Generowanie modelu niedokrwienia haka i reperfuzji przy użyciu trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia

Cześć, nazywam się dr Syed Shadab Raza, jestem głównym badaczem w Laboratorium Komórek Macierzystych i Neurologii Odtwórczej, znajdującym się na Wydziale Biotechnologii w kampusie Era University w Lucknow w Indiach. W moim laboratorium staramy się zrozumieć patofizjologiczny mechanizm leżący u podstaw zaburzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych oraz interwencje, które mogą odwrócić te procesy. W tym kontekście często stosujemy model udaru niedokrwiennego mózgu in vitro i in vivo.

Niedawno stworzyliśmy model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia. Teraz moi studenci pokażą wam, jak odtworzyć uraz niedokrwienno-reperfuzyjny u trzydniowego rozwijającego się zarodka pisklęcia. Teraz pokażemy Ci, jak stworzyć niedokrwienie-reperfuzję w trzydniowym zarodku pisklęcia.

Nasz model jest opłacalny, efektywny czasowo i wysoce powtarzalny. Więc zacznijmy. Dzień pierwszy.

Wymagania na pierwszy dzień. Procedura. Oczyść jajko dnia zerowego 70% etanolem za pomocą chusteczek bibułkowych. Następnie napisz aktualny dzień, datę, na jajach za pomocą markera OHP, a następnie umieść jaja w inkubatorze jaj o temperaturze od 36 do 37 stopni Celsjusza i wilgotności od 60 do 65%.

Wysiaduj jaja przez następne 24 godziny. Dzień drugi. Wymagania na drugi dzień. Procedura.

Przetrzyj nożyczki chirurgiczne 70% etanolem lub użyj autoklawu. Po 24 godzinach inkubacji wyjmij jajo z inkubatora w celu ułożenia warstw. Następnie przymocuj mały kawałek taśmy Sellotape o długości i szerokości około jednego cala do krawędzi jajka, a następnie zrób mały otwór w krawędzi skorupki jajka za pomocą nożyczek o ostrych krawędziach, a następnie włóż strzykawkę o pojemności pięciu ml pod kątem około 75 stopni.

Po włożeniu igły do worka z żółtkiem powoli pobrać od pięciu do sześciu ml albuminy. Po usunięciu albuminy ponownie uszczelnij otwór taśmą Sellotape i włóż jajo z powrotem do inkubatora jaj o temperaturze 37 stopni Celsjusza na następne 48 godzin. Dzień czwarty.

Wymagania na czwarty dzień. Procedura. Przygotować roztwór Ringera, 0,9% soli fizjologicznej i jeden bufor buforowy X soli fizjologicznej zgodnie z tabelami zamieszczonymi w tym manuskrypcie. Następnie autoklaw trzech roztworów.

Po autoklawie odpowiednie roztwory można umieścić w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij jajko z inkubatora do jaj o temperaturze 37 stopni. Teraz, przed przecięciem skorupy, zakryj obszar okienka taśmą Sellotape.

A teraz zrób mały otwór w skorupce jajka i zacznij wycinać okrągły otwór. Ten proces jest znany jako okienkowanie. Upewnij się, że okrągłe nacięcie jest wystarczająco duże, aby zarodek był łatwo dostępny z dowolnego kierunku, ponieważ może być konieczne dostosowanie położenia jaja zgodnie z pozycją zarodka.

Teraz, za pomocą mikroskopu chirurgicznego z zoomem stereoskopowym, zlokalizuj prawą tętnicę życiową lub RVA. Tutaj strzałka wskazuje trzydniowy etap rozwoju zarodka. Po zlokalizowaniu RVA, za pomocą igły 26 G wykonaj dwa małe otwory po lewej i prawej stronie RVA.

Następnie wyreguluj sondę obrazowania przepływu krwi Dopplera na RVA. Dopplerowska sonda do obrazowania przepływu krwi powinna być umieszczona pięć plus minus jeden milimetr od miejsca niedokrwienia i dwie trzecie dystalnego końca RVA. Odczytuj topnik przez 30 sekund do dwóch minut, zgodnie z potrzebami.

