Name: Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę diagnostyki SARS-CoV-2 z próbek śliny przy użyciu RT-qPCR i robotów do pipetowania typu open source. To skalowalne rozwiązanie umożliwia przeprowadzanie tysięcy testów dziennie bez konieczności ekstrakcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują administracji Clemson, personelowi medycznemu i pracownikom laboratorium klinicznego w laboratorium REDDI, którzy pomogli wdrożyć i zarządzać testami SARS-CoV-2. Dziękujemy dr Phillipowi Buckhaultsowi i dr Carolyn Bannister z Uniwersytetu Południowej Karoliny za wstępne doradztwo projektowe i kontakty branżowe w zakresie zaopatrzenia w sprzęt. Dziękujemy wielu studentom, profesorom i pracownikom za pomoc w pobraniu próbek. Dziękujemy studentom Creative Inquiry za zbieranie danych dotyczących krzywych standardowych. Fundusze na to badanie zostały otrzymane z P20GM121342 grantowego National Institutes of Health (przyznanego DD i LGP), Clemson Athletic Department, wiceprezydenta ds. badań Uniwersytetu Clemson oraz Gubernatora Karoliny Południowej i Wspólnego Komitetu ds. Przeglądu Obligacji.

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z Clemson University i Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, July 1, 2020).
1. Konfiguracja robota do obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym
<ol>
	<li>Zainstaluj wysokowydajne moduły filtrów cząstek stałych (HEPA) (patrz tabela materiałów) na górze każdego robota do obsługi cieczy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Podłącz 8-kanałową pipetę P20 do lewego mocowania robota(ów) przygotowującego płytkę do mieszania zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Podłącz pipetę P20 do prawego uchwytu robota (robotów) ładującego próbkę zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Pobierz niestandardowe skrypty języka Python (plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2) na odpowiednich komputerach.</li>
	<li>Otwórz TigerSaliva Full 384 Loading.py w aplikacji komputerowej na przykładowych komputerach robotów. Kliknij przycisk Kalibruj i skonfiguruj zarówno pipetę, jak i program zgodnie ze wskazówkami oprogramowania.</li>
	<li>Otwórz 12 Full Plates.py w aplikacji komputerowej na komputerze robota master mix. Kliknij przycisk Kalibruj i skonfiguruj zarówno pipetę, jak i program zgodnie ze wskazówkami oprogramowania.</li>
	<li>Drukuj niestandardowe stojaki na próbki za pomocą trójwymiarowej drukarki (3D) do modelowania osadzania topionego przy użyciu pliku projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Drukuj 16 stojaków na jednego robota ładującego próbki, dla dwóch zestawów po osiem stojaków.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 20-krotnego multipleksu N1+P1 sonda/starter mix
<ol>
	<li>Przygotuj partię 20-krotnej mieszaniny sondy N1 + P1 z multipleksem N1 / starterem (całkowita objętość 20 ml, tabela 1) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w sterylnym środowisku z dala od syntetycznego RNA SARS-CoV-2 lub próbek pacjentów.</li>
	<li>Porcję 1,6 ml mieszaniny za pomocą pipety serologicznej umieścić w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 2,0 ml i odpowiednio oznaczyć.</li>
	<li>Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mieszanki kontroli pozytywnej
UWAGA: Mieszanka kontroli pozytywnej nie powinna być przygotowywana w tym samym sterylnym środowisku, co mieszanina sonda/starter lub inne składniki mieszanki wzorcowej. Należy użyć oddzielnego pojemnika z wodą wolną od nukleaz.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć syntetyczny RNA (N1) SARS-CoV-2 od 1 000 000 kopii genów/μl (cpμ) do 10 000 cpμ, dodając 10 μl roztworu podstawowego do 990 μl wody wolnej od nukleaz. Podać 25 μl 10 000 cpμ do sterylnych probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Niewykorzystane porcje należy przechowywać w temperaturze -80°C. 
	UWAGA: Syntetyczne RNA musi być przechowywane w temperaturze -80°C, aby zapobiec degradacji.</li>
	<li>Rozcieńczyć Hs_RPP30 syntetycznym DNA (P1) od 200 000 cpμ do 10 000 cpμ, dodając 50 μl roztworu podstawowego do 950 μl wody wolnej od nukleaz. Podać 25 μl 10 000 cpμ do sterylnych probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Niewykorzystane podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdy składnik do końcowego stężenia 200 cpμ, dodając 20 μl zarówno SARS-CoV-2, jak i Hs_RPP30 10 000 cpμ do 960 μl wody wolnej od nukleaz, co daje w sumie 1000 μl. Podwielokrotność 20 μl zmieszanej kontroli pozytywnej 200 cpμ do probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Przechowywać porcje w temperaturze -80°C do momentu przygotowania do użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytek z mieszanką główną
UWAGA: Przygotuj mieszankę wzorcową w sterylnym środowisku, z dala od syntetycznego RNA SARS-CoV-2 lub próbek pacjentów. Wszystkie składniki muszą być całkowicie rozmrożone przed dodaniem do mieszanki; Bez odpowiedniego rozmrożenia stężenia mogą być nieprawidłowe. Na nieodpowiednie rozmrażanie wskazuje obecność lodu lub nierównomierny kolor odczynników. Przechowywać na bloku zamrażarki podczas przygotowywania mieszanki.
