Name: Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj fosfomorfometrię przepływową do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów. Ta metoda umożliwia badanie fosforylacji białek w skali średniej i wysokiej przepustowości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przeprowadzona w laboratorium profesora Kjetila Taskéna i była wspierana przez Norweskie Towarzystwo Onkologiczne i Stiftelsen Kristiana Gerharda Jebsena. Johannes Landskron i Marianne Enger zostali docenieni za krytyczną lekturę rękopisu.

Próbki krwi otrzymano po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody od wszystkich dawców. Badanie zostało zatwierdzone przez Regionalny Komitet ds. Etyki Badań Medycznych i Zdrowotnych w Norwegii Południowo-Wschodniej, a badania nad ludzką krwią przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską8.
UWAGA: Kroki 1-3 powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej.
1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z próbek krwi pacjenta z PBL
UWAGA: Krew ludzka powinna być traktowana zgodnie z przepisami dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,1 mM Na2HPO4 x 2H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) i przenieść do probówek o pojemności 50 ml (30 ml / probówkę).</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć 10 ml pożywki o gradiencie gęstