Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów
October 4th, 2018
Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i immunologii, takie jak wpływ różnych bodźców lub leków na szlaki sygnałowe? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przeprowadzanie analizy sygnalizacji pojedynczej komórki w trybie średnio- i wysokoprzepustowym. Po ponownym zawieszeniu komórek w uzupełnionym podłożu RPMI 16/40, przenieś wymaganą ilość zawiesiny ogniw do studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V.
Przenieś płytkę do podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją tam na 10 minut. Następnie dodaj 60 mikrolitrów stałego buforu po jednym do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej, aby ustawić płytkę utrwalającą. Umieść tę płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przenieść próbkę kontrolną o pojemności 50 mikrolitrów na płytkę i mieszać, pipetując w górę i w dół. Opcjonalnie dodaj 10 mikrolitrów na mililitr anty-IgM do komórek, aby rozpocząć przebieg symulacji w czasie i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę o objętości 50 mikrolitrów na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym, mieszając każdą próbkę podczas jej dodawania.
Po dodaniu ostatniej próbki pozostawić płytkę utrwalającą w łaźni wodnej na 10 minut. Najpierw umyj komórki trzykrotnie PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.
Następnie należy przygotować świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych, pipetując pięć mikrolitrów każdego odczynnika do kodów kreskowych do każdej studzienki, wypełniając liczbę studzienek wymaganą do zabarwienia każdej z próbek. W stałej płytce komórkowej ponownie zawieś komórki w każdej studzience za pomocą 190 mikrolitrów PBS. Następnie przenieś każdą studzienkę komórek do odpowiedniego dołka na płytce z kodowaniem kreskowym, dokładnie mieszając każdą studzienkę.
Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 20 minut w ciemności. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie za pomocą płukania przepływowego.
Następnie dodaj 190 mikrolitrów płynu do każdej studzienki komórek. Połącz wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej 15-mililitrowej probówce i przenieś każdą kontrolę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.
Aby rozpocząć, przenieś dwa mililitry buforu trwałej ondulacji trzy do 15-mililitrowej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby po użyciu był lodowato zimny. Gdy będziesz gotowy, dodaj 1,5 mililitra lodowatego buforu do 15-mililitrowej probówki zawierającej populację komórek z kodem kreskowym kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.
Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu do trwałej ondulacji do każdej z kontrolek kompensacyjnych w ten sam sposób. Natychmiast przenieś komórki do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 30 minut. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia antygenem, wyjmij komórki z zamrażarki i przenieś je do pudełka z lodem.
Umyj komórki trzykrotnie nadmiarem płynnego płukania. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, tak aby na jedno barwienie przeciwciałami fosfologicznymi przypadało 25 mikrolitrów zawiesiny komórek.
Ponownie zawiesić elementy sterujące kompensacją w 200 mikrolitrach prania przepływowego. Aby rozpocząć przygotowywanie przeciwciał do barwienia, dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała swoistego dla fosfony, rozcieńczonego w płynnym płukaniu, do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 15 mikrolitrów markera powierzchniowego, rozcieńczonego w płynie do płukania i 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę.
Pozwól komórkom odpoczywać przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dwukrotnie umyj poplamione komórki myciem przepływowym. Wirować przy 500 razy G przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 mikrolitrach płynnego płukania. Następnie wykonaj analizę cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W prezentowanym protokole trójwymiarowe kodowanie kreskowe odbywa się poprzez połączenie trzech barwników do kodów kreskowych.
Poszczególne próbki są następnie dekonwolucyjne przez późniejsze bramkowanie na każdym odczynniku do kodów kreskowych w stosunku do obszaru rozproszonego bocznego. Podstawowe i indukowane stymulacją poziomy fosforylacji 20 cząsteczek sygnałowych za receptorem komórek B są następnie charakteryzowane w komórkach B od pacjentów z PBL i normalnych kontroli w różnych warunkach. Stat3 phospho tyrozyna 705 jest znacznie regulowana w górę.
Komórki są stymulowane anty-IgM przez okres do 30 minut w celu zidentyfikowania aberracji sygnałowych indukowanych przez szlak receptora komórek B. Podczas gdy komórki PBL od pacjentów z niezmutowanym IGVH wykazują zwiększoną wrażliwość na stymulację anty-IgM, jest to statystycznie istotne tylko dla AKT foseryny 473. Komórki są następnie poddawane działaniu inhibitora kinazy PI 3-delta, idelalizybu, w celu sprawdzenia, czy nieprawidłowy sygnał AKT pS473 można odwrócić.
Jak pokazano tutaj, nieprawidłowe poziomy są znacznie zmniejszone po leczeniu w sposób zależny od stężenia, co pokazuje, że inhibitory kinaz mogą być stosowane w celu normalizacji nieprawidłowej sygnalizacji w komórkach CLL. Przed przystąpieniem do tej procedury należy pamiętać o miareczkowaniu odczynników do kodów kreskowych i przeciwciał oraz o sprawdzeniu, czy wybrane markery powierzchniowe są kompatybilne z odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Komórki muszą być w zawiesinie do analizy luminoforowej, mimo to protokół można dostosować do nieprawidłowych komórek lub tkanek po procedurach w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, takiej jak cała trypzynacja.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do analizy fosforylacyjnych zdarzeń białkowych na poziomie komórkowym o średniej do wysokiej wydajności za pomocą mikroskopii przepływowej z fosfo-barwieniem. Ta metoda jest skuteczna w charakteryzowaniu aberracji sygnalizacyjnych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz ocenie farmakodynamiki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Transdukcja sygnału
Tło
- Mikroskopia przepływowa z fosfo-barwieniem pozwala na analizę sygnalizacji pojedynczych komórek.
- Ta technika może badać, jak na ścieżki sygnalizacyjne wpływają różne bodźce lub leki.
- Jest odpowiednia dla analizy o średniej do wysokiej wydajności.
- Metoda zwiększa zdolność do badania odpowiedzi komórkowych na szczegółowym poziomie.
Cel badania
- Dostarczyć wiarygodny protokół do analizy fosforylacyjnych zdarzeń białkowych.
- Ułatwić identyfikację biomarkerów w sygnalizacji komórkowej.
- Ocenić farmakodynamikę różnych terapii.
Stosowane metody
- Komórki są ponownie zawieszone w uzupełnionym medium RPMI 16/40.
- Określona ilość zawiesiny komórkowej jest przeniesiona do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie V.
- Płytka jest inkubowana w podgrzanym kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
- Dodaje się bufor fiksujący, aby ustawić płytkę do analizy.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na efektywną analizę ścieżek sygnalizacyjnych.
- Dostarcza wglądu w wpływ leków na sygnalizację komórkową.
- Rozwiązanie pojedynczych komórek zwiększa zrozumienie odpowiedzi komórkowych.
- Wyniki mogą prowadzić do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych.
Wnioski
- Mikroskopia przepływowa z fosfo-barwieniem jest cennym narzędziem do badania fosforylacyjnych zdarzeń białkowych.
- Protokół umożliwia analizę o wysokiej wydajności, czyniąc ją dostępną dla różnych zastosowań badawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie do eksploracji złożonych sieci sygnalizacyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Phospho flow cytometry with fluorescent cell barcoding enables medium- to high-throughput single-cell analysis of protein phosphorylation, supporting target validation and biomarker discovery in oncology and immunology. By quantifying drug-induced signaling changes at single-cell resolution, the method enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in therapeutic development. Its compatibility with standard cytometer hardware allows scalable integration into discovery workflows for pathway interrogation and pharmacodynamic assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring phosphorylation dynamics of signaling proteins downstream of receptors such as B cell receptor in disease-relevant cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiplexed detection of 20 signaling molecules in primary patient-derived cells under stimulated and inhibited conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying aberrant nodes like AKT pS473 and STAT3 pY705 that correlate with drug sensitivity and resistance mechanisms.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent cell barcoding allows pooling of multiple samples and conditions into a single tube, increasing throughput and reducing run-to-run variability on standard flow cytometers.
- Quantitative Output: Generates single-cell resolution data on phosphorylation levels, enabling dose-response analysis of kinase inhibitors such as idelalisib in CLL models.
- Platform Reuse: Standardized fixation, permeabilization, and antibody staining steps support adaptation across immune cell types and stimulation paradigms for longitudinal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary CLL patient cells to model signaling aberrations, providing a clinically relevant system for evaluating targeted therapies.
- Translational Continuity: Links ex vivo drug response to biomarker discovery by correlating pS473 reduction with IGVH mutation status, supporting patient stratification strategies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates reversal of aberrant signaling by PI3Kδ inhibition, validating target engagement and mechanism of action for kinase inhibitors in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical efficacy testing, particularly in immunology and oncology programs focused on signal transduction modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying stimulus-induced phosphorylation changes in primary human B cells, clarifying pathway activation states under basal and drug-treated conditions.
- Screening: Enables reproducible, multiplexed assessment of compound effects on signaling networks, with barcoding facilitating side-by-side comparison of doses, time points, and genetic backgrounds.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell phosphorylation readouts that allow statistical comparison of signaling states across conditions, supporting biomarker threshold setting and response classification.
- Translational Research: Connects in vitro drug response to ex vivo biomarker validation using primary CLL specimens, aligning with preclinical-to-clinical transition criteria.
- Enterprise Reuse: Standardized reagent panel and barcoding strategy allow reuse across projects studying cytokine signaling, antigen receptor activation, or drug mechanism in immune and malignant cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to downstream effector phosphorylation at single-cell resolution in heterogeneous primary cell samples.
- Operational Value: Standardized workflow with barcoding increases sample throughput, minimizes technical variance, and maximizes instrument utilization on existing flow cytometry platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target modulation and pathway inhibition, reducing investment in compounds with insufficient biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on target engagement and signaling normalization in disease-relevant human cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody titration, and phospho-specific reagent validation to ensure signal specificity and minimize background.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configuration for multiplexed phospho- and surface marker panels.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and washing steps across users and sites to maintain reproducibility of phosphorylation signals.
- Requires optimization of barcoding reagent concentrations to avoid spectral overlap and ensure accurate sample deconvolution during analysis.
- Limited to cells in suspension; adherence-dependent or tissue samples require prior dissociation to single-cell suspension using validated enzymatic or mechanical methods.
