Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów
4 października 2018
Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i immunologii, takie jak wpływ różnych bodźców lub leków na szlaki sygnałowe? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przeprowadzanie analizy sygnalizacji pojedynczej komórki w trybie średnio- i wysokoprzepustowym. Po ponownym zawieszeniu komórek w uzupełnionym podłożu RPMI 16/40, przenieś wymaganą ilość zawiesiny ogniw do studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V.
Przenieś płytkę do podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją tam na 10 minut. Następnie dodaj 60 mikrolitrów stałego buforu po jednym do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej, aby ustawić płytkę utrwalającą. Umieść tę płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przenieść próbkę kontrolną o pojemności 50 mikrolitrów na płytkę i mieszać, pipetując w górę i w dół. Opcjonalnie dodaj 10 mikrolitrów na mililitr anty-IgM do komórek, aby rozpocząć przebieg symulacji w czasie i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę o objętości 50 mikrolitrów na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym, mieszając każdą próbkę podczas jej dodawania.
Po dodaniu ostatniej próbki pozostawić płytkę utrwalającą w łaźni wodnej na 10 minut. Najpierw umyj komórki trzykrotnie PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.
Następnie należy przygotować świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych, pipetując pięć mikrolitrów każdego odczynnika do kodów kreskowych do każdej studzienki, wypełniając liczbę studzienek wymaganą do zabarwienia każdej z próbek. W stałej płytce komórkowej ponownie zawieś komórki w każdej studzience za pomocą 190 mikrolitrów PBS. Następnie przenieś każdą studzienkę komórek do odpowiedniego dołka na płytce z kodowaniem kreskowym, dokładnie mieszając każdą studzienkę.
Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 20 minut w ciemności. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie za pomocą płukania przepływowego.
Następnie dodaj 190 mikrolitrów płynu do każdej studzienki komórek. Połącz wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej 15-mililitrowej probówce i przenieś każdą kontrolę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.
Aby rozpocząć, przenieś dwa mililitry buforu trwałej ondulacji trzy do 15-mililitrowej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby po użyciu był lodowato zimny. Gdy będziesz gotowy, dodaj 1,5 mililitra lodowatego buforu do 15-mililitrowej probówki zawierającej populację komórek z kodem kreskowym kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.
Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu do trwałej ondulacji do każdej z kontrolek kompensacyjnych w ten sam sposób. Natychmiast przenieś komórki do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 30 minut. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia antygenem, wyjmij komórki z zamrażarki i przenieś je do pudełka z lodem.
Umyj komórki trzykrotnie nadmiarem płynnego płukania. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, tak aby na jedno barwienie przeciwciałami fosfologicznymi przypadało 25 mikrolitrów zawiesiny komórek.
Ponownie zawiesić elementy sterujące kompensacją w 200 mikrolitrach prania przepływowego. Aby rozpocząć przygotowywanie przeciwciał do barwienia, dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała swoistego dla fosfony, rozcieńczonego w płynnym płukaniu, do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 15 mikrolitrów markera powierzchniowego, rozcieńczonego w płynie do płukania i 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę.
Pozwól komórkom odpoczywać przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dwukrotnie umyj poplamione komórki myciem przepływowym. Wirować przy 500 razy G przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 mikrolitrach płynnego płukania. Następnie wykonaj analizę cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W prezentowanym protokole trójwymiarowe kodowanie kreskowe odbywa się poprzez połączenie trzech barwników do kodów kreskowych.
Poszczególne próbki są następnie dekonwolucyjne przez późniejsze bramkowanie na każdym odczynniku do kodów kreskowych w stosunku do obszaru rozproszonego bocznego. Podstawowe i indukowane stymulacją poziomy fosforylacji 20 cząsteczek sygnałowych za receptorem komórek B są następnie charakteryzowane w komórkach B od pacjentów z PBL i normalnych kontroli w różnych warunkach. Stat3 phospho tyrozyna 705 jest znacznie regulowana w górę.
Komórki są stymulowane anty-IgM przez okres do 30 minut w celu zidentyfikowania aberracji sygnałowych indukowanych przez szlak receptora komórek B. Podczas gdy komórki PBL od pacjentów z niezmutowanym IGVH wykazują zwiększoną wrażliwość na stymulację anty-IgM, jest to statystycznie istotne tylko dla AKT foseryny 473. Komórki są następnie poddawane działaniu inhibitora kinazy PI 3-delta, idelalizybu, w celu sprawdzenia, czy nieprawidłowy sygnał AKT pS473 można odwrócić.