<ol>
	<li>Przygotować partię multipleksowej mieszanki wzorcowej (całkowita objętość 48 ml, tabela 2) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Homogenizować mieszaninę, obracając probówkę 3 razy. Nie mieszać przez pipetowanie w górę i w dół ani wirowanie, ponieważ może to spowodować uszkodzenie enzymu.</li>
	<li>Napełnij kolumny 1-4 sterylnego 96-dołkowego zbiornika głębinowego, przenosząc 1,48 ml mieszanki głównej do każdej studzienki. Jeden stożkowy o pojemności 50 ml wypełnia cztery kolumny, co wystarcza na 12 płytek.</li>
	<li>Przykryj zbiornik studni głębinowej uszczelką foliową i umieść go w dedykowanym robocie do obsługi cieczy master mix. Umieść napełniony zbiornik głębinowy na pokładzie 10, umieść sześć pustych płytek 384-dołkowych na pokładach 1-6, a skrzynkę na końcówki P20 na pokładzie 11. Odsłoń płytkę głębinową i pudełka na końcówki, a następnie zamknij robota.</li>
	<li>Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk Start Run (Uruchom uruchom) w aplikacji komputerowej robota.</li>
	<li>Po 40 minutach bieg zostanie wstrzymany. Przykryj napełnione płytki 384-dołkowe uszczelkami foliowymi, gdy pozostają w robocie i dociśnij rolką, aby zapewnić przyczepność. Oznacz krawędź każdej tabliczki identyfikatorem partii.</li>
	<li>Umieść sześć nowych pustych płytek 384-dołkowych na pokładach 1-6 i wznów protokół operacyjny, klikając przycisk Wznów bieg. Po zakończeniu cyklu przykryj ostatni zestaw 384 płytek dołkowych uszczelkami foliowymi.</li>
	<li>Odpipetować 2 μl pozostałej mieszanki wzorcowej do kolumn 1-3 i 22-24 pustej płytki 384-dołkowej w celu kontroli jakości partii. Uszczelnić optycznie przezroczystą uszczelką i uruchomić na termocyklerze (rozdział 10.1-10.2). Jeśli którakolwiek ze studni ma wartości progowe cyklu N1 (Ct) lub jeśli więcej niż 10 studzienek ma wartości P1 Ct, partia jest zanieczyszczona i nie może być użyta.</li>
	<li>Przygotowane płytki wzorcowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 7 dni od przygotowania.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek, pobieranie i obróbka cieplna
<ol>
	<li>Poinstruuj uczestników, aby unikali jedzenia, picia, palenia tytoniu lub dbania o higienę jamy ustnej na 30 minut przed pobraniem śliny. Poinstruuj uczestników, aby zebrali co najmniej 1 ml śliny, która naturalnie gromadzi się w jamie ustnej i umieścili ją w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml bez konserwantów, a następnie zakryli probówkę (plik uzupełniający 3).</li>
	<li>Odkaż zewnętrzną stronę probówek do pobierania śliny za pomocą 70% etanolu lub chusteczek dezynfekujących i przenieś je do laboratorium w celu przetestowania.</li>
	<li>Rejestruj przybycie próbki, skanując każdy kod kreskowy próbki do arkusza kalkulacyjnego dziennego spożycia (plik uzupełniający 4).</li>
	<li>Zeskanowane próbki poddawać obróbce cieplnej przez 30 minut w piecu o temperaturze 95 °C. Próbki należy usuwać w rękawicach żaroodpornych. 
	UWAGA: Próbki niepoddane działaniu substancji są stabilne w temperaturze pokojowej (23 °C) przez okres do 72 godzin. Po poddaniu ich obróbce cieplnej próbki muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C, jeżeli nie są natychmiast przetwarzane.</li>
</ol>
6. Przykładowe zadanie
<ol>
	<li>Otwórz arkusze kalkulacyjne codziennego ładowania próbek dla każdego robota ładującego próbki (plik uzupełniający 5) na komputerze w stacji przypisywania próbek.</li>
	<li>Przypisz 188 próbek do każdej płytki 384-dołkowej w następujący sposób: Próbki 1-48 są uważane za kwartał 1, próbki 49-96 są uważane za kwartał 2, próbki 97-144 są uważane za kwartał 3, a próbki 145-188 są uważane za kwartał 4. Próbki są analizowane w dwóch egzemplarzach.</li>
	<li>Tace na etykiety z nazwą tabliczki, datą i numerem kwartału. Zeskanuj próbki w kolejności do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbek. 
	UWAGA: Próbki z wcześniejszych płytek mogą wymagać ręcznego uruchomienia, zgodnie z definicją w Rysunek 3. Patrz sekcje 8.1-8.3, aby zapoznać się z instrukcjami ręcznego przypisywania i ładowania próbek.</li>
</ol>
7. Obsługa robotów ładujących próbki
<ol>
	<li>Na stacji ładowania próbek ustaw dwa pełne zestawy ośmiu wydrukowanych w 3D stojaków odpowiadających umieszczeniu pokładu w robocie.</li>
	<li>Odkręć ćwiartkę 1 probówki i umieść w stojakach wydrukowanych w 3D, zaczynając od pozycji A1 w stojaku 1. Wypełnij każdy kosz od lewej do prawej i od góry do dołu. Kontynuuj ten schemat ładowania w stojaku 2, a następnie przejdź do stojaków 4 i 5 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Regały nie są numerowane kolejno ze względu na parametry programu robota.</li>
	<li>Umieść załadowane stojaki na próbki ćwiartki 1 na pokładach 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Umieść końcówki P20 na pokładach 3 i 9. Aby uprościć proces konfiguracji, załaduj materiały od tyłu do przodu do robota.</li>
	<li>Wziąć gotową płytkę wzorcową z temperatury 4 °C, oznaczyć ją nazwą płytki i ostrym ostrzem przeciąć linię w folii wokół studzienek kontrolnych (N23/24, O23/24 i P23/24).</li>
	<li>Umieścić płytkę mieszającą na pokładzie 6 i zdjąć foliową pokrywę, pozostawiając mały prostokąt zakrywający studzienki kontrolne. Otwórz pudełka z końcówkami i zamknij robota.</li>
	<li>Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk Uruchom uruchom za pomocą aplikacji komputerowej robota. Każda ćwiartka ładuje się na talerz w 24,5 minuty; Ustaw minutnik jako przypomnienie.</li>
	<li>Podczas pracy robota odkręć i załaduj ćwierć 2 probówek z próbkami do drugiego zestawu stojaków wydrukowanych w 3D, jak opisano w sekcji 7.2.</li>
	<li>Gdy robot zatrzyma się, wyjmij stojaki ćwiartka 1 i zastąp je stojakami ćwiartka 2. Kliknij przycisk Wznów uruchamianie w aplikacji komputerowej.</li>
	<li>Uzupełnij probówki z ćwiartką 1 i przechowuj je w lodówce o temperaturze 4 °C w oczekiwaniu na wyniki. 
