaud, T. V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+in+the+u%7Ee+of+the+early+chick+embryo+88+a+teratological+model%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Limitations in the u~e of the early chick embryo 88 a teratological model.</a> Teratology. 7, 22-23 (1973).</li>
<li>Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+English+and+Translation+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro models of ischemia-reperfusion injury.</a> Regenerative English and Translation Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cerebral+ischemia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Animal models of cerebral ischemia: A review.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 131, 110686(2020).</li>
<li>Bromage, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischaemic+conditioning+reduces+infarct+size+in+animal+in+vivo+models+of+ischaemia-reperfusion+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Remote ischaemic conditioning reduces infarct size in animal in vivo models of ischaemia-reperfusion injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 288-297 (2017).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Hogers, B., DeRuiter, M. C., Baasten, A. M., Gittenberger-de Groot , A. C., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+blood+flow+patterns+related+to+the+yolk+sac+circulation+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Intracardiac blood flow patterns related to the yolk sac circulation of the chick embryo.</a> Circ Res. 76 (5), 871-877 (1995).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((angiogenesis-inflammation+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+novel+insights+from+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane%2Fhuman+vitreous+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">angiogenesis-inflammation cross talk in diabetic retinopathy: novel insights from the chick embryo chorioallantoic membrane/human vitreous platform.</a> Frontiers in Immunology. 11, 581288(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Celem badań nad niedokrwieniem i reperfuzją jest stworzenie strategii terapeutycznych, które zapobiegają śmierci komórek i sprzyjają rekonwalescencji29,30. Aby przezwyciężyć obecne ograniczenia w badaniach I/R, zaprojektowaliśmy model zarodka pisklęcia Hook I/R, aby uzyskać wiarygodny i powtarzalny model I/R. O ile nam wiadomo, jest to pierwszy model I/R, jaki kiedykolwiek stworzono na 3-dniowym zarodku pisklęcia do rutynowych eksperymentów I/R, oprócz badania sy...

Uszkodzenie tkanki niedokrwienno-reperfuzyjnej zostało powiązane z wieloma patologiami, w tym zawałami serca, udarem niedokrwiennym, urazami i chorobami naczyń obwodowych1,2,3,4,5. Wynika to przede wszystkim z braku kompleksowego zrozumienia przebiegu choroby oraz braku skutecznego modelu badawczego. Uraz niedokrwienny występuje, gdy dopływ krwi do określonego obszaru tkanki zostaje odcięty. W rezultacie tkanka niedokrwienna ostatecznie ulega nekrotyzji, chociaż tempo różni się w zależności od tkanki. W związku z tym przywrócenie dopływu krwi może pomóc w złagodzeniu szkód. Jednak w niektórych przypadkach zaobserwowano, że reperfuzja powoduje więcej uszkodzeń tkanek niż samo niedokrwienie6,7,8. Dlatego zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów niedokrwienia-reperfuzji jest niezbędne do opracowania skutecznej interwencji terapeutycznej. Obecnie nie jest znane skuteczne leczenie urazów I/R. Ta rozbieżność skłoniła do stworzenia nowych modeli eksperymentalnych, od modeli in vitro po modele in vivo, w celu rozwiązania istniejącego problemu9,10,11,12,13.
Embriony piskląt (Gallus gallus domesticus) są szeroko stosowane w badaniach ze względu na łatwość dostępu, etyczną akceptację, stosunkowo duży rozmiar (w porównaniu do innych embrionów), niski koszt i szybki wzrost14. Użyliśmy zarodka pisklęcia w 72 godzinach rozwoju, aby stworzyć in ovo I/R poprzez zamknięcie i uwolnienie prawej tętnicy żółciowej za pomocą igły rdzeniowej. Nazwaliśmy go modelem niedokrwienia-reperfuzji Hook-I/R (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Model wykorzystany w tym badaniu jest w stanie dokładnie symulować wszystkie dalsze procesy, w tym szlaki oksydacyjne i zapalne, które są często związane z uszkodzeniem I/R15,16,17.

