Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

Rak piersi jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem i drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet w USA. Obecne podejścia zapobiegawcze są ograniczone i wiążą się z różnymi niepożądanymi skutkami ubocznymi. Potrzebne są nowe interwencje w zakresie prewencji pierwotnej. Opracowaliśmy metodę wewnątrzprzewodowego dostarczania roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do nabłonka sutka myszy w celu zapobiegania rakowi piersi.

Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu sutka pozwala na celowanie w komórki nabłonkowe wyściełające drzewo przewodowe przy minimalnym ubocznym uszkodzeniu tkanki. Metoda ta pozwala na jednoczesne obrazowanie in vivo z wykorzystaniem nanocząstek tlenku tantalu jako środka kontrastowego o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może być dostosowana do stosowania z innymi rentgenowskimi środkami kontrastowymi i różnymi zabiegami zapobiegawczymi z różnymi chemicznymi lub termicznymi roztworami ablacyjnymi.

Pierwszym krokiem związanym z tą metodą profilaktyki raka piersi pod kontrolą obrazu jest wywołanie rozszerzonego leczenia przeciwzapalnego poprzez doustne dawkowanie karprofenu przy użyciu kubeczków z żelem sukralozowym przygotowanych w laboratorium. Przygotowujemy zwierzę za pomocą kremu do depilacji, aby usunąć sierść z obszaru otaczającego sutki, które mają być wstrzyknięte. Następnie wykonuje się iniekcje wewnątrzprzewodowe za pomocą stereoskopu, aby jak najlepiej zlokalizować i uwidocznić otwór smoczka do wprowadzenia igły.

Po podaniu roztworu zwierzęta są obrazowane za pomocą mikrotomografii komputerowej lub fluoroskopii, aby określić, jak skuteczne były zastrzyki. Skany mikro-CT mogą być przetwarzane w celu stworzenia rekonstrukcji 3D wstrzykniętego drzewa przewodowego sutka w celu dalszej analizy udanego wypełnienia i innych wskaźników. Najpierw przygotuj karprofen w wymaganym stężeniu.

Sporządzamy roztwór roboczy o objętości dwóch mg na ml, aby wstrzyknąć 0,5 ml i osiągnąć ostateczną dawkę jednej mg na filiżankę. Możesz dodać sterylny barwnik spożywczy do mieszanki, aby lepiej potwierdzić pełne wymieszanie leku z sukralozą w kubku. Następnie umieść filiżanki w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 15 minut.

Wyjmij kubki i wysusz je, aby zminimalizować możliwość zanieczyszczenia. Użyj chusteczek z 70% etanolem lub etanolu, aby wyczyścić powierzchnię pokrywki kubka i pozostawić do wyschnięcia. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć niezbędną ilość roztworu karprofenu przez pokrywkę.

W takim przypadku musimy wstrzyknąć 500 mikrolitrów, aby uzyskać pożądany rezultat. Umieść naklejkę na otworze igły i potrząsaj kubkiem przez 15 sekund, a następnie wiruj przez dodatkowe 15 sekund. Sprawdź kubek pod kątem jednorodnego wymieszania, szukając grudek ciemnoniebieskiego.

Kubki można następnie przechowywać w lodówce przez okres do miesiąca. Przygotowanie zwierzęcia powinno nastąpić dwa do trzech dni przed zabiegiem wewnątrzprzewodowym. Zacznij od znieczulenia zwierzęcia za pomocą izofluranu.

Przenieś znieczuloną mysz do stożka nosowego, który nadal dostarcza izofluran. Nałóż smar do oczu na mysz na stożek nosa, a następnie umieść mysz na jej grzbiecie. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć krem do depilacji na obszar gruczołów sutkowych, który planujesz wstrzyknąć.

Pocieraj aplikatorem w górę iw dół po skórze zwierzęcia w wybranym obszarze, aby pomóc w szybszym rozluźnieniu sierści. Ważne jest, aby pozostawić krem na myszy tak krótko, jak to możliwe, aby uniknąć poparzenia skóry. Po 10 do 30 sekundach od aplikacji użyj ciepłej wody na gazie, aby całkowicie usunąć krem.

Użyj dwóch do czterech płukań, aby zapewnić całkowite usunięcie przed wysuszeniem skóry czystą gazą. Sprawdź miejsca usuwania sierści, aby upewnić się, że są dobrze widoczne i mają dostęp do sutków. W razie potrzeby powtórz procedurę depilacji.

Umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej, aby odzyskać siły po znieczuleniu. Daj jeden kubek karprofenu, aby przygotować myszy w ich domowej klatce po wyzdrowieniu. Ponownie zaczniesz od znieczulenia zwierzęcia za pomocą znieczulenia izofluranem i przeniesiesz mysz do stożka nosowego, gdy zostanie on w pełni wywołany.

Smar do oczu zostanie nałożony przed umieszczeniem zwierzęcia na plecach do wstrzyknięć. Pomocne może być zaklejenie taśmą nóg w pobliżu gruczołów sutkowych, które zostaną wstrzyknięte, ale nie jest to konieczne. Przygotować strzykawkę z żądaną objętością roztworu do wstrzykiwań plus jeden mikrolitr na wypadek, gdyby jakaś ilość po wyjęciu igły.

Pomocne może być napełnienie dodatkowej objętości w celu zbadania swobodnego przepływu roztworu w igle bezpośrednio przed wstrzyknięciem. W przypadku wstrzyknięcia więcej niż jednego gruczołu sutkowego można zaoszczędzić czas na wstępne napełnienie wielu strzykawek, jeśli są dostępne. Uważaj, aby nie zrobić tego zbyt wcześnie, jeśli roztwór jest podatny na zatykanie, gdy jest pozostawiony do siedzenia.

Przygotuj sutek, usuwając widoczną martwą skórę za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, jeśli to możliwe. Nie ma potrzeby usuwania całego martwego naskórka, jeśli nie blokuje on otworu sutka i jest odporny na szarpanie. Może to czasami spowodować obrażenia i obrzęk brodawki, jeśli martwa skóra zostanie zbyt mocno przyklejona do żywej skóry.

Mając widoczny skos igły, włóż igłę do otworu smoczka, korzystając z pomocy kleszczyków z cienką końcówką. W zależności od długości i twardości brodawki, nie zawsze możliwe jest jej trzymanie podczas wprowadzania igły. Czasami konieczne jest manewrowanie smoczkiem za pomocą igły, aby kleszcze mogły naciągnąć sutek w górę nad igłą, zamiast prowadzić igłę w dół do brodawki.

Gdy skos igły zostanie całkowicie otoczony przez smoczek i znajdzie się w głównym przewodzie, rozpocznij powolne wstrzykiwanie roztworu. Pożądana szybkość to około 40 mikrolitrów na minutę. Należy unikać wstrzykiwania szybciej, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu drzewa kanałowego.

Po całkowitym wstrzyknięciu należy odczekać 30 sekund przed wyjęciem igły z brodawki sutkowej przy pomocy kleszczy. Zminimalizuje to wyciek ze smoczka. Ocenić obszar pod kątem jakichkolwiek oznak nieudanego wstrzyknięcia.

Wypukły wygląd może wskazywać na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej lub uraz tego obszaru. Często można zauważyć, że wstrzyknięcie do poduszeczki tłuszczowej ma miejsce, jeśli roztwór zawiera barwnik lub jeśli uważnie szukasz wypukłości w miejscu wstrzyknięcia, jak można zobaczyć tutaj. Przystąp do wstrzykiwania pozostałych gruczołów sutkowych wymaganych w eksperymencie w podobny sposób, zwracając uwagę na objętość wstrzyknięć i wszelkie przypadki wycieku.

Niektóre obszary myszy mogą być trudniejsze do wstrzyknięcia z powodu problemów, takich jak niewygodne ułożenie dłoni lub zakłócenia w oddychaniu. Na przykład, praworęczny wstrzykiwacz będzie prawdopodobnie miał najtrudniejszy czas na wstrzyknięcie gruczołów w prawym górnym rogu myszy, widocznych tutaj. Poruszają się one bardziej ze względu na bliskość płuc i może być trudno znaleźć dobre ułożenie dłoni z ciałem zwierzęcia w taki sposób, aby oprzeć nadgarstek na powierzchni.

