Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Opracowaliśmy tani test diagnostyczny COVID 19 oparty na ślinie i przepływ pracy, który jest łatwy do wdrożenia i skalowania do zastosowań przesiewowych na dużą skalę. W tym przypadku używamy robotów do obsługi cieczy typu open source, standardowych termocyklerów i oprogramowania do wykonywania bezpośrednich testów śliny bez ekstrakcyjnych lub stabilizacyjnych, zapewniając jednocześnie dokładne wyniki diagnostyczne. Ze względu na proste, zautomatyzowane, równoległe przepływy pracy, system można skalować w górę w celu wykonywania tysięcy testów dziennie przy minimalnych wymaganiach sprzętowych, przestrzennych i personelu.

Oprócz Kylie King, Rachel Ham, nasza kierowniczka laboratorium klinicznego i Austin Smothers, nasz koordynator ds. edukacji, pomogą zademonstrować procedurę Zacznij od odkażenia zewnętrznej strony probówek do pobierania śliny za pomocą 70% etanolu i przeniesienia ich do laboratorium w celu przetestowania. Zapisz przybycie próbki, skanując każdy kod kreskowy próbki do arkusza kalkulacyjnego dziennego poboru. Skanowane próbki należy poddać obróbce cieplnej przez 30 minut w piecu o temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie usunąć próbki za pomocą rękawic żaroodpornych.

Otwórz arkusze kalkulacyjne codziennego ładowania próbek dla każdego robota ładującego próbki na stacji przypisywania próbek. Następnie przypisz 188 próbek do każdej płytki 384-dołkowej. Tace na etykiety z nazwą tabliczki, datą i numerem kwartału.

Zeskanuj próbki w kolejności do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbek. Na stacji ładowania próbek ustaw dwa pełne zestawy ośmiu wydrukowanych w 3D stojaków, odpowiadających umieszczeniu pokładu w robocie. Odkręć ćwiartkę jednej probówki i umieść je w stojakach wydrukowanych w 3D, zaczynając od pozycji A1 w stojaku pierwszym.

Wypełnij każdy kosz od lewej do prawej i od góry do dołu. Kontynuuj ten schemat ładowania w stojaku drugim, a następnie przejdź do stojaków czwartego i piątego. Umieść załadowane stojaki na próbki ćwiartki pierwszej na pokładzie pierwszym, drugim, czwartym, piątym, siódmym, ósmym, 10, 11.

Umieść końcówki P20 na pokładzie trzecim i dziewiątym. Aby uprościć proces konfiguracji, załaduj materiały od tyłu do przodu do robota. Płyty master mix są produkowane na dedykowanym robocie i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Jednorazowo używana jest jedna tabliczka, która jest oznaczona nazwą tabliczki, a ostre ostrze służy do wycinania linii w folii wokół studzienek kontrolnych. Umieścić główną płytkę mieszającą na pokładzie szóstym i zdjąć foliową pokrywę, pozostawiając mały prostokąt zakrywający studzienki kontrolne. Otwórz pudełka z końcówkami i zamknij robota.

Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk start uruchom w aplikacji komputerowej robota. Każda ćwiartka ładuje się na talerz w ciągu 24,5 minuty. Ustaw minutnik jako przypomnienie.

Podczas pracy robota odkręć i załaduj ćwiartkę dwóch probówek z próbkami do drugiego zestawu stojaków wydrukowanych w 3D. Gdy robot zatrzyma się, usuń ćwiartkę pierwszej szafy i zastąp je ćwiartką dwiema szafami, a następnie kliknij wznów uruchamianie w aplikacji komputerowej. Uzupełnij ćwiartkę pierwszej probówki z próbkami i przechowuj je w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w oczekiwaniu na wyniki.

Powtórz ten proces ładowania dla kwadransów trzeciego i czwartego. Przenieś załadowaną płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Aby zminimalizować zanieczyszczenie, należy przykryć płytkę podczas przenoszenia.

Zbierz dowolne powtarzające się próbki i przypisz je jako ostatnie próbki w czwartej ćwiartce. Ponumeruj próbki, zeskanuj kody kreskowe i wprowadź oryginalną lokalizację próbki oraz wynik do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbki. Przenieś powtórzone próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego.

Nie ładuj probówek z powtarzającymi się próbkami do stojaków załadowczych robota. Odpipetować dwa mikrolitry każdej powtórzonej próbki do odpowiednich studzienek. Do dodawania próbek pacjenta należy używać przeznaczonej do tego pipety.

Podczas dodawania próbek należy przykryć studzienki kontrolne folią, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Zdejmij foliową osłonę ze studzienek kontrolnych za pomocą kleszczy. Pobrać pipety z dwóch mikrolitrów potwierdzonych dodatnich próbek pacjenta do studzienek M23 i M24.

Odmierzyć pipetą dwa mikrolitry wody wolnej od nukleaz do studzienek N23 do N24 i dwa mikrolitry po 200 kopii na mikrolitr zmieszanej kontroli pozytywnej do studzienek O23 do O24. Pozostaw studzienki od P23 do P24 puste, aby monitorować jakość partii mieszanki głównej. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką i użyj wałka aplikatora, aby przykleić uszczelkę do wszystkich studzienek.

Wirować płytkę przy 2, 500 obr./min przez 30 sekund, aby dokładnie wymieszać, a następnie odwirować płytkę przy 500 razy G przez jedną minutę. Wybierz program protokołu w oprogramowaniu termocyklera i zapisz protokół na przyszłe płytki. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i uruchom protokół.

Wyeksportuj wartości CT i skopiuj je do przykładowego arkusza kalkulacyjnego. W przypadku kontroli dodatniej sprawdź, czy co najmniej jedna studzienka kontroli dodatniej wytwarza wartości CT od 22 do 28 zarówno dla sond P1, jak i N1. Alternatywnie, znane dołki z dodatnimi próbkami wytwarzają wartości CT P1 i N1 mniejsze niż 33 na sondach P1 i N1.

W przypadku kontroli ujemnej należy sprawdzić, czy w żadnej z dwóch studzienek kontroli ujemnej nie ma wartości N1 lub P1 CT. Upewnij się, że wartości CT mają prawidłowe krzywe amplifikacji przed unieważnieniem płytki. Jeśli P1 daje wynik CT mniejszy niż 33, należy uznać studnię za ważną i przejść do wyniku z N1. Jeśli P1 daje wynik CT większy lub równy 33 lub brak wartości CT, należy uznać studnię za nieważną.

Jeśli N1 daje wynik CT mniejszy niż 33, oceń dobrze jako tak. Jeśli N1 nie daje wartości CT, oceń studnię jako nie. Jeśli N1 daje wartość CT większą lub równą 33, oceń studnię jako brak gwiazdy.

Upewnij się, że wszystkie wartości N1 CT są powiązane z rzeczywistą krzywą wzmocnienia. Jeśli wartość CT dla N1 nie ma krzywej wzmocnienia, studnia ma wartość nie. Zidentyfikuj powtarzające się próbki, oznacz je wewnętrznym numerem próbki i typem próbki, a następnie zwróć je do procesu ładowania.

Reprezentatywne obrazy pokazują wykrywanie syntetycznego RNA N1 lub SARS CoV-2 metodą RTQ PCR oraz syntetycznego DNA P1 lub HSRPP30. Krzywe standardowe zostały wykreślone z odchyleniami standardowymi w celu określenia zakresu dokładnej detekcji przy użyciu tej kombinacji starterów sondy. Średnie wartości CT uzyskane w odpowiednich rozcieńczeniach zestawiono z szacowaną ilością syntetycznego RNA i syntetycznego DNA.

W obu przypadkach krzywe liniowe wykazały dobre współczynniki korelacji w szerokim zakresie stężeń kopii genów. Wartości N1 CT uzyskane z unikalnych próbek przy użyciu zarówno robota, jak i ręcznego ładowania próbek przetransponowano w celu określenia zmienności między testami między ładowaniem ręcznym a robotem. Liniowa zależność między metodami ręcznymi i automatycznymi pozwoliła uzyskać wysoki współczynnik korelacji, co wskazuje, że obie metody są funkcjonalnie równoważne.

Zmienność w teście wewnętrznym określono również za pomocą transponowanych replikacyjnych wartości N1 CT uzyskanych zarówno z robota, jak i ręcznego ładowania próbki. Ocena metod obróbki cieplnej w celu zmniejszenia lepkości śliny jest pokazana tutaj. Ślinę ujemną dla SARS CoV-2 pobrano z jednego źródła, a podwielokrotności poddano obróbce cieplnej przez zero minut, 30 minut lub 60 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Wartości P1 CT z kontrprób technicznych każdego schorzenia wykreślono w celu określenia zmienności między metodami leczenia. Zarówno 30-minutowa, jak i 60-minutowa metoda obróbki cieplnej spowodowała znacznie zmniejszoną zmienność próbki w porównaniu z brakiem kontroli leczenia. Nie było istotnej różnicy między zabiegami trwającymi 30 i 60 minut.

Dlatego wdrożono metodę 30-minutowej obróbki cieplnej w celu skrócenia czasu obróbki. Stosuj odpowiednią technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie płytek testowych, szczególnie podczas ładowania próbek ręcznych i kontroli. Unikaj krzyżowania się po talerzu rękami lub rękawami.

Po uzyskaniu wyników klinicznych próbki można wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne lub zachować do dalszej analizy, takiej jak sekwencjonowanie całego genomu w celu określenia określonych szczepów. Technika ta pozwala na testowanie społeczności na szeroką skalę, co pozwala nam badać skutki zasięgu testów i bezobjawowego rozprzestrzeniania się Covid 19.