	Powtórz ten proces ładowania dla ćwiartek 3 i 4.</li>
	<li>Przenieś załadowaną płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego. Aby zminimalizować zanieczyszczenie, podczas przenoszenia należy przykryć płytę.</li>
</ol>
8. Ręczne ładowanie próbki
UWAGA: Wykonaj pojedynczy ręczny przebieg na powtarzających się próbkach (N1 Rerun lub Rerun, zobacz Rysunek 3) w przypadku nieodpowiedniego obciążenia robota.
<ol>
	<li>Zebrać wszystkie powtarzające się próbki i przypisać je jako ostatnie próbki w kwartale 4 (patrz sekcja 6.2). Ponumeruj próbki, zeskanuj kody kreskowe i wprowadź oryginalną lokalizację próbki oraz wynik do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbki.</li>
	<li>Przenieść powtórzone próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Nie ładuj probówek z powtarzającymi się próbkami do stojaków załadowczych robota.</li>
	<li>Odpipetować 2 μl każdej powtórzonej próbki do odpowiednich studzienek, postępując zgodnie ze schematem układu płytek (plik uzupełniający 6). Do dodawania próbek pacjenta należy używać przeznaczonej do tego pipety. Studzienki kontrolne należy przykryć folią podczas dodawania próbek, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
</ol>
9. Dodanie kontrolek do płytek testowych
<ol>
	<li>Zdejmij foliową osłonę ze studzienek kontrolnych za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Odpipetować 2 μl wody wolnej od nukleaz (bez kontroli matrycy) do studzienek N23-N24 i 2 μl mieszanej kontroli dodatniej o stężeniu 200 cpμ (patrz sekcja 3) do studzienek O23-O24. Odpipetować 2 μl potwierdzonej dodatniej próbki pacjenta do studzienek M23-M24 jako dodatkową kontrolę. Pozostaw studzienki P23-P24 puste, aby monitorować jakość partii mieszanki głównej.</li>
	<li>Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką i użyj wałka aplikatora, aby przykleić uszczelkę do wszystkich studzienek. Wiruj płytkę z prędkością 2500 obr./min przez 30 sekund, aby dokładnie wymieszać. Odwirować płytkę o masie 500 g przez 1 minutę.</li>
</ol>
10. Wykonywanie RT-qPCR
<ol>
	<li>Utwórz program protokołu w oprogramowaniu termocyklera zgodnie z opisanymi warunkami (Tabela 3). Zachowaj protokół na przyszłe tablice. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i uruchom protokół.</li>
	<li>Wyeksportuj wartości Ct jako plik .xslx i skopiuj je do przykładowego arkusza kalkulacyjnego ładowania (plik uzupełniający 5). 
	UWAGA: Te arkusze zostały zaprojektowane specjalnie dla plików wyjściowych Ct z oprogramowania producenta i mogą wymagać modyfikacji w celu zaakceptowania innych formatów.</li>
</ol>
11. Określanie ważności tabliczki
<ol>
	<li>Należy zatwierdzić zarówno kontrolę dodatnią i/lub znane próbki dodatnie, jak i kontrolę ujemną, aby uznać wyniki płytki za ważne. Oceń studzienki kontrolne według następujących kryteriów.
	<ol>
		<li>W przypadku kontroli dodatniej należy sprawdzić, czy co najmniej jedna studzienka kontroli dodatniej (O23/O24) wytwarza wartości Ct między 22-28 zarówno dla sond P1, jak i N1. Alternatywnie, znane dołki z dodatnimi próbkami (M23/M24) wytwarzają wartości Ct P1 i N1 <33 na sondach P1 i N1.</li>
		<li>W przypadku kontroli ujemnej należy sprawdzić, czy w żadnym z dwóch dołków kontroli ujemnej (N23/N24) nie ma wartości Ct N1 lub P1. Upewnij się, że wartości Ct mają prawidłowe krzywe amplifikacji przed unieważnieniem płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. Interpretacja przykładowych wyników
<ol>
	<li>Określ wynik pacjenta zgodnie z diagramem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) i zgłoś rozdzielone próbki.
	<ol>
		<li>Oceń wynik P1 jako WAŻNY lub NIEWAŻNY. Jeśli P1 daje wynik Ct <33, należy uznać studnię za PRAWIDŁOWĄ i przejść do wyniku z N1. Jeśli P1 daje wynik Ct >=33 lub brak wartości Ct, należy uznać studnię za NIEPRAWIDŁOWĄ.
		<ol>
			<li>Oceń wynik N1 jako TAK, NIE lub NIE*. Jeśli N1 daje wynik Ct <33, dołek ma wartość TAK. Jeśli N1 nie daje wartości Ct, studzienka ma wartość NO. Jeśli N1 wytwarza Ct >=33, studzienka ma wartość NO*. Upewnij się, że wszystkie wartości N1 Ct są powiązane z rzeczywistą krzywą wzmocnienia. Jeśli wartość Ct dla N1 nie ma krzywej wzmocnienia, studzienka ma wartość NO.</li>
			<li>Zidentyfikuj powtarzające się próbki (N1 Rerun lub Rerun), oznacz je wewnętrznym numerem próbki i typem próbki, a następnie zwróć je do procesu ładowania (sekcja 8.1-8.3).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
13. Sprzątanie laboratorium
<ol>
	<li>Roboty do transportu cieczy
	<ol>
		<li>Oczyść wszystkie strony środkiem dezynfekującym pośredniego poziomu. Nie używaj etanolu, ponieważ spowoduje to degradację plastiku.</li>
		<li>Delikatnie przetrzyj końcówkę pipety i kosz na śmieci chusteczką nasączoną alkoholem (70% etanolu lub 100% izopropanolu). Wytrzyj klawiaturę i mysz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szafa bezpieczeństwa biologicznego
	<ol>
		<li>Oczyść wszystkie powierzchnie środkiem dezynfekującym średniego poziomu. Włącz światło UV na 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li>
<li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li>
<li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li>
<li>World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020).</li>
<li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020).</li>
<li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393(2021).</li>
<li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li>
<li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+virology%3A+the+official+publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).</li>
<li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Human+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li>
<li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li>
<li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%3A+The+Official+Publication+of+The+European+Society+of+Clinical+Microbiology+and+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li>
<li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+The+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li>
<li>Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogels%2C+CB+%22Med+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Med (New York, N.Y.)</a>. 2 (3), 263-280 (2021).</li>
<li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li>
<li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-collection%3A+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+The+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).</li>
<li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+the+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).</li>
<li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Network+Open%22%5BJournal%5D)">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).</li>
<li>Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020).</li>
<li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Internet+Research%22%5BJournal%5D)">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).</li>
<li>Villanueva-Cañas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).</li>
<li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020).</li>
<li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%3A+Official+Publication+of+The+European+Society+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li>
<li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SalivaSTAT%3A+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).</li>
<li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li>
<li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Laboratory+Automation%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Public+Health+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).</li>
<li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li>
<li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li>
<li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+salivary+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li>
<li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis%2C+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li>
<li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+The+Official+Publication+of+The+Pan+American+Society+for+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).</li>
<li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).</li>
<li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%3A+IJID%3A+Official+Publication+of+The+International+Society+for+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li>
<li>Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biosafety+and+Biosecurity%22%5BJournal%5D)">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Test opisany w protokole podlega procedurze SalivaDirect EUA złożonej przez Yale School of Public Health.