Spowoduje to odczyt fazy normoksji. Teraz ręcznie uformuj krawędź igły kręgosłupa, aby nadać jej kształt haczyka za pomocą szczypiec do nosa, a następnie kleszczy do zębów. Teraz, za pomocą mikromanipulatora, wprowadź igłę rdzeniową tuż pod prawą tętnicą życiową.

Jesteś gotowy do podniesienia igły rdzeniowej. Teraz za pomocą mikromanipulatora powoli podnieś tętnicę, aż strumień przepływu krwi Dopplera wykaże minimalny spadek przepływu tętniczego o 80%. Po osiągnięciu spadku strumienia dopplerowskiego o 80% lub więcej, pozostaw igłę rdzeniową uniesioną do góry, ciągnąc tętnicę przez pięć minut.

Będzie to okres niedokrwienia. Po upływie pięciu minut powoli zwolnij tętnicę za pomocą mikromanipulatora, aby przywrócić normalny poziom przepływu krwi. Teraz dopplerowski przepływomierz krwi powinien pokazywać odczyty podobne do tych obserwowanych podczas normoksji.

Będzie to okres reperfuzji w RVA. Po procesie I/R nałóż dwie, trzy krople 1X PBS na zarodek. Na koniec ponownie uszczelnij okienko taśmą Sellotape, a następnie umieść jajo z powrotem w inkubatorze na pięć godzin i 55 minut.

Po pięciu godzinach i 55 minutach wyjmij jajko z inkubatora i umieść je na tacy na jajka i ponownie otwórz okno. Wymagania dotyczące leczenia. Procedura. W celu leczenia tętnic lekami, aktywatorami lub inhibitorami, RVA należy wyciąć po jednej godzinie procesu I/R.

Wyjmij zarodek ze skorupy, wyjmując go ze skorupy na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Po uwolnieniu zarodka na szalce Petriego należy wyciąć RVA za pomocą tęczówki oka pod kierunkiem mikroskopu chirurgicznego stereo zoom. Wymiar wycięcia RVA powinien wynosić do 15 plus minus jeden milimetr dystalnie od tułowia i dwa plus minus jeden milimetr w kierunku tułowia.

Po wycięciu RVA umyj go 1X PBS na nowej, sterylnej szalce Petriego. W celu uzyskania pożądanych zabiegów umieść tętnicę w wysterylizowanej 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej 500 mikrolitrami roztworu Ringera. A po umieszczeniu tętnicy w probówce wirówkowej umieść w inkubatorze laboratoryjnym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć godzin.

Po pięciu godzinach inkubacji wyjmij RVA z inkubatora laboratoryjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przystąp do pożądanych zabiegów. A teraz zaprezentujemy wyniki. Aby zweryfikować przydatność naszego modelu w badaniach nad reperfuzją niedokrwienną w tętnicach niedokrwiennych, najpierw przyjrzeliśmy się aktywności białek regulatorowych tlenu 150 lub ORP150, cytoplazmatycznej dysmutazy ponadtlenkowej lub SOD1 i katalazy.

RVA traktowane I/R wykazały zwiększoną aktywność ORP150, cytoplazmatycznego SOD1 i katalazy w porównaniu z grupą kontrolną, jednak suplementacja N-acetylo-L-cysteiną lub NAC, gasicielem ROS, zmniejszyła stres oksydacyjny w grupie I / R, co można zauważyć na obecnym rysunku. Aby ustalić użyteczność tego modelu w badaniach zapalnych, przyjrzeliśmy się ekspresji I/R-1 beta i TNF-alfa w RVA traktowanych I/R w porównaniu z RVA kontrolnymi. Stwierdzono, że obie interleukiny mają nadmierną ekspresję w grupie Hook-I/R w porównaniu z grupą kontrolną.