Niektórym może być łatwiej zmienić położenie myszy, jeśli pozwala na to stożek nosowy. Podczas wstrzykiwania roztworu zawierającego etanol należy zachować ostrożność, aby uniknąć ogólnoustrojowego zatrucia alkoholem. Wymaga to wiedzy o tym, ile etanolu można wstrzyknąć podczas jednej sesji i podawania roztworu zawierającego sacharozę IP podczas zabiegu, aby przeciwdziałać skutkom.

Po zabiegu wewnątrzprzewodowym zwierzęta mogą zostać odzyskane w czystej klatce na poduszce grzewczej lub przeniesione do systemu mikrotomografii komputerowej w celu obrazowania wypełnionych drzew kanałowych. Mysz powinna również zostać odzyskana po każdej sesji obrazowania. Po przeniesieniu wstrzykniętego zwierzęcia do systemu mikro-CT należy kontynuować podawanie izofluranu w celu utrzymania znieczulenia podczas obrazowania.

Pomocne może być ujednolicenie pozycji obrazowania poprzez przyklejenie taśmą nóg w pobliżu miejsca, które ma być obrazowane. Na przykład przyklejenie tylnych nóg w wyprostowanej pozycji może zapobiec zasłanianiu widoczności wstrzykniętych gruczołów. Przyklejanie przednich nóg w pozycji wysuniętej do góry może podobnie pomóc w oglądaniu górnych gruczołów.

Odkryliśmy również, że przyklejanie taśmy w poprzek brzucha myszy może pomóc w zmniejszeniu artefaktu oddychania dla dolnych gruczołów. Istnieje wiele dopuszczalnych parametrów skanowania dla wizualizacji drzewa kanałowego. Należy zawsze zachować ostrożność, aby dawka promieniowania wynikająca z tych skanów nie przekraczała limitów promieniowania dla danego szczepu myszy.

Dozowanie promieniowania można znacznie zmniejszyć, obserwując fluoroskopię i odnotowując powodzenie podawania, a nie pozyskując obrazy o dłuższym czasie naświetlania. Nasze standardowe parametry skanowania są akceptowalne w przypadku powtarzania obrazowania, jeśli uzyskujesz tylko krótkie, dwuminutowe standardowe skany. Dłuższe skany o wyższej rozdzielczości, do 14 minut, są dopuszczalne jako procedura terminalna przed eutanazją.

Te dłuższe skany nie są dopuszczalne w badaniach podłużnych, ponieważ mogą powodować chorobę popromienną u zwierzęcia. Zwierzęciu temu wstrzyknięto roztwór etanolu zawierający 100-milimolowy kontrast tlenku tantalu w gruczołach czwartym i dziewiątym. Obecna akwizycja to 14-minutowy skan w wysokiej rozdzielczości wstrzykniętych dolnych gruczołów.

Fluoroskopia zwierzęcia pozwala nam zobaczyć architekturę drzewa przewodowego uwydatnioną przez kontrast w roztworze do wstrzykiwań. Stosowany przez nas system micro-CT posiada wbudowane oprogramowanie, które pozwala na tworzenie szybkich odczytów w celu oceny skuteczności iniekcji bez formalnej analizy. Ta funkcja ma prosty suwak kontrastu, który pozwala na rozsądną redukcję sygnału do szumu.

Ograniczeniem tych odwzorowań jest to, że te same progi sygnału są stosowane do całego obrazu. Dzięki temu jasne sygnały, które wyraźnie nie są częścią drzewa przewodowego, takie jak żelazo w diecie, pozostają w wersji. Lepsze przedstawienia formalne można uzyskać za pomocą bardziej zaawansowanego oprogramowania analitycznego, które umożliwia segmentację obszaru zainteresowania.

Aby uzyskać najlepsze odwzorowanie jedynego drzewa przewodowego, zalecamy segmentację poduszeczki tłuszczowej sutka w celu dalszego przetwarzania obrazu. Proces ten wymaga śledzenia linii granic poduszeczki tłuszczowej na całej grubości zwierzęcia. Odkryliśmy, że śledzenie co trzeciego przekroju i propagowanie obiektu jest wystarczające do uchwycenia całego kanału.