<table><tbody><tr><td>(-80&deg; C) zamrażarka</td><td>Haier, Chiny-1,5</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ml probówka wirówkowa</td><td>TARSONS, Indie</td><td>500010X 100mm</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (sterylna)</td> <td>Tarsons, Indie</td><td>460050</td><td></td></tr><tr><td>18G Igła (18G&razy; 1.5 (1.25 razy; 38mm)</td> <td>Ramsons, Indie</td><td>13990</td><td></td></tr><tr><td>1mL Strzykawka</td><td>Igła DISPO VAN-26G</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(26G& razy; 1/2 (10.45x13mm)</td><td>DISPO VAN, indie</td><td>30722D</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; Inkubator do jaj C z regulowaną wilgotnością procentową</td><td>Gentek, Indie</td><td>GL-100</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; Inkubator laboratoryjny C</td><td>SCIENCE TECH, Indie</td><td>CB 101-14</td><td></td></tr><tr><td>3-metyladenina (3-MA)</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>M9281</td><td></td></tr><tr><td>3mL pipeta pastwiskowa</td><td>TARSONS, Indie</td><td>940050</td><td></td></tr><tr><td>50mL zlewka</td><td>TARSONS,</td> <td>Indie-5mL</td><td></td></tr> <tr><td>strzykawka</td><td>DISPO VAN, Indie</td><td>IP53</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Merck Millipore, Stany Zjednoczone</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca/taśma wiolonczelowa</td><td>Sunrise,</td> <td>Indie-Podkłady</td><td></td></tr> <tr><td>Ambra1</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td>Hs00387943_m1</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>IgG przeciw myszym</td>, USA <td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, USA</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Atg7</td><td>R& D Systems, Stany Zjednoczone</td><td>MAB6608</td><td></td></tr><tr><td>Startery Atg7</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td>Hs00893766_m1</td><td></td></tr><tr><td>Torba do autoklawu</td><td>Tarsons, Indie</td><td>550022</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw Maszyna</td><td>wyprodukowana lokalnie, Lucknow,</td> <td>Indie-Beclin-1</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech, USA</td><td>66665-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT07018</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>TC194</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>GRM534</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT5155</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki czyszczące</td><td>Kimberly-Clark, Indie</td><td>370080</td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza3</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT07022</td><td></td></tr><tr><td>di-sodowy wodorofosforan siedmiowodny</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>GRM39611</td><td></td></tr><tr><td>Dopplerowski przepływomierz krwi</td><td>Przyrząd Moors, Wielka Brytania</td><td>moorVMS-LDF1</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na jajka</td><td></td>-<td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na jajka</td>-<td></td><td></td>-<td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>M1000110</td><td></td></tr><tr><td>Startery GAPDH</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>Glycine</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>MB013</td><td></td></tr><tr><td>Tacka nerkowa</td><td>HOSPITO-LC3A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/B</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>4108S</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria metanolu</td><td>Rankem, Bombaj, Indie</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige, Japonia</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina (NAC)</td><td>Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Naringenina</td><td>Sigma Aldrich, Stany</td><td>Zjednoczone 67604-48-2</td><td></td></tr><tr><td>NF-k&beta;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany</td><td>Zjednoczone 51-0500</td><td></td></tr><tr><td>NLRP3</td><td>ImmunoTag, Stany Zjednoczone</td><td>ITT07438</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do nosa</td><td>Lokalnie wyprodukowane, Lucknow,</td> <td>Indie-Kleszcze</td><td></td></tr> <tr><td>do oczu</td><td>Stoelting, Niemcy</td><td>52106-40</td><td></td></tr><tr>Instrumenty chirurgiczne Tufft<td>z tęczówką oka</td><td>, Jaipur, Indie</td><td>Mikronożyczki Hard Age Vannas kątowe 8 CM / 3 1/8 "</td><td></td></tr><tr><td>OHP </td><td>marker Camlin,</td> Indie-ORP-150 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ImmunoTag, Stany</td><td>Zjednoczone ITT08329</td><td></td></tr><tr><td>Spiczaste nożyczki z ostrymi krawędziami</td><td>Stoelting, Niemcy</td><td>52132-11</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>MB050</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Abcam, Stany Zjednoczone</td><td>Ab65621</td><td></td></tr><tr><td>SOD-1</td><td>ImmunoTag, Stany Zjednoczone</td><td>ITT4364</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific, Bombaj, Indie</td><td>27605</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>GRM886</td><td></td></tr><tr><td>Igła do rdzenia kręgowego 25GA; 3,50 cala (90,51 x 90 mm)</td><td>Ramson, Indie</td><td>GS-2029</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny z zoomem stereoskopowym</td><td>Olympus, Japonia</td><td>Odrzutnik strzykawek SZ2-STU3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BIOHAZARD</td><td>882210</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate</td><td>Stoelting, Niemcy</td><td>52102-30</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>G Biosciences, Stany Zjednoczone</td><td>RC1217</td><td></td></tr><tr><td>Tris Kwas solny</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>MB030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>G Biosciences, Stany Zjednoczone</td><td>RC1227</td><td></td></tr><tr><td>Jaja 0-dniowe z kurczaka White Leghorn</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK</td><td>MP Biomedicals, LLC, USA</td><td>FK009</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

Zaburzenia niedokrwienia i reperfuzji (I/R), takie jak zawał mięśnia sercowego, udar mózgu i choroby naczyń obwodowych, to tylko niektóre z głównych przyczyn chorób i śmierci. Obecnie dostępnych jest wiele modeli in vitro i in vivo do badania mechanizmu I/R w chorobach lub uszkodzonych tkankach. Jednak do tej pory nie zgłoszono żadnego modelu I/R in ovo, który pozwoliłby na lepsze zrozumienie mechanizmów I/R i szybsze badania przesiewowe leków. W tym artykule opisano modelowanie I/R przy użyciu dostosowanego haka do igieł rdzeniowych w 3-dniowym zarodku pisklęcia, aby zrozumieć mechanizmy rozwoju I/R i leczenia. Nasz model może być wykorzystany do badania anomalii na poziomie DNA, RNA i białek. Ta metoda jest prosta, szybka i niedroga. Obecny model może być stosowany niezależnie lub w połączeniu z istniejącymi modelami I/R in vitro i in vivo.

Do oceny skuteczności naszego modelu wykorzystano technikę obrazowania przepływu krwi metodą Dopplera. W skrócie, dane z grupy kontrolnej porównano z danymi z grupy RVA, aby określić sukces naszej procedury. Rysunek 4A przedstawia typowy przepływ u zwierzęcia kontrolnego, natomiast Rysunek 4B przedstawia wyniki uzyskane z RVA. Numery 1-8 reprezentują poszczególne zdarzenia związane z fazami I/R. Mówiąc krótko, numery 1-3 odpowiadają fazie normoksji, natomiast gw...

Ten artykuł opisuje modelowanie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) w 3-dniowym zarodku pisklęcia za pomocą dostosowanego haka do igły rdzeniowej, aby lepiej zrozumieć rozwój i leczenie I/R. Ten model jest prosty, szybki i niedrogi.

Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...

