Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i immunologii, takie jak wpływ różnych bodźców lub leków na szlaki sygnałowe? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przeprowadzanie analizy sygnalizacji pojedynczej komórki w trybie średnio- i wysokoprzepustowym. Po ponownym zawieszeniu komórek w uzupełnionym podłożu RPMI 16/40, przenieś wymaganą ilość zawiesiny ogniw do studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V.

Przenieś płytkę do podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją tam na 10 minut. Następnie dodaj 60 mikrolitrów stałego buforu po jednym do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej, aby ustawić płytkę utrwalającą. Umieść tę płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieść próbkę kontrolną o pojemności 50 mikrolitrów na płytkę i mieszać, pipetując w górę i w dół. Opcjonalnie dodaj 10 mikrolitrów na mililitr anty-IgM do komórek, aby rozpocząć przebieg symulacji w czasie i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę o objętości 50 mikrolitrów na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym, mieszając każdą próbkę podczas jej dodawania.

Po dodaniu ostatniej próbki pozostawić płytkę utrwalającą w łaźni wodnej na 10 minut. Najpierw umyj komórki trzykrotnie PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.

Następnie należy przygotować świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych, pipetując pięć mikrolitrów każdego odczynnika do kodów kreskowych do każdej studzienki, wypełniając liczbę studzienek wymaganą do zabarwienia każdej z próbek. W stałej płytce komórkowej ponownie zawieś komórki w każdej studzience za pomocą 190 mikrolitrów PBS. Następnie przenieś każdą studzienkę komórek do odpowiedniego dołka na płytce z kodowaniem kreskowym, dokładnie mieszając każdą studzienkę.

Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 20 minut w ciemności. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie za pomocą płukania przepływowego.

Następnie dodaj 190 mikrolitrów płynu do każdej studzienki komórek. Połącz wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej 15-mililitrowej probówce i przenieś każdą kontrolę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.

Aby rozpocząć, przenieś dwa mililitry buforu trwałej ondulacji trzy do 15-mililitrowej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby po użyciu był lodowato zimny. Gdy będziesz gotowy, dodaj 1,5 mililitra lodowatego buforu do 15-mililitrowej probówki zawierającej populację komórek z kodem kreskowym kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.

Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu do trwałej ondulacji do każdej z kontrolek kompensacyjnych w ten sam sposób. Natychmiast przenieś komórki do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 30 minut. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia antygenem, wyjmij komórki z zamrażarki i przenieś je do pudełka z lodem.

Umyj komórki trzykrotnie nadmiarem płynnego płukania. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, tak aby na jedno barwienie przeciwciałami fosfologicznymi przypadało 25 mikrolitrów zawiesiny komórek.

Ponownie zawiesić elementy sterujące kompensacją w 200 mikrolitrach prania przepływowego. Aby rozpocząć przygotowywanie przeciwciał do barwienia, dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała swoistego dla fosfony, rozcieńczonego w płynnym płukaniu, do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 15 mikrolitrów markera powierzchniowego, rozcieńczonego w płynie do płukania i 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę.

Pozwól komórkom odpoczywać przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dwukrotnie umyj poplamione komórki myciem przepływowym. Wirować przy 500 razy G przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 mikrolitrach płynnego płukania. Następnie wykonaj analizę cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W prezentowanym protokole trójwymiarowe kodowanie kreskowe odbywa się poprzez połączenie trzech barwników do kodów kreskowych.

Poszczególne próbki są następnie dekonwolucyjne przez późniejsze bramkowanie na każdym odczynniku do kodów kreskowych w stosunku do obszaru rozproszonego bocznego. Podstawowe i indukowane stymulacją poziomy fosforylacji 20 cząsteczek sygnałowych za receptorem komórek B są następnie charakteryzowane w komórkach B od pacjentów z PBL i normalnych kontroli w różnych warunkach. Stat3 phospho tyrozyna 705 jest znacznie regulowana w górę.

Komórki są stymulowane anty-IgM przez okres do 30 minut w celu zidentyfikowania aberracji sygnałowych indukowanych przez szlak receptora komórek B. Podczas gdy komórki PBL od pacjentów z niezmutowanym IGVH wykazują zwiększoną wrażliwość na stymulację anty-IgM, jest to statystycznie istotne tylko dla AKT foseryny 473. Komórki są następnie poddawane działaniu inhibitora kinazy PI 3-delta, idelalizybu, w celu sprawdzenia, czy nieprawidłowy sygnał AKT pS473 można odwrócić.

Jak pokazano tutaj, nieprawidłowe poziomy są znacznie zmniejszone po leczeniu w sposób zależny od stężenia, co pokazuje, że inhibitory kinaz mogą być stosowane w celu normalizacji nieprawidłowej sygnalizacji w komórkach CLL. Przed przystąpieniem do tej procedury należy pamiętać o miareczkowaniu odczynników do kodów kreskowych i przeciwciał oraz o sprawdzeniu, czy wybrane markery powierzchniowe są kompatybilne z odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Komórki muszą być w zawiesinie do analizy luminoforowej, mimo to protokół można dostosować do nieprawidłowych komórek lub tkanek po procedurach w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, takiej jak cała trypzynacja.