Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Metoda ta zapewnia lepsze zrozumienie organizacji strukturalnej cząstek glikogenu. Jest to istotna kwestia, ponieważ o właściwościach fizykochemicznych cząstek glikogenu decyduje populacja łańcuchów glukanowych, tzw. rozkład długości łańcucha. Takich jak rozpuszczalność w wodzie.

Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że fluorescencja jest stała niezależnie od długości łańcucha glukanu. Istnieje tylko jedna cząsteczka APTS związana przez glukan. Zatem intensywność fluorescencji jest wprost proporcjonalna do liczby łańcuchów glukanu.

Pole do wspomaganej elektroforezy kapilarnej jest odpowiednie do rozwiązania medycznego mechanizmu enzymów metabolizujących glikogen. Na przykład możemy określić stopień polimeryzacji łańcuchów glukanu przenoszonych przez enzymy rozgałęziające się na akceptowany glukan. Reakcja musi być przeprowadzona w warunkach.

Dlatego regiony muszą być chronione przed wilgocią. Wymieszaj 200 mikrolitrów 0,5-2 miligramów na mililitr oczyszczonego glikogenu z 200 mikrolitrami 100-octanowego buforu o pH 4,8. Dodaj 2 mikrolitry izoamylazy i 1,5 mikrolitra pullulanazy.

Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 16 godzin w 1,5 mililitrowej probówce. Zatrzymaj reakcje, inkubując w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut.

Wirować przy 16, 100 razy G' przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia i usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Usuń super konserwację za pomocą pipety i przenieś je do nowych probówek z adnotacjami. Po dodaniu kulek żywicy do pustej probówki z mikro-fuge, odsolić supernatanty, dodając równowartość 100 mikrolitrów kulek żywicy anionowymiennej i wymieszać.

Pobrać próbki przez pipetowanie i umieścić je w nowych probówkach z adnotacjami. Próbki należy wysuszyć na zimno. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 20 stopni Celsjusza.

Wysuszone próbki wymieszać z 2 mikrolitrami 1 molowego cyjanoborowodorku sodu i tetrahydrofuranu oraz 2 mikrolitrami 8-amino-3-6 pirenotrisulfonowego kwasu. Inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 16 godzin w ciemności. Do każdej próbki dodaj 46 mikrolitrów ultra czystej wody.

Aby rozcieńczyć próbki 50 razy, dodaj jeden mikrolitr próbki do 49 mikrolitrów ultra czystej wody w 100 mikrolitrach mikrofiolek. W wirze dokładnie wymieszać. Umieść próbki w ciemności na 5 do 10 minut, jednocześnie ustawiając twarz.

Aby wykonać elektroforezę z odwrotną polaryzacją, ustaw metodę, ustaw ciśnienie wtrysku na 0,5 funta siły na cal kwadratowy. Następnie ustaw polaryzację na tryb odwrotny w celu separacji. Rozcieńczyć bufor do separacji węglowodanów sprzężonych z azotem do jednej trzeciej w ultra czystej wodzie.

Przeprowadzić separację glukanów oznaczoną APTS w rozcieńczonym buforze o napięciu 30 kilowoltów w czystej kapilarze z topionej krzemionki. Następnie ustaw czas wtrysku i rozpocznij analizę. Eksportuj pliki ASC i CDF zawierające odpowiednio profil elektroferogramu i dane integracji.

Otwórz plik ASC i narysuj względną jednostkę fluorescencji zgodnie z wykresem czasowym. Otwórz plik CDF. Kontynuuj pierwszą automatyczną integrację i dostosuj następujące parametry z całkowaniem między dolinami i minimalną powierzchnią.

Ręcznie sprawdź i skoryguj wszelkie nieprawidłowe zdarzenia integracyjne. Sygnały fluorescencyjne zaobserwowane między 4,13 a 4,67 minuty pochodziły z nieprzereagowanych APTS. Czas aleucki oznaczania Maltohexaose DP 6 oszacowano na 8,49 minuty.

Glukany glikogenu bydlęcego znakowane APTS zidentyfikowano na podstawie czasu aleuckiego DP 6. Nie wykryto śladów wolnego maltooligosacharydu w próbce kontrolnej, w której glikogen nie był inkubowany z enzymami rozgałęziającymi. Panel wpuszczany pokazuje separację łańcuchów Glucan do 44 DP. Rozkład długości łańcucha jest pokazany jako procent DP dla każdego DP. Średnią długość łańcucha obliczono, sumując każdy procentowy łańcuch razy odpowiedni stopień polimeryzacji.

Analiza twarzy wykazała, że najliczniej występującymi glukanami są maltoza i wątroba królika, maltoheksaoza w ostrygach i maltoheptaoza w wątrobie bydlęcej. Rozkłady długości łańcuchów glikogenu oczyszczonego z dzikich i zmutowanych szczepów bakterii cyjanobakteryjnych określono za pomocą analizy twarzy. Analizy subtraktywne przeprowadzono poprzez odjęcie procentu każdego DP typu dzikiego od procentu każdego DP mutantów.

Średnie rozkłady długości łańcuchów glikogenu z typu dzikiego i mutantów Synechocystis znormalizowano zgodnie z maksymalnym pikiem obserwowanym dla każdego CLD. Technika ta pozwala lepiej zrozumieć choroby człowieka związane z defektem metabolizmu glikogenu, w szczególności chorobę Andersena, która wynika z akumulacji nieprawidłowych cząstek glikogenu w komórkach.