Cześć, nazywam się dr Syed Shadab Raza, jestem głównym badaczem w Laboratorium Komórek Macierzystych i Neurologii Odtwórczej, znajdującym się na Wydziale Biotechnologii w kampusie Era University w Lucknow w Indiach. W moim laboratorium staramy się zrozumieć patofizjologiczny mechanizm leżący u podstaw zaburzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych oraz interwencje, które mogą odwrócić te procesy. W tym kontekście często stosujemy model udaru niedokrwiennego mózgu in vitro i in vivo.Niedawno stworzyliśmy model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia. Teraz moi studenci pokażą wam, jak odtworzyć uraz niedokrwienno-reperfuzyjny u trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia. Teraz pokażemy Ci, jak stworzyć niedokrwienie-reperfuzję w trzydniowym zarodku pisklęcia.Nasz model jest opłacalny, efektywny czasowo i wysoce powtarzalny. Więc zacznijmy. Dzień pierwszy.Wymagania na pierwszy dzień. Procedura. Oczyść jajko dnia zerowego 70% etanolem za pomocą chusteczek bibułkowych. Następnie napisz aktualny dzień, datę, na jajach za pomocą markera OHP, a następnie umieść jaja w inkubatorze jaj o temperaturze od 36 do 37 stopni Celsjusza i wilgotności od 60 do 65%.Wysiaduj jaja przez następne 24 godziny. Dzień drugi. Wymagania na drugi dzień. Procedura.Przetrzyj nożyczki chirurgiczne 70% etanolem lub użyj autoklawu. Po 24 godzinach inkubacji wyjmij jajo z inkubatora w celu ułożenia warstw. Następnie przymocuj mały kawałek taśmy Sellotape o długości i szerokości około jednego cala do krawędzi jajka, a następnie zrób mały otwór w krawędzi skorupki jajka za pomocą nożyczek o ostrych krawędziach, a następnie włóż strzykawkę o pojemności pięciu ml pod kątem około 75 stopni.Po włożeniu igły do worka z żółtkiem powoli pobrać od pięciu do sześciu ml albuminy. Po usunięciu albuminy ponownie uszczelnij otwór taśmą Sellotape i włóż jajo z powrotem do inkubatora jaj o temperaturze 37 stopni Celsjusza na następne 48 godzin. Dzień czwarty.Wymagania na czwarty dzień. Procedura. Przygotować roztwór Ringera, 0,9% soli fizjologicznej i jeden bufor buforowy X soli fizjologicznej zgodnie z tabelami zamieszczonymi w tym manuskrypcie. Następnie autoklaw trzech roztworów.Po autoklawie odpowiednie roztwory można umieścić w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij jajko z inkubatora do jaj o temperaturze 37 stopni. Teraz, przed przecięciem skorupy, zakryj obszar okienka taśmą Sellotape.A teraz zrób mały otwór w skorupce jajka i zacznij wycinać okrągły otwór. Ten proces jest znany jako okienkowanie. Upewnij się, że okrągłe nacięcie jest wystarczająco duże, aby zarodek był łatwo dostępny z dowolnego kierunku, ponieważ może być konieczne dostosowanie położenia jaja zgodnie z pozycją zarodka.Teraz, za pomocą mikroskopu chirurgicznego z zoomem stereoskopowym, zlokalizuj prawą tętnicę życiową lub RVA. Tutaj strzałka wskazuje trzydniowy etap rozwoju zarodka. Po zlokalizowaniu RVA, za pomocą igły 26 G wykonaj dwa małe otwory po lewej i prawej stronie RVA.Następnie wyreguluj sondę obrazowania przepływu krwi Dopplera na RVA. Dopplerowska sonda do obrazowania przepływu krwi powinna być umieszczona pięć plus minus jeden milimetr od miejsca niedokrwienia i dwie trzecie dystalnego końca RVA. Odczytuj topnik przez 30 sekund do dwóch minut, zgodnie z potrzebami.Spowoduje to odczyt fazy normoksji. Teraz ręcznie uformuj krawędź igły kręgosłupa, aby nadać jej kształt haczyka za pomocą szczypiec do nosa, a następnie kleszczy do zębów. Teraz, za pomocą mikromanipulatora, wprowadź igłę rdzeniową tuż pod prawą tętnicą życiową.Jesteś gotowy do podniesienia igły rdzeniowej. Teraz za pomocą mikromanipulatora powoli podnieś tętnicę, aż strumień przepływu krwi Dopplera wykaże minimalny spadek przepływu tętniczego o 80%. Po osiągnięciu spadku strumienia dopplerowskiego o 80% lub więcej, pozostaw igłę rdzeniową uniesioną do góry, ciągnąc tętnicę przez pięć minut.Będzie to okres niedokrwienia. Po upływie pięciu minut powoli zwolnij tętnicę za pomocą mikromanipulatora, aby przywrócić normalny poziom przepływu krwi. Teraz dopplerowski przepływomierz krwi powinien pokazywać odczyty podobne do tych obserwowanych podczas normoksji.Będzie to okres reperfuzji w RVA. Po procesie I/R nałóż dwie, trzy krople 1X PBS na zarodek. Na koniec ponownie uszczelnij okienko taśmą Sellotape, a następnie umieść jajo z powrotem w inkubatorze na pięć godzin i 55 minut.Po pięciu godzinach i 55 minutach wyjmij jajko z inkubatora i umieść je na tacy na jajka i ponownie otwórz okno. Wymagania dotyczące leczenia. Procedura. W celu leczenia tętnic lekami, aktywatorami lub inhibitorami, RVA należy wyciąć po jednej godzinie procesu I/R.Wyjmij zarodek ze skorupy, wyjmując go ze skorupy na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Po uwolnieniu zarodka na szalce Petriego należy wyciąć RVA za pomocą tęczówki oka pod kierunkiem mikroskopu chirurgicznego stereo zoom. Wymiar wycięcia RVA powinien wynosić do 15 plus minus jeden milimetr dystalnie od tułowia i dwa plus minus jeden milimetr w kierunku tułowia.Po wycięciu RVA umyj go 1X PBS na nowej, sterylnej szalce Petriego. W celu uzyskania pożądanych zabiegów umieść tętnicę w wysterylizowanej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej 500 mikrolitrami roztworu Ringera. A po umieszczeniu tętnicy w probówce wirówkowej umieść w inkubatorze laboratoryjnym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć godzin.Po pięciu godzinach inkubacji wyjmij RVA z inkubatora laboratoryjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przystąp do pożądanych zabiegów. A teraz zaprezentujemy wyniki. Aby zweryfikować przydatność naszego modelu w badaniach nad reperfuzją niedokrwienną w tętnicach niedokrwiennych, najpierw przyjrzeliśmy się aktywności białek regulatorowych tlenu 150 lub ORP150, cytoplazmatycznej dysmutazy ponadtlenkowej lub SOD1 i katalazy.RVA traktowane I/R wykazały zwiększoną aktywność ORP150, cytoplazmatycznego SOD1 i katalazy w porównaniu z grupą kontrolną, jednak suplementacja N-acetylo-L-cysteiną lub NAC, gasicielem ROS, zmniejszyła stres oksydacyjny w grupie I / R, co można zauważyć na obecnym rysunku. Aby ustalić użyteczność tego modelu w badaniach zapalnych, przyjrzeliśmy się ekspresji I/R-1 beta i TNF-alfa w RVA traktowanych I/R w porównaniu z RVA kontrolnymi. Stwierdzono, że obie interleukiny mają nadmierną ekspresję w grupie Hook-I/R w porównaniu z grupą kontrolną.Suplementacja Naringeniny, leku przeciwzapalnego, znacznie obniżyła poziom IL1-beta, a także TNF-alfa. Następnie zbadaliśmy ekspresję NLRP3 i NF-kappa beta poprzez Western blot. Analiza ta odkryła dowody na aktywację inflamasomu NLRP3, a także NF-kappa beta w odpowiedzi na I/R wytwarzane w RVA.Podobnie jak w poprzednich wynikach, naringenina zmniejszała ekspresję NLRP3 i NF-kappa beta. Wyniki te pokazały, że nasz model może być wykorzystany do badania zmian zapalnych. Następnie zbadaliśmy wpływ I/R na szlaki apoptozy i autofagii.Po pierwsze, na rysunku A, uzyskaliśmy dostęp do wyrażenia rozszczepionej kaspazy-3. Zaobserwowaliśmy zwiększoną ekspresję rozszczepionej kaspazy-3 w grupie I/R w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa I/R otrzymująca ZVADFMK wykazała spadek ekspresji kaspazy-3. Podobnie w przypadku autofagii, grupa I/R wykazywała wysoki poziom białka LC3, markera autofagosomu Beclin-1, kluczowego