Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)
31 marca 2022
W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.
Metoda ta zapewnia lepsze zrozumienie organizacji strukturalnej cząstek glikogenu. Jest to istotna kwestia, ponieważ o właściwościach fizykochemicznych cząstek glikogenu decyduje populacja łańcuchów glukanowych, tzw. rozkład długości łańcucha. Takich jak rozpuszczalność w wodzie.
Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że fluorescencja jest stała niezależnie od długości łańcucha glukanu. Istnieje tylko jedna cząsteczka APTS związana przez glukan. Zatem intensywność fluorescencji jest wprost proporcjonalna do liczby łańcuchów glukanu.
Pole do wspomaganej elektroforezy kapilarnej jest odpowiednie do rozwiązania medycznego mechanizmu enzymów metabolizujących glikogen. Na przykład możemy określić stopień polimeryzacji łańcuchów glukanu przenoszonych przez enzymy rozgałęziające się na akceptowany glukan. Reakcja musi być przeprowadzona w warunkach.
Dlatego regiony muszą być chronione przed wilgocią. Wymieszaj 200 mikrolitrów 0,5-2 miligramów na mililitr oczyszczonego glikogenu z 200 mikrolitrami 100-octanowego buforu o pH 4,8. Dodaj 2 mikrolitry izoamylazy i 1,5 mikrolitra pullulanazy.
Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 16 godzin w 1,5 mililitrowej probówce. Zatrzymaj reakcje, inkubując w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut.
Wirować przy 16, 100 razy G' przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia i usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Usuń super konserwację za pomocą pipety i przenieś je do nowych probówek z adnotacjami. Po dodaniu kulek żywicy do pustej probówki z mikro-fuge, odsolić supernatanty, dodając równowartość 100 mikrolitrów kulek żywicy anionowymiennej i wymieszać.
Pobrać próbki przez pipetowanie i umieścić je w nowych probówkach z adnotacjami. Próbki należy wysuszyć na zimno. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 20 stopni Celsjusza.
Wysuszone próbki wymieszać z 2 mikrolitrami 1 molowego cyjanoborowodorku sodu i tetrahydrofuranu oraz 2 mikrolitrami 8-amino-3-6 pirenotrisulfonowego kwasu. Inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 16 godzin w ciemności. Do każdej próbki dodaj 46 mikrolitrów ultra czystej wody.
Aby rozcieńczyć próbki 50 razy, dodaj jeden mikrolitr próbki do 49 mikrolitrów ultra czystej wody w 100 mikrolitrach mikrofiolek. W wirze dokładnie wymieszać. Umieść próbki w ciemności na 5 do 10 minut, jednocześnie ustawiając twarz.
Aby wykonać elektroforezę z odwrotną polaryzacją, ustaw metodę, ustaw ciśnienie wtrysku na 0,5 funta siły na cal kwadratowy. Następnie ustaw polaryzację na tryb odwrotny w celu separacji. Rozcieńczyć bufor do separacji węglowodanów sprzężonych z azotem do jednej trzeciej w ultra czystej wodzie.
Przeprowadzić separację glukanów oznaczoną APTS w rozcieńczonym buforze o napięciu 30 kilowoltów w czystej kapilarze z topionej krzemionki. Następnie ustaw czas wtrysku i rozpocznij analizę. Eksportuj pliki ASC i CDF zawierające odpowiednio profil elektroferogramu i dane integracji.
Otwórz plik ASC i narysuj względną jednostkę fluorescencji zgodnie z wykresem czasowym. Otwórz plik CDF. Kontynuuj pierwszą automatyczną integrację i dostosuj następujące parametry z całkowaniem między dolinami i minimalną powierzchnią.
Ręcznie sprawdź i skoryguj wszelkie nieprawidłowe zdarzenia integracyjne. Sygnały fluorescencyjne zaobserwowane między 4,13 a 4,67 minuty pochodziły z nieprzereagowanych APTS. Czas aleucki oznaczania Maltohexaose DP 6 oszacowano na 8,49 minuty.
Glukany glikogenu bydlęcego znakowane APTS zidentyfikowano na podstawie czasu aleuckiego DP 6. Nie wykryto śladów wolnego maltooligosacharydu w próbce kontrolnej, w której glikogen nie był inkubowany z enzymami rozgałęziającymi. Panel wpuszczany pokazuje separację łańcuchów Glucan do 44 DP. Rozkład długości łańcucha jest pokazany jako procent DP dla każdego DP. Średnią długość łańcucha obliczono, sumując każdy procentowy łańcuch razy odpowiedni stopień polimeryzacji.