Test opisany w protokole został oceniony w niezależnym badaniu walidacyjnym. Stwierdzono, że test miał 98,9% swoistości (1,1% fałszywie dodatniej) i 90,0% czułości (10,0% fałszywie ujemnej) w porównaniu z parami wymazów z nosogardzieli pobranych w tym samym czasie (n = 837; 817 ujemnych, 20 dodatnich). Co ważne, trzech uczestników, którzy uzyskali pozytywny wynik testu TigerSaliva i ujemny wynik wymazu z nosogardzieli, zostało ponownie przebadanych wymazami 48 godzin później i uzyskało wyniki dodatnie, co wskazuje, że TigerSaliva może być w stanie wykryć infekcje SARS-CoV-2 wcześniej w przebiegu choroby.
Symulowaliśmy dodatnie próbki śliny, zwiększając ślinę wolną od wirusa (zarówno poddaną obróbce cieplnej, jak i niepoddanej obróbce cieplnej) znanymi stężeniami syntetycznego RNA SARS-CoV-2 i przeprowadziliśmy 10-krotne rozcieńczenie w celu określenia limitu Ct w ślinie. Gen N1 nie był wykrywalny poniżej 10 000 kopii genu (w przybliżeniu Ct = 28) w symulowanych próbkach dodatnich. Podejrzewamy, że jest to spowodowane degradacją RNazy lub innymi czynnikami zakłócającymi. Jednak interakcja RNaz śliny z nagim syntetycznym RNA prawdopodobnie różni się od interakcji z cząsteczkami wirusa, nawet po ich denaturacji przez ciepło. Dodatnie próbki śliny zostały zidentyfikowane za pomocą Ct >30, a zewnętrzne laboratoria uzyskały dane sekwencji genetycznej SARS-CoV-2 z tych próbek. Spekulujemy, że białka wirusowe zapewniają ochronę przed degradacją RNA w próbkach śliny pacjentów.
Najważniejszym krokiem w protokole jest wdrożenie automatyzacji przygotowania mieszanki wzorcowej i przetwarzania próbek śliny (odpowiednio sekcje 4 i 7). Pozwala to na nakładanie się procesów zadań, co drastycznie skraca czas realizacji. Kolejnym krytycznym etapem jest interpretacja wyników klinicznych (punkty 11 i 12). Ustalenie pośrednich kategorii wyników (Rerun i N1 Rerun) również zminimalizowało występowanie niejednoznacznych wyników testów.
Wykazaliśmy, że różnica między ręcznymi i automatycznymi metodami ładowania próbek śliny jest znikoma (Figura 5A) i że automatyzacja może poprawić odtwarzalność wykrywania SARS-CoV-2 (Figura 5B). Automatyzacja powinna być preferowana, aby ułatwić testowanie podczas projektowania i rozbudowy laboratoriów klinicznych25. Usprawnienie pracy w laboratorium następuje dzięki wdrożeniu zadań zautomatyzowanychprzez roboty 26. Możliwości open source robotów do obsługi cieczy pozwalają na implementację niestandardowych skryptów do projektowania protokołów. To sprawia, że roboty do obsługi cieczy są niedrogim i wysoce modyfikowalnym systemem w porównaniu z tradycyjnymi metodami automatyzacji klinicznej. Jest to również idealna strategia do wykonywania wysoce powtarzalnych zadań laboratoryjnych. Wysoki poziom możliwości dostosowania systemu przekłada się na swobodę zmiany sprzętu laboratoryjnego (np. probówek, końcówek do pipet lub płytek 384-dołkowych) w przypadku niedoborów. W związku z tym automatyzacja za pomocą robotów do obsługi cieczy jest opłacalna zarówno w przypadku nadzoru i badań na dużą, jak i małą skalę.
Główną zaletą tej strategii testowania jest znacznie krótszy czas realizacji w porównaniu z innymi laboratoriami klinicznymi. Wykorzystanie zautomatyzowanych robotów do obsługi cieczy odgrywa kluczową rolę w skracaniu czasu realizacji, ale jednoczesne wykorzystanie robotów i termocyklerów ma również zasadnicze znaczenie dla maksymalizacji wydajności testów. Jeden robot i termocykler powinny być obsługiwane jako para, przy czym obie maszyny są używane w tandemie do nieprzerwanego ładowania próbki i analizy wyników próbek. Po ustaleniu stałego przepływu przypisanych próbek, wszystkie pary maszyn mogą być obsługiwane jednocześnie. Stałe jednoczesne korzystanie z robotów i termocyklerów drastycznie zwiększa zdolność i wydajność testowania, co ma kluczowe znaczenie dla dostosowania się do dużej liczby testów.
W przeciwieństwie do innych uznanych protokołów SARS-CoV-2 RT-qPCR, w protokole termocyklera uwzględniliśmy krok przyziemienia, aby poprawić wyżarzanie zestawów sondy i starterów do docelowych genów27, zmniejszając ryzyko nieudanej amplifikacji. Wyniki wykazały, że przyziemienie poprawiło wykrywanie próbek dodatnich bez ryzyka utraty specyficznego wiązania starterów (Tabela 4). Ustaliliśmy, że szeroki zakres zarówno kopii RNA SARS-CoV-2 (Figura 4A), jak i Hs_RPP30 kopii DNA (Figura 4B) można jednocześnie wykryć za pomocą testu RT-qPCR.