Jak pokazano tutaj, nieprawidłowe poziomy są znacznie zmniejszone po leczeniu w sposób zależny od stężenia, co pokazuje, że inhibitory kinaz mogą być stosowane w celu normalizacji nieprawidłowej sygnalizacji w komórkach CLL. Przed przystąpieniem do tej procedury należy pamiętać o miareczkowaniu odczynników do kodów kreskowych i przeciwciał oraz o sprawdzeniu, czy wybrane markery powierzchniowe są kompatybilne z odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Komórki muszą być w zawiesinie do analizy luminoforowej, mimo to protokół można dostosować do nieprawidłowych komórek lub tkanek po procedurach w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, takiej jak cała trypzynacja.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym z wykorzystaniem fosfocytometrii przepływowej. Metoda ta jest skuteczna w charakteryzowaniu aberracji sygnalizacyjnych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz ocenie farmakodynamiki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Przekaźnictwo sygnałowe
Wstęp
- Cytometria przepływowa fosfo-białek umożliwia analizę sygnalizacji na poziomie pojedynczych komórek.
- Technika ta pozwala zbadać, w jaki sposób szlaki sygnalizacyjne są modulowane przez różne bodźce lub leki.
- Jest ona odpowiednia do analiz o średniej i wysokiej przepustowości.
- Metoda ta zwiększa możliwość badania odpowiedzi komórkowych na szczegółowym poziomie.
Cel badania
- Dostarczenie wiarygodnego protokołu analizy fosforylacji białek.
- Ułatwienie identyfikacji biomarkerów w sygnalizacji komórkowej.
- Ocena farmakodynamiki różnych metod leczenia.
Zastosowane metody
- Komórki resuspenduje się w suplementowanym medium RPMI 16/40.
- Określoną ilość zawiesiny komórkowej przenosi się do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.
- Płytkę inkubuje się w podgrzanej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
- Dodaje się bufor utrwalający, aby przygotować płytkę do utrwalenia w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywną analizę szlaków sygnałowych.
- Pozwala ona na uzyskanie wiedzy na temat wpływu leków na sygnalizację komórkową.
- Rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek poprawia zrozumienie odpowiedzi komórkowych.
- Wyniki mogą prowadzić do zidentyfikowania potencjalnych celów terapeutycznych.
Wnioski
- Cytometria przepływowa z analizą fosforylacji białek jest cennym narzędziem do badania fosforylacji białek.
- Protokół ten umożliwia analizę wysokoprzepustową, co sprawia, że jest on dostępny dla różnorodnych zastosowań badawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu eksploracji złożonych sieci sygnalizacyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Cytometria przepływowa fosfo-białek z wykorzystaniem fluorescencyjnego kodowania komórek umożliwia analizę fosforylacji białek na poziomie pojedynczych komórek z wydajnością od średniej do wysokiej, wspierając walidację celów oraz odkrywanie biomarkerów w onkologii i immunologii. Poprzez ilościowe określanie zmian w sygnalizacji indukowanych przez leki w rozdzielczości pojedynczej komórki, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu rozwoju terapii. Jej kompatybilność ze standardowym sprzętem cytometrycznym pozwala na skalowalną integrację z procesami odkrywczymi w zakresie badania szlaków sygnałowych i oceny farmakodynamicznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar dynamiki fosforylacji białek sygnałowych znajdujących się poniżej receptorów, takich jak receptor komórek B, w komórkach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez multipleksową detekcję 20 cząsteczek sygnałowych w pierwotnych komórkach pochodzących od pacjentów w warunkach stymulacji i inhibicji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację aberrantnych węzłów, takich jak AKT pS473 i STAT3 pY705, które korelują z wrażliwością na leki oraz mechanizmami oporności.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość testu: Fluorescencyjne kodowanie komórek umożliwia łączenie wielu próbek i warunków w jednej probówce, co zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność między pomiarami na standardowych cytometrach przepływowych.