regulatora autofagii w komórkach ssaków, i ATG-7, białka wymaganego do podstawowej autofagii, niż grupa kontrolna, podczas gdy grupy otrzymujące 3-ma, inhibitor autofagii, wykazały spadek ekspresji powyższych trzech białek autofagii, jak wynika z rysunków B do D. Rysunek E pokazuje wpływ I/R za pośrednictwem Hook na poziomy mRNA ambra-1 i ATG-7.Wyniki te były zgodne z poprzednimi wynikami, to znaczy zaobserwowano zwiększoną ekspresję mRNA dla ambra-1 i ATG-7 w RVA traktowanych I/R w porównaniu z ich odpowiednimi kontrolami. Jednak wyniki zostały odwrócone, gdy 3-ma dodano do grupy I/R. Obecna liczba przedstawia skuteczność naszego modelu w badaniu zmian w DNA.Zaobserwowaliśmy intensywny rozmaz DNA w grupie leczonej I/R w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak suplementacja NAC do grupy I/R RVA odwróciła wynik. Aby sprawdzić, jak skuteczny jest nasz model w porównaniu z innymi modelami, porównaliśmy dane wygenerowane przez nasz model Hook-I/R i model MCAO w niniejszym eksperymencie.Krótko mówiąc, ekspresja białka apoptotycznego, rozszczepionej kaspazy-3, białek autofagii, Beclin-1 i ATG-7 oraz zapalnych interleukin, TNF i IFN, musiała być wyższa w RVA traktowanych I/R niż w kontrolnych RVA. Co ciekawe, model Hook-I/R dał wyniki, które były bardzo podobne do tych uzyskanych przez model MCAO, niezależnie od tego, czy była to analiza stresu zapalnego, czy szlaków śmierci komórkowej. Nasz model może być używany do rutynowych eksperymentów niedokrwienno-reperfuzyjnych, samodzielnie lub równolegle do istniejących modeli.Jednak podczas naśladowania niedokrwienia-reperfuzji należy zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania otworów po prawej i lewej stronie RVA, a także podczas zamykania lub uwalniania RVA, aby nie uszkodził żadnych tętnic ani żył. W rutynowej biologii molekularnej, takiej jak Western blotting, analizator QRT-PCR, kwasy chemiczne i techniki obrazowania mogą być improwizowane, aby powiązać patofizjologię związaną z niedokrwieniem-reperfuzją w ciągu trzech dni rozwijającego się zarodka pisklęcia. Model ten może być skutecznie wykorzystany do badania mechaniki molekularnej na poziomie DNA, RNA i białek.Jak już pokazaliśmy, modelowanie I/R w trzydniowym rozwoju zarodka pisklęcia, wierzymy, że nasz model otworzy nowe drogi w dziedzinie badań I/R. W związku z tą pracą życzę Ci wszystkiego najlepszego w Twoich eksperymentach. Dziękuję.

generation-hook-ischemia-reperfusion-model-using-three-day-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Po raz pierwszy prezentujemy tutaj powtarzalną procedurę bandingu zmieniającą hemodynamikę w rozwijającym się sercu ex ovo. Osiąga się to poprzez częściowe zwężenie drogi odpływu (OFT).

Nowatorska technika pasmowania ex ovo w celu zmiany hemodynamiki wewnątrzsercowej w embrionalnym układzie kurcząt

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualny do wykonania modelu podwiązania lewego przedsionka (LAL) w zarodku ptaka. Model LAL zmienia przepływ wewnątrzsercowy, który zmienia obciążenie naprężeniem ścinającym ścianę, naśladując zespół niedorozwoju lewego serca. Przedstawiono podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z tym trudnym modelem mikrochirurgii.

Podwiązanie lewego przedsionka w zarodku ptaka jako model zmienionego obciążenia hemodynamicznego we wczesnym rozwoju naczyniowym

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

Poznaj model niedokrwienia i reperfuzji w trzydniowym zarodku pisklęcia. Ta opłacalna metoda pozwala badać mechanizmy patofizjologiczne udaru i testować interwencje terapeutyczne w tkankach tętniczych.

Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Przeglądaj więcej filmów