Jednym z ograniczeń robotów do obsługi cieczy jest możliwość zanieczyszczenia krzyżowego z dodatnich próbek podczas przenoszenia śliny. Ślina jest płynem lepkosprężystym28 i po dozowaniu z końcówki pipety może przechodzić przez sąsiednie studzienki. Ponadto niejednorodność śliny29 może powodować nierównomierne rozmieszczenie cząstek wirusa w całej próbce. Zwiększa to prawdopodobieństwo wystąpienia zarówno wyników fałszywie dodatnich, jak i ujemnych, co wymaga wyznaczenia próbek N1 Rerun i Rerun. Jednak 14,1% próbek początkowo oznaczonych jako N1 Rerun zostało rozpoznanych jako pozytywne dla SARS-CoV-2 i było ponad 30 razy bardziej prawdopodobne, że po ponownym przetestowaniu ustąpi jako pozytywne niż próbki Rerun. W związku z tym odróżnienie Rerun od N1 Rerun (ryc. 3) pozwoliło na dokładniejsze oddzielenie potencjalnie dodatnich próbek, zwiększając czułość i swoistość naszego testu diagnostycznego. Inne parametry wynikowe do diagnostycznego badania śliny nie dokonały tego rozróżnienia 12,14,24,30,31.
Próbki śliny mogą być trudne do pipetowania ze względu na niejednorodność i lepkość32. Obróbka cieplna odpowiednio denaturuje białka w biomatrycy śliny, zmniejszając lepkość i eliminując potrzebę stosowania odczynników do ekstrakcji RNA9, których brakowało we wczesnych stadiach pandemii10. Przedłużona obróbka cieplna dezaktywuje również obecne wirusy33, co pozwala na przetwarzanie laboratoryjne przy niższych poziomach bezpieczeństwa biologicznego. W związku z tym zastosowano ekstrakcję RNA na bazie ciepła (opisaną w sekcji 5.4) w celu zmniejszenia lepkości poprzez denaturację białek (ryc. 6). Na podstawie uzyskanych wyników postulujemy, że obróbka cieplna może również homogenizować próbki śliny, a także denaturować biomatrycę białkową. Inne grupy łączyły obróbkę cieplną i obróbkę proteinazą K w celu zwiększenia jednorodności 9,14,34. Zdecydowaliśmy się nie wdrażać tego kroku, ponieważ może to spowodować denaturację białek wirionowych w tempie, które pozostawia wirusowe RNA narażone na degradację cieplną35. Ponadto rozcieńczenie próbki proteinazą K może zamaskować próbki dodatnie zawierające mniej cząstek wirusa, zmniejszając w ten sposób czułość. Ponadto wyniki testu porównano z dostępnym na rynku testem SARS-CoV-2 na bazie śliny (Logix Smart COVID-19), który wykorzystuje ekstrakcję RNA z kulkami magnetycznymi (Tabela 5). Stwierdzono, że obecny test lepiej nadaje się do wykrywania słabych próbek dodatnich w porównaniu z testem dostępnym na rynku.
Trudno jest określić ilościowo liczbę kopii wirusa w ślinie przy użyciu tylko RT-qPCR, ponieważ qPCR jest półilościowy. Istnieje nieodłączna zmienność między wartościami Ct, która wynika z ograniczeń technicznych. Liczba kopii genu może być określona na podstawie wartości Ct (ryc. 4) i jest w przybliżeniu równoważna liczbie kopii wirusa. Jednym z możliwych rozwiązań pozwalających określić liczbę kopii wirusa w próbkach śliny jest ddPCR, który zapewnia twardą kwantyfikację kopii genów w reakcji. Uważamy jednak, że jest to wystarczające, aby zapewnić klinicystom wyniki jakościowe, a względną zawartość wirusa można porównać w próbkach przetworzonych naszymi metodami.
Pomimo pewnych ograniczeń, które pojawiają się podczas stosowania śliny, test SARS-CoV-2 metodą RT-qPCR na bazie śliny okazuje się skuteczną metodą szybkiego i niezawodnego wykrywania wirusowego RNA w dowolnej skali testów. Jest to szczególnie ważne w połączeniu z wykorzystaniem systemów obsługi cieczy typu open source. To podejście testowe można zmodyfikować w celu wykrycia innych sekwencji kwasów nukleinowych istotnych dla diagnostyki, takich jak czynniki chorób zakaźnych, markery choroby lub inne wirusy. To sprawia, że test ma zastosowanie zarówno w klinicznych, jak i badawczych wysiłkach diagnostycznych.

Koronawirus związany z zespołem ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej-2 (SARS-CoV-2), nowy koronawirus, pojawił się pod koniec 2019 roku i szybko rozprzestrzenił się w populacjach na całym świecie1. Zakażenie SARS-CoV-2 powoduje chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19), wysoce zaraźliwą chorobę z potencjalnie ciężkimi objawami ze strony układu oddechowego i zapalnego. Wysoka zdolność przenoszenia się w połączeniu z niską śmiertelnością wskazywała, że wirus szybko rozprzestrzeni się w populacjach i będzie wymagał zwiększonej liczby testów diagnostycznych2,3. Zalecenia dotyczące zdrowia publicznego zachęcały do szeroko zakrojonych badań przesiewowych populacji w celu odizolowania przypadków, a następnie zmniejszenia szybkości transmisji4,5,6. Co więcej, modele nadzoru populacji wykazały, że zwiększenie częstotliwości testów i skrócenie czasu raportowania miało większy wpływ na zmniejszenie transmisji niż zwiększenie czułości testu7. Jest to prawdopodobne dlatego, że zakażone osoby mogą zostać poddane kwarantannie wcześniej, przerywając w ten sposób łańcuchy infekcji.
Pierwotnym standardem testowania amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) były wymazy z nosogardzieli (NP) przetworzone przez RT-qPCR8. Jednak w przypadku tej formy testowania dla bardzo dużych populacji pojawiają się komplikacje, takie jak zwiększony koszt względny i zwiększona presja w łańcuchu dostaw9,10. Co więcej, zarówno pobieranie próbek, jak i przetwarzanie popularnych metod NAAT (w tym wymazów NP, wymazów z jamy ustnej i gardła, wymazów ze środkowej małżowiny usznej i wymazów z nosa) zależy od specjalistycznego sprzętu, odczynników i personelu medycznego9,10.