Może to być subiektywny proces, który wymaga przestrzegania standardów laboratoryjnych dotyczących śledzenia, aby zapewnić podobne wyniki od wszystkich osób analizujących skany. Znajomość anatomii może pomóc w ocenie, jakie obszary należy uwzględnić. Po rozmnożeniu śladów możliwe jest progowanie odwzorowania w pewnym zakresie, aby wyświetlić tylko kontrast zawarty w gruczole sutkowym.

Powinno to być rozwiązanie w obrębie drzewa kanałowego, a także wszelkie wycieki w bezpośrednim sąsiedztwie. Zakres od 300 do 3 000 HU zwykle dobrze sprawdza się w przypadku roztworów zawierających tlenek tantalu. Przykład w pełni przetworzonej wersji można tu zobaczyć w wielu aspektach.

W zależności od tego, jak zwierzę jest zorientowane w mikrotomografii komputerowej, może być konieczna zmiana orientacji plików DICOM w oprogramowaniu analitycznym, aby przedstawić intuicyjne ustawienie anatomiczne z głową zwierzęcia u góry obrazu. Określenie, który gruczoł jest oglądany, może być również trudne, jeśli nie zadbamy o to, aby za każdym razem obracać obraz w podobny sposób. Dalsze pomiary, takie jak objętość lub długość, można wykonać po utworzeniu rekonstrukcji drzewa kanałowego.

Walidację pomyślnego dostarczenia za pomocą tej procedury można wykazać nie tylko za pomocą odwzorowań mikro-CT 3D, jak opisano tutaj, ale także za pomocą podwójnie wybarwionych całych mocowań z wstrzykniętym niebieskim Evansem nakładającym się na całe drzewo kanałowe podkreślone karminowym alum. 3D mikroskopia konfokalna może podkreślić architekturę drzewa przewodowego w oczyszczonym gruczole wybarwionym e-kadheryną. Zmienność między szczepami i myszami oraz anatomia sutków mogą sprawić, że wstrzykiwanie gruczołów będzie mniej lub bardziej trudne.

Jest to przykład idealnego smoczka do wstrzykiwań o wysokim profilu ułatwiającym chwytanie. Sutki o niższych profilach, takie jak ten, mogą być trudniejsze do skutecznej kaniulacji. Różnice te mogą sprawić, że bardziej prawdopodobne jest, że osiągniesz udany zastrzyk bez urazu lub domingu, jak widać tutaj, lub bardziej prawdopodobne, że zakończy się niepowodzeniem, jak pokazano na kopulastym wyglądzie tego wstrzyknięcia poduszeczki tłuszczowej.

Jeśli chodzi o profilaktykę raka piersi, obecnie stosuje się dwie główne taktyki. Pierwsze, czujne wyczekiwanie, nie wiąże się z żadną prawdziwą interwencją. Osoby podążające tą ścieżką są regularnie monitorowane pod kątem wszelkich guzków w tkance piersi, które wskazywałyby na powstawanie raka.

Wykrycie choroby przyspieszyłoby wtedy leczenie. Profilaktyczna mastektomia jest bardziej inwazyjnym zabiegiem polegającym na usunięciu wszystkich komórek nabłonka, z których może powstać rak piersi wraz z otaczającym go zrębem. Operacja ta może mieć poważne niepożądane skutki uboczne i rzadko jest wybierana jako opcja profilaktyczna dla osób z niskim lub umiarkowanym ryzykiem choroby.

Nasze podejście polega na miejscowej ablacji nabłonka poprzez wstrzyknięcie roztworu ablacyjnego bezpośrednio do drzewa przewodowego sutka. Ta metoda zmniejsza szkody uboczne i prawdopodobnie byłaby bardziej atrakcyjną opcją dla osób, które nie są poważnie zagrożone chorobą. Dodanie kontrastu do natychmiastowego obrazowania po wstrzyknięciu sprawia, że można to łatwo przełożyć na praktykę kliniczną.