Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Szarańcza wędrowna jest ważnym sprawdzianem rolniczym. Metoda ta zapewnia wydajny i łatwy do uzyskania protokół dla metod ciśnienia genów Jest to systematyczna i szczegółowa metoda budowy CRISPR/CAS9 homozygotycznych mutantów szarańczy, w tym pobieranie jaj, badanie przesiewowe mutantów i utrzymanie homozygotyki. Na początek należy przygotować igły do wstrzykiwań, pociągając szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet.

Ustaw parametry zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym, a następnie zmiel końcówkę igły iniekcyjnej za pomocą mikro młynka. Przygotuj białko rybonukleowe do wstrzyknięcia, mieszając jeden mikrolitr białka Cas9 z jednym mikrolitrem zweryfikowanego pojedynczego przewodnika RNA. Następnie dodaj osiem mikrolitrów wolnej sterylnej wody RNA, aby uzyskać ostateczną objętość mieszaniny, 10 mikrolitrów.

Dokładnie wymieszaj roztwór i umieść go na lodzie. Następnie zbierz świeżo złożone strąki jaj ze strąka jajowego i poczekaj na garbowanie jaj. Po 30 minutach za pomocą cienkiej szczoteczki odizoluj jajka od strąków w wodzie i umyj jajka trzy razy sterylną wodą.

Następnie umieść jajka na szalce Petriego i dodaj sterylną wodę, aby były wilgotne. Napełnić igłę do wstrzykiwań przygotowanym roztworem białka rybonukleonowego i załadować iniekcję do mikromanipulatora. Ustaw parametry mikroiniekcji jako 300 hektopaskali ciśnienia iniekcji, 0,5 sekundy czasu iniekcji i 25 hektopaskali ciśnienia kompensacyjnego.

Po ustawieniu parametrów nacisnąć pedał, aby ocenić objętość wstrzykiwanego roztworu. Dostosuj ciśnienie wtrysku i czas wtrysku, aby upewnić się, że objętość wtrysku wynosi około 50 do 100 nanolitrów. Po regularnym ułożeniu sterylnych jaj na podkładce iniekcyjnej, umieść podkładkę na stole przedmiotowym mikroskopu i dostosuj powiększenie mikroskopu, aż do momentu zaobserwowania jaj.

Następnie wyreguluj igłę do mikroiniekcji pod mikroskopem, aż końcówka iniekcji będzie widoczna, a następnie umieść końcówkę w pobliżu komórki jajowej, która ma zostać wstrzyknięta. Wstrzyknięcie należy rozpocząć na odpowiedniej wysokości i pod kątem od 30 do 45 stopni. Włóż końcówkę do jajka w pobliżu mikro stosów jajka i naciśnij pedał, aby wykonać wstrzyknięcie.

Następnie należy szybko wycofać igłę i przesunąć wkładkę do wstrzykiwania w celu wstrzyknięcia następnego jaja. Przenieś wstrzyknięte jaja do naczynia hodowlanego z kawałkiem wilgotnej bibuły filtracyjnej. Umieść je w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Po wstrzyknięciu należy codziennie sprawdzać rozwój wstrzykniętych komórek jajowych. Przenieś wstrzyknięte jaja do nowego naczynia hodowlanego co 24 godziny w ciągu pierwszych pięciu dni. Szóstego dnia po wstrzyknięciu losowo wybierz i przenieś 10 jaj do probówki i odpowiednio zmiel jaja dwiema stalowymi kulkami o częstotliwości 60 Hz przez sześć minut za pomocą młynka.

Po zmieleniu ponownie zawieś zanieczyszczenia w jednym mililitrze PBS. Następnie przenieś pięć mikrolitrów zawieszonej mieszaniny do 45 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu do lizy w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby zakończyć alkaliczną reakcję lizy, dodaj pięć mikrolitrów jednego molowego roztworu chlorowodorku Tris do układu lizy.

Weź jeden mikrolitr produktu lizy jako matrycę PCR, aby amplifikować docelowy fragment genu. Po PCR i sekwencjonowaniu porównaj wyniki sekwencjonowania z sekwencją typu dzikiego, aby ocenić, czy system CRISPR/Cas9 rozszczepił gen docelowy in vivo. Pozwól reszcie jaj na późniejszy rozwój, ponieważ indele są wykrywane na etapie embrionalnym.

Po opracowaniu, przenieś i hoduj wyklute nimfy do klatki hodowlanej, jak opisano w manuskrypcie. Kiedy nimfy rozwiną się do piątego stadium rozwojowego, oddziel je plastikowymi kubkami hodowlanymi. Przeprowadzanie krzyżowania przy użyciu mutantów G0 i szarańczy typu dzikiego.

Po zebraniu oassists, użyj od trzech do sześciu rozwiniętych jaj w każdym oassist, aby wykryć mutacje, jak opisano wcześniej. Zachowaj pozytywne asysty mutacji dla późniejszego rozwoju i porzuć negatywne asysty mutacji. W celu kriokonserwacji umyj jaja sterylną wodą i inkubuj je w naczyniu hodowlanym, jak wyjaśniono wcześniej.

Po pięciu do sześciu dniach zbierz jaja razem w naczyniu hodowlanym i przykryj je fragmentami bibuły filtracyjnej. Następnie owiń całe naczynie hodowlane folią parafinową. Umieść naczynie w temperaturze 25 stopni Celsjusza na dwa dni, a następnie kolejne dwa dni w niższej temperaturze od 13 do 16 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś naczynie do lodówki o temperaturze sześciu stopni Celsjusza. Dodawaj wodę do naczynia co dwa tygodnie, aby zapewnić jajom wilgotne środowisko. Na koniec, aby reanimować kriokonserwowane jaja, umieść szalkę Petriego w temperaturze 25 stopni Celsjusza na dwa dni.

Później umieść jaja w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż wyklują się nimfy. W tym badaniu miejsce docelowe dla systemu CRISPR/Cas9 znajdowało się w pierwszym eksonie. W teście rozszczepienia Cas9 białko rybonukleowe CRISPR/Cas9 może trawić fragment PCR zawierający miejsce docelowe z szybkością rozszczepienia około 55%Wyniki sekwencjonowania w celu oszacowania szybkości mutacji w stadium embrionalnym sugerowały wydajną edycję genomu w miejscu docelowym.

Skuteczność edycji spowodowała 52,73% wskaźnika wylęgu nimf, a 66,67% dorosłych G0 było mutantami mozaikowymi. Strategia przechodzenia linii mutantów jest pokazana tutaj. Nadmiar homozygotycznych jaj poddano kriokonserwacji w celu poprawy stopnia wykorzystania homozygot.

Chociaż tempo wylęgu kriokonserwowanych jaj zmniejszyło się wraz z wydłużeniem czasu kriokonserwacji, działania zaradcze, takie jak zastosowanie fragmentów bibuły filtracyjnej i odzyskanie tych zakonserwowanych jaj z gradientem wzrostu temperatury, były pomocne w resuscytacji. Najważniejsze jest, aby starać się ograniczyć uszkodzenia mechaniczne spowodowane mikroiniekcją. Procedura ta może być wykorzystana jako odniesienie do pozyskiwania innych owadów.

Niektóre szczegóły, takie jak metody zbierania jaj, nastrzykiwania i uprawy, powinny zostać zmodyfikowane. Technika ta może być również pomocna w badaniu metamorfozy i adaptacji środowiskowej owadów oraz budowie homozygotycznych mutantów szarańczy, co przyspieszyło badania w tej dziedzinie.