Odpowiednim substytutem testu RT-qPCR z wymazu NP jest badanie na podstawie śliny, które jest dokładnym narzędziem diagnostycznym do wykrywania SARS-CoV-211,12,13,14. Bezpośrednie wykonanie RT-qPCR na próbkach śliny daje podobną czułość i swoistość jak wymazy NPs15. Jedną z głównych zalet badania śliny w porównaniu z testami wymazów NP jest to, że pozwala na samodzielne pobieranie próbek16. Minimalizuje to potrzebę zatrudniania personelu medycznego i maksymalizuje łatwość pobierania próbek dla pacjentów, ponieważ jest mniej inwazyjne niż wymazy NP. Dodatkowo, ponieważ próbki śliny nie wymagają do usunięcia próbki z wymazówki (jak w przypadku próbek NP), testy oparte na ślinie mogą bezpośrednio wykorzystywać ekstrakcję kwasem rybonukleinowym (RNA) na bazie ciepła, co zmniejsza koszty testowania, eliminując potrzebę stosowania dodatkowych, pożywek transportowych i/lub odczynników do ekstrakcji RNA14,17.
Laboratorium Badań i Edukacji w Diagnostyce i Interwencji Chorób (REDDI) Uniwersytetu Clemson zostało założone w celu zaspokojenia potrzeb uniwersytetu w zakresie testów i nadzoru nad COVID-19. W zamkniętych populacjach, w tym na uniwersytetach, częste testy kontrolne w połączeniu z dystansem społecznym przyniosły najkorzystniejsze wyniki w epidemiologicznych modelach występowania choroby18. Dostosowano skonsolidowane protokoły CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 i SalivaDirect14, a w klinicznym przepływie pracy wykorzystano automatyzację, aby obniżyć koszty i skrócić czas realizacji. Poprzednie grupy używały robotów do obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do etapów ekstrakcji RNA SARS-CoV-220,21, ale zmaksymalizowaliśmy wykorzystanie robotów do przygotowania płytek testowych i obciążenia próbek22. Tutaj pokazujemy, że dostosowany protokół i wykorzystanie systemów obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) pozwala na szybki i dokładny RT-qPCR oparty na ślinie i jest skuteczną strategią nadzoru zdrowia publicznego na dużą skalę.

<table><tbody><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>20 uL filtrowane końcówki do pipet Końcówki</td><td></td><td>Opentrons</td><td>20uL 2mL</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-666-313</td><td>Można użyć alternatywnego produktu</td></tr><tr><td>Armadillo PCR Plate, 384-dołkowa, przezroczysta, biała studzienka</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB3384</td><td>Można użyć alternatywnego produktu</td></tr><tr><td>Celltreat 2 ml 96 płytek głębinowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-828-743</td><td>Do przygotowania mastermixu</td></tr><tr><td>Przezroczyste arkusze uszczelniające PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td>Można użyć alternatywnego produktu</td></tr><tr><td>DPEC Uzdatniona woda</td><td>Ambion (Thermo Scientific)</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Flip Cap 50 ml Rurki stożkowe</td><td>VWR</td><td>75845-210</td><td>Do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Foliowe arkusze</td> <td>uszczelniające PCRThermo Scientific</td><td>AB0626</td><td>Do przechowywania płytek mastermix można użyć alternatywnego produktu</td></tr><tr><td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>299788131</td><td>P1 kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Luna Buffer Probe Jednoetapowa reakcja</td><td>New England Biolabs</td><td>M3006B</td><td></td></tr><tr><td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M3002B</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>10006830</td><td></td></tr><tr><td>nCOV_N1 Sonda Aliquot, 50 nmol</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>10006832</td><td>Sonda może być syntetyzowana przez innych dostawców z fluoforami SYBR lub FAM</td></tr><tr><td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>10006831</td><td></td></tr><tr><td>Moduł filtra HEPA</td><td>Opentron</td><td>N/A</td><td>Nie jest wymagany, ale przydatny do redukcji zanieczyszczenie</td></tr><tr><td>Przystawka wielokanałowa Opentron, P20</td><td>Opentrons</td><td>999-00005</td><td>Do przygotowania mastermixu</td></tr><tr><td>Robot do obsługi cieczy Opentron OT-2</td><td></td> Przystawka do pipet Opentron <td>OT-2</td><td></td></tr>, <tr><td>P20</td><td>Opentrons</td><td>999-0000215</td><td>Do ładowania próbek</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Memmert</td><td>UF450 PLUS 208V-3PH</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR (bez rnazy, dnazy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-225</td><td>Do porcji kontroli dodatnich i ujemnych</td></tr><tr><td>Aluminiowy blok chłodzący PolarSafe, 15-dołkowy (probówki 1,5/2,0 mL)</td><td>VWR</td><td>10808-952</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy blok chłodzący PolarSaf, 24-dołkowe (probówki 0,5 ml)</td><td>VWR</td><td>10808-956</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAzy P (ATTO 647), 50 nmol</td><td>Zintegrowane technologie DNA 10007062</td><td></td><td>Sonda może być syntetyzowana przez innych dostawców za pomocą Cy5 Starter do</td></tr><tr><td>przodu fluoroforowego RNAzy, zintegrowane technologie DNA 100 nmol</td><td></td><td>10006836</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony starter RNAzy P, 100 nmol</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>10006837</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola syntetycznego RNA Sars-CoV-2 2</td><td>Twist Biosciences</td><td>102024 / 103907 / 103909</td><td>N1 Skanery kontroli pozytywnej</td></tr><tr><td></td><td>Kod</td><td>CR1500</td><td>Wymagane tylko podczas skalowania w górę</td></tr><tr><td>Mały kaptur z filtrem HEPA</td><td>Erlab</td><td>Captair Bio 321</td><td>Do przygotowania mastermixu</td></tr><tr><td>Termocykler CFX384 Touch</td><td>Biorad</td><td>CFX384 Touch</td><td>Można stosować alternatywne modele, np. CFX384 Opus</td></tr><tr><td>X-acto Knife Set</td><td>Staples</td><td>N/A</td><td>Do cięcia folii do przykrywania studzienek kontrolnych</td></tr></tbody></table>

skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą pcr z odwrotną transkryptazą sars-cov-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Pojawienie się niedawnego globalnego kryzysu zdrowotnego związanego z SARS-CoV-2 wprowadziło kluczowe wyzwania dla badań epidemiologicznych i testów klinicznych. Charakteryzująca się wysokim wskaźnikiem transmisji i niską śmiertelnością pandemia COVID-19 wymusiła dokładne i skuteczne testy diagnostyczne, szczególnie w populacjach zamkniętych, takich jak uniwersytety z internatem. Początkowa dostępność testów kwasów nukleinowych, takich jak wymazy z nosogardzieli, była ograniczona ze względu na presję w łańcuchu dostaw, która również opóźniała raportowanie wyników testów. Wykazano, że ilościowe badanie reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-qPCR) na podstawie śliny jest porównywalne pod względem czułości i swoistości z innymi metodami testowania, a pobieranie śliny jest mniej inwazyjne fizycznie dla uczestników. W związku z tym opracowaliśmy multipleksowy test diagnostyczny RT-qPCR do nadzoru populacji Uniwersytetu Clemson i otaczającej społeczności. W teście wykorzystano roboty do obsługi cieczy i termocyklery typu open source zamiast złożonych systemów automatyzacji klinicznej, aby zoptymalizować przepływ pracy i elastyczność systemu. Automatyzacja RT-qPCR na podstawie śliny umożliwia szybkie i dokładne wykrywanie szerokiego zakresu stężeń wirusowego RNA zarówno w przypadku testów na dużą, jak i małą skalę. Średni czas realizacji zautomatyzowanego systemu wynosił < 9 godzin dla 95% próbek i < 24 godziny dla 99% próbek. Koszt pojedynczego testu wynosił 2,80 USD, gdy wszystkie odczynniki zostały zakupione w ilościach hurtowych.

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Opracowaliśmy tani test diagnostyczny COVID 19 oparty na ślinie i przepływ pracy, który jest łatwy do wdrożenia i skalowania do zastosowań przesiewowych na dużą skalę. W tym przypadku używamy robotów do obsługi cieczy typu open source, standardowych termocyklerów i oprogramowania do wykonywania bezpośrednich testów śliny bez ekstrakcyjnych lub stabilizacyjnych, zapewniając jednocześnie dokładne wyniki diagnostyczne. Ze względu na proste, zautomatyzowane, równoległe przepływy pracy, system można skalować w górę w celu wykonywania tysięcy testów dziennie przy minimalnych wymaganiach sprzętowych, przestrzennych i personelu.Oprócz Kylie King, Rachel Ham, nasza kierowniczka laboratorium klinicznego i Austin Smothers, nasz koordynator ds. edukacji, pomogą zademonstrować procedurę Zacznij od odkażenia zewnętrznej strony probówek do pobierania śliny za pomocą 70% etanolu i przeniesienia ich do laboratorium w celu przetestowania. Zapisz przybycie próbki, skanując każdy kod kreskowy próbki do arkusza kalkulacyjnego dziennego poboru. Skanowane próbki należy poddać obróbce cieplnej przez 30 minut w piecu o temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie usunąć próbki za pomocą rękawic żaroodpornych.Otwórz arkusze kalkulacyjne codziennego ładowania próbek dla każdego robota ładującego próbki na stacji przypisywania próbek. Następnie przypisz 188 próbek do każdej płytki 384-dołkowej. Tace na etykiety z nazwą tabliczki, datą i numerem kwartału.Zeskanuj próbki w kolejności do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbek. Na stacji ładowania próbek ustaw dwa pełne zestawy ośmiu wydrukowanych w 3D stojaków, odpowiadających umieszczeniu pokładu w robocie. Odkręć ćwiartkę jednej probówki i umieść je w stojakach wydrukowanych w 3D, zaczynając od pozycji A1 w stojaku pierwszym.Wypełnij każdy kosz od lewej do prawej i od góry do dołu. Kontynuuj ten schemat ładowania w stojaku drugim, a następnie przejdź do stojaków czwartego i piątego. Umieść załadowane stojaki na próbki ćwiartki pierwszej na pokładzie pierwszym, drugim, czwartym, piątym, siódmym, ósmym, 10, 11.Umieść końcówki P20 na pokładzie trzecim i dziewiątym. Aby uprościć proces konfiguracji, załaduj materiały od tyłu do przodu do robota. Płyty master mix są produkowane na dedykowanym robocie i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Jednorazowo używana jest jedna tabliczka, która jest oznaczona nazwą tabliczki, a ostre ostrze służy do wycinania linii w folii wokół studzienek kontrolnych. Umieścić główną płytkę mieszającą na pokładzie szóstym i zdjąć foliową pokrywę, pozostawiając mały prostokąt zakrywający studzienki kontrolne. Otwórz pudełka z końcówkami i zamknij robota.Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk start uruchom w aplikacji komputerowej robota. Każda ćwiartka ładuje się na talerz w ciągu 24,5 minuty. Ustaw minutnik jako przypomnienie.Podczas pracy robota odkręć i załaduj ćwiartkę dwóch probówek z próbkami do drugiego zestawu stojaków wydrukowanych w 3D. Gdy robot zatrzyma się, usuń ćwiartkę pierwszej szafy i zastąp je ćwiartką dwiema szafami, a następnie kliknij wznów uruchamianie w aplikacji komputerowej. Uzupełnij ćwiartkę pierwszej probówki z próbkami i przechowuj je w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w oczekiwaniu na wyniki.Powtórz ten proces ładowania dla kwadransów trzeciego i czwartego. Przenieś załadowaną płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Aby zminimalizować zanieczyszczenie, należy przykryć płytkę podczas przenoszenia.Zbierz dowolne powtarzające się próbki i przypisz je jako ostatnie próbki w czwartej ćwiartce. Ponumeruj próbki, zeskanuj kody kreskowe i wprowadź oryginalną lokalizację próbki oraz wynik do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbki. Przenieś powtórzone próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego.Nie ładuj probówek z powtarzającymi się próbkami do stojaków załadowczych robota. Odpipetować dwa mikrolitry każdej powtórzonej próbki do odpowiednich studzienek. Do dodawania próbek pacjenta należy używać przeznaczonej do tego pipety.Podczas dodawania próbek należy przykryć studzienki kontrolne folią, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Zdejmij foliową osłonę ze studzienek kontrolnych za pomocą kleszczy. Pobrać pipety z dwóch mikrolitrów potwierdzonych dodatnich próbek pacjenta do studzienek M23 i M24.Odmierzyć pipetą dwa mikrolitry wody wolnej od nukleaz do studzienek N23 do N24 i dwa mikrolitry po 200 kopii na mikrolitr zmieszanej kontroli pozytywnej do studzienek O23 do O24. Pozostaw studzienki od P23 do P24 puste, aby monitorować jakość partii mieszanki głównej. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką i użyj wałka aplikatora, aby przykleić uszczelkę do wszystkich studzienek.Wirować płytkę przy 2, 500 obr./min przez 30 sekund, aby dokładnie wymieszać, a następnie odwirować płytkę przy 500 razy G przez jedną minutę. Wybierz program protokołu w oprogramowaniu termocyklera i zapisz protokół na przyszłe płytki. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i uruchom protokół.Wyeksportuj wartości CT i skopiuj je do przykładowego arkusza kalkulacyjnego. W przypadku kontroli dodatniej sprawdź, czy co najmniej jedna studzienka kontroli dodatniej wytwarza wartości CT od 22 do 28 zarówno dla sond P1, jak i N1. Alternatywnie, znane dołki z dodatnimi próbkami wytwarzają wartości CT P1 i N1 mniejsze niż 33 na sondach P1 i N1.W przypadku kontroli ujemnej należy sprawdzić, czy w żadnej z dwóch studzienek kontroli ujemnej nie ma wartości N1 lub P1 CT. Upewnij się, że wartości CT mają prawidłowe krzywe amplifikacji przed unieważnieniem płytki. Jeśli P1 daje wynik CT mniejszy niż 33, należy uznać studnię za ważną i przejść do wyniku z N1. Jeśli P1 daje wynik CT większy lub równy 33 lub brak wartości CT, należy uznać studnię za nieważną.Jeśli N1 daje wynik CT mniejszy niż 33, oceń dobrze jako tak. Jeśli N1 nie daje wartości CT, oceń studnię jako nie. Jeśli N1 daje wartość CT większą lub równą 33, oceń studnię jako brak gwiazdy.Upewnij się, że wszystkie wartości N1 CT są powiązane z rzeczywistą krzywą wzmocnienia. Jeśli wartość CT dla N1 nie ma krzywej wzmocnienia, studnia ma wartość nie. Zidentyfikuj powtarzające się próbki, oznacz je wewnętrznym numerem próbki i typem próbki, a następnie zwróć je do procesu ładowania.Reprezentatywne obrazy pokazują wykrywanie syntetycznego RNA N1 lub SARS CoV-2 metodą RTQ PCR oraz syntetycznego DNA P1 lub HSRPP30. Krzywe standardowe zostały wykreślone z odchyleniami standardowymi w celu określenia zakresu dokładnej detekcji przy użyciu tej kombinacji starterów sondy. Średnie wartości CT uzyskane w odpowiednich rozcieńczeniach zestawiono z szacowaną ilością syntetycznego RNA i syntetycznego DNA.W obu przypadkach krzywe liniowe wykazały dobre współczynniki korelacji w szerokim zakresie stężeń kopii genów. Wartości N1 CT uzyskane z unikalnych próbek przy użyciu zarówno robota, jak i ręcznego ładowania próbek przetransponowano w celu określenia zmienności między testami między ładowaniem ręcznym a robotem. Liniowa zależność między metodami ręcznymi i automatycznymi pozwoliła uzyskać wysoki współczynnik korelacji, co wskazuje, że obie metody są funkcjonalnie równoważne.Zmienność w teście wewnętrznym określono również za pomocą transponowanych replikacyjnych wartości N1 CT uzyskanych zarówno z robota, jak i ręcznego ładowania próbki. Ocena metod obróbki cieplnej w celu zmniejszenia lepkości śliny jest pokazana tutaj. Ślinę ujemną dla SARS CoV-2 pobrano z jednego źródła, a podwielokrotności poddano obróbce cieplnej przez zero minut, 30 minut lub 60 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Wartości P1 CT z kontrprób technicznych każdego schorzenia wykreślono w celu określenia zmienności między metodami leczenia. Zarówno 30-minutowa, jak i 60-minutowa metoda obróbki cieplnej spowodowała znacznie zmniejszoną zmienność próbki w porównaniu z brakiem kontroli leczenia. Nie było istotnej różnicy między zabiegami trwającymi 30 i 60 minut.Dlatego wdrożono metodę 30-minutowej obróbki cieplnej w celu skrócenia czasu obróbki. Stosuj odpowiednią technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie płytek testowych, szczególnie podczas ładowania próbek ręcznych i kontroli. Unikaj krzyżowania się po talerzu rękami lub rękawami.Po uzyskaniu wyników klinicznych próbki można wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne lub zachować do dalszej analizy, takiej jak sekwencjonowanie całego genomu w celu określenia określonych szczepów. Technika ta pozwala na testowanie społeczności na szeroką skalę, co pozwala nam badać skutki zasięgu testów i bezobjawowego rozprzestrzeniania się Covid 19.

efficient-sars-cov-2-quantitative-reverse-transcriptase-pcr-saliva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety.  W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji ilościowej metody PCR używanej do wykrywania i kwantyfikacji DNA EHV-2 w płynach oddechowych koni. Protokół walidacji EHV-2 qRT-PCR obejmuje trzyczęściową procedurę: opracowanie, scharakteryzowanie samego testu qRT-PCR oraz scharakteryzowanie całej metody analitycznej.

Opracowanie i walidacja ilościowej metody PCR do diagnostyki herpeswirusa koniowatego-2 w płynach oddechowych

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Poznaj metodę diagnostyki SARS-CoV-2 z próbek śliny przy użyciu RT-qPCR i robotów do pipetowania typu open source. To skalowalne rozwiązanie umożliwia przeprowadzanie tysięcy testów dziennie bez konieczności ekstrakcji.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Przeglądaj więcej filmów