Suplementacja Naringeniny, leku przeciwzapalnego, znacznie obniżyła poziom IL1-beta, a także TNF-alfa. Następnie zbadaliśmy ekspresję NLRP3 i NF-kappa beta poprzez Western blot. Analiza ta odkryła dowody na aktywację inflamasomu NLRP3, a także NF-kappa beta w odpowiedzi na I/R wytwarzane w RVA.

Podobnie jak w poprzednich wynikach, naringenina zmniejszała ekspresję NLRP3 i NF-kappa beta. Wyniki te pokazały, że nasz model może być wykorzystany do badania zmian zapalnych. Następnie zbadaliśmy wpływ I/R na szlaki apoptozy i autofagii.

Po pierwsze, na rysunku A, uzyskaliśmy dostęp do wyrażenia rozszczepionej kaspazy-3. Zaobserwowaliśmy zwiększoną ekspresję rozszczepionej kaspazy-3 w grupie I/R w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa I/R otrzymująca ZVADFMK wykazała spadek ekspresji kaspazy-3. Podobnie w przypadku autofagii, grupa I/R wykazywała wysoki poziom białka LC3, markera autofagosomu Beclin-1, kluczowego regulatora autofagii w komórkach ssaków, i ATG-7, białka wymaganego do podstawowej autofagii, niż grupa kontrolna, podczas gdy grupy otrzymujące 3-ma, inhibitor autofagii, wykazały spadek ekspresji powyższych trzech białek autofagii, jak wynika z rysunków B do D. Rysunek E pokazuje wpływ I/R za pośrednictwem Hook na poziomy mRNA ambra-1 i ATG-7.

Wyniki te były zgodne z poprzednimi wynikami, to znaczy zaobserwowano zwiększoną ekspresję mRNA dla ambra-1 i ATG-7 w RVA traktowanych I/R w porównaniu z ich odpowiednimi kontrolami. Jednak wyniki zostały odwrócone, gdy 3-ma dodano do grupy I/R. Obecna liczba przedstawia skuteczność naszego modelu w badaniu zmian w DNA.

Zaobserwowaliśmy intensywny rozmaz DNA w grupie leczonej I/R w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak suplementacja NAC do grupy I/R RVA odwróciła wynik. Aby sprawdzić, jak skuteczny jest nasz model w porównaniu z innymi modelami, porównaliśmy dane wygenerowane przez nasz model Hook-I/R i model MCAO w niniejszym eksperymencie.

Krótko mówiąc, ekspresja białka apoptotycznego, rozszczepionej kaspazy-3, białek autofagii, Beclin-1 i ATG-7 oraz zapalnych interleukin, TNF i IFN, musiała być wyższa w RVA traktowanych I/R niż w kontrolnych RVA. Co ciekawe, model Hook-I/R dał wyniki, które były bardzo podobne do tych uzyskanych przez model MCAO, niezależnie od tego, czy była to analiza stresu zapalnego, czy szlaków śmierci komórkowej. Nasz model może być używany do rutynowych eksperymentów niedokrwienno-reperfuzyjnych, samodzielnie lub równolegle do istniejących modeli.

Jednak podczas naśladowania niedokrwienia-reperfuzji należy zachować najwyższą ostrożność podczas wykonywania otworów po prawej i lewej stronie RVA, a także podczas zamykania lub uwalniania RVA, aby nie uszkodził żadnych tętnic ani żył. W rutynowej biologii molekularnej, takiej jak Western blotting, analizator QRT-PCR, kwasy chemiczne i techniki obrazowania mogą być improwizowane, aby powiązać patofizjologię związaną z niedokrwieniem-reperfuzją w ciągu trzech dni rozwijającego się zarodka pisklęcia. Model ten może być skutecznie wykorzystany do badania mechaniki molekularnej na poziomie DNA, RNA i białek.

Jak już pokazaliśmy, modelowanie I/R w trzydniowym rozwoju zarodka pisklęcia, wierzymy, że nasz model otworzy nowe drogi w dziedzinie badań I/R. W związku z tą pracą życzę Ci wszystkiego najlepszego w Twoich eksperymentach. Dziękuję.