Analiza twarzy wykazała, że najliczniej występującymi glukanami są maltoza i wątroba królika, maltoheksaoza w ostrygach i maltoheptaoza w wątrobie bydlęcej. Rozkłady długości łańcuchów glikogenu oczyszczonego z dzikich i zmutowanych szczepów bakterii cyjanobakteryjnych określono za pomocą analizy twarzy. Analizy subtraktywne przeprowadzono poprzez odjęcie procentu każdego DP typu dzikiego od procentu każdego DP mutantów.
Średnie rozkłady długości łańcuchów glikogenu z typu dzikiego i mutantów Synechocystis znormalizowano zgodnie z maksymalnym pikiem obserwowanym dla każdego CLD. Technika ta pozwala lepiej zrozumieć choroby człowieka związane z defektem metabolizmu glikogenu, w szczególności chorobę Andersena, która wynika z akumulacji nieprawidłowych cząstek glikogenu w komórkach.
Przegląd
Ten protokół wykorzystuje technikę Fluoroforemowej Elektroforezy Węglowodanów (FACE) do analizy rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu. Zrozumienie tych parametrów jest kluczowe dla wyjaśnienia strukturalnej organizacji i właściwości cząstek glikogenu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Metabolizm glikogenu
- Techniki elektroforezy
Tło
- Rozkład długości łańcucha łańcuchów glukanów wpływa na właściwości fizyczne i chemiczne glikogenu.
- Intensywność fluorescencji w tej metodzie jest stała, co pozwala na dokładne określenie ilości łańcuchów glukanów.
- Zrozumienie struktury glikogenu jest niezbędne do badania powiązanych zaburzeń metabolicznych.
- Enzymy metabolizujące glikogen odgrywają kluczową rolę w określaniu stopnia polimeryzacji łańcuchów glukanów.
Cel badania
- Określenie rozkładu długości łańcucha i średniej długości łańcucha glikogenu.
- Poprawa zrozumienia strukturalnej organizacji glikogenu.
- Badanie implikacji struktury glikogenu na choroby człowieka, takie jak choroba Andersena.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek glikogenu z określonymi enzymami w kontrolowanych warunkach.
- Oznaczanie fluoforami glukanów do analizy elektroforetycznej.
- Elektroforeza z odwróconą polaryzacją do separacji oznaczonych glukanów.
- Analiza danych poprzez integrację profili elektroferoramów.
Główne wyniki
- Identyfikacja różnych glukanów w oparciu o ich stopień polimeryzacji.
- Wyznaczenie rozkładów długości łańcucha glikogenu z różnych źródeł.
- Analizy subtraktywne ujawniające różnice między odmianami dzikimi a mutantami.
- Wgląd w związek między strukturą glikogenu a zaburzeniami metabolicznymi.
Wnioski
- Technika FACE zapewnia niezawodną metodę analizy struktury glikogenu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia chorób związanych z metabolizmem glikogenu.
- Dalsze badania mogą skupić się na terapeutycznych implikacjach dla zaburzeń związanych z glikogenem.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding glycogen chain length distribution provides critical insights into metabolic disease mechanisms and enzyme function, supporting target validation in glycogen storage disorders. The FACE method enables quantitative assessment of glucan chain populations, which directly influences glycogen solubility and bioavailability—key considerations in preclinical model development. This structural parameter aids in mechanistic de-risking by linking enzyme activity to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies glucan chain length distribution to interrogate therapeutic hypotheses about glycogen branching enzyme function.
- Operational Value: Enables biological de-risking by establishing structure-function relationships between enzyme activity and glycogen particle properties.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating chain length distributions with disease-associated glycogen phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantified chain length distributions for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Generates fluorescence-based readouts proportional to glucan chain count, enabling reliable compound evaluation.
- Reproducibility: Standardized electropherogram integration supports assay scalability and cross-platform consistency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links glycogen structure to human metabolic disorders like Andersen's disease through abnormal chain length distributions.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase enzyme assays to preclinical validation via measurable structural endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying structural deviations in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The FACE method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing structural readouts that inform enzyme mechanism and disease relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of glycogen metabolizing enzymes by measuring degree of polymerization changes.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized chain length distribution profiles for compound library evaluation.
- Analytics: Provides electropherogram integration data and chain length percentage outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects enzyme mechanism to preclinical outcomes via disease-relevant glycogen structural alterations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for glycogen structure analysis across multiple disease models and enzyme targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycogen metabolism pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fluorescence intensity proportionality to glucan chain count.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on structural biomarkers.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through quantitative chain length distribution comparisons between wild-type and mutant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate electrophoresis and fluorophore labeling techniques.
- Depends on capillary electrophoresis instrumentation with reverse polarity capability and detection systems for fluorescent compounds.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, enzyme incubation, and electropherogram integration protocols.
- Involves adaptation considerations for different glycogen sources (e.g., bacterial, mammalian) and enzyme conditions.
- Limited by the need for protected reaction conditions to prevent moisture interference during sample preparation.