- Wynik ilościowy: Generuje dane o poziomie fosforylacji z rozdzielczością pojedynczych komórek, co pozwala na analizę zależności dawka-odpowiedź w przypadku inhibitorów kinaz, takich jak idelalisib, w modelach CLL.
- Wielokrotne wykorzystanie platformy: Zestandaryzowane etapy fiksacji, permeabilizacji i barwienia przeciwciał umożliwiają adaptację metody do różnych typów komórek odpornościowych i paradygmatów stymulacji w ramach podłużnych kampanii przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykorzystuje pierwotne komórki pacjentów z CLL do modelowania aberracji sygnałowych, zapewniając system istotny klinicznie do oceny terapii celowanych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odpowiedź na lek ex vivo z odkrywaniem biomarkerów poprzez korelację redukcji pS473 ze statusem mutacji IGVH, co wspiera strategie stratyfikacji pacjentów.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykazuje odwrócenie aberracyjnego przesyłania sygnałów poprzez inhibicję PI3Kδ, walidując zaangażowanie celu i mechanizm działania inhibitorów kinazy w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, obejmujący etapy od wczesnej walidacji celu, poprzez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, szczególnie w programach z zakresu immunologii i onkologii skoncentrowanych na modulatorach transdukcji sygnału.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ilościowe określanie zmian w fosforylacji indukowanej bodźcem w pierwotnych ludzkich limfocytach B, wyjaśniając stany aktywacji szlaków w warunkach podstawowych oraz po podaniu leku.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalną, multipleksową ocenę wpływu związków na sieci sygnalizacyjne, przy czym kodowanie kreskowe ułatwia bezpośrednie porównywanie dawek, punktów czasowych oraz tła genetycznego.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty fosforylacji na poziomie pojedynczych komórek, co pozwala na statystyczne porównanie stanów sygnalizacji w różnych warunkach, wspierając ustalanie progów dla biomarkerów i klasyfikację odpowiedzi.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedź na lek in vitro z walidacją biomarkerów ex vivo z wykorzystaniem pierwotnych próbek CLL, zgodnie z kryteriami przejścia z fazy przedklinicznej do klinicznej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzowany panel reagentów i strategia kodowania kreskowego pozwalają na ponowne wykorzystanie w projektach badających sygnalizację cytokin, aktywację receptorów antygenowych lub mechanizm działania leków w populacjach komórek odpornościowych i nowotworowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie stymulacji receptora z fosforylacją efektorów w dole kaskady z rozdzielczością pojedynczych komórek w heterogenicznych próbkach pierwotnych komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany proces z wykorzystaniem kodowania kreskowego zwiększa przepustowość próbek, minimalizuje wariancję techniczną i maksymalizuje wykorzystanie aparatury na istniejących platformach cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych dowodów na modulację celu i inhibicję szlaku, co zmniejsza nakłady inwestycyjne w związki o niewystarczającej aktywności biologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków wiodących z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zaangażowanie celu i normalizację sygnalizacji w ludzkich komórkach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w zakresie cytometrii przepływowej, miareczkowania przeciwciał oraz walidacji odczynników specyficznych dla grup fosforowych, aby zapewnić specyficzność sygnału i zminimalizować tło.
- Metoda zależy od dostępu do cytometrów przepływowych z odpowiednią konfiguracją laserów i detektorów dla multipleksowych paneli markerów powierzchniowych i fosfo-markerów.
- Konieczna jest standaryzacja etapów fiksacji, permeabilizacji i przemywania pomiędzy użytkownikami i ośrodkami w celu utrzymania powtarzalności sygnałów fosforylacji.
- Wymagana jest optymalizacja stężeń odczynników do kodowania kreskowego (barcoding), aby uniknąć nakładania się widm i zapewnić dokładną dekonwolucję próbek podczas analizy.
- Metoda jest ograniczona do komórek w zawiesinie; próbki tkanek lub komórek adherentnych wymagają uprzedniej dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu zwalidowanych metod enzymatycznych lub mechanicznych.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Preparation, Stimulation, and Fixation of Cells
1:50
Fluorescent Cell Barcoding
3:30
Cell Permeabilization and Intracellular Antigen Staining
6:12
Results: Phospho Flow Cytometry Analysis with Fluorescent Cell Barcoding
8:02
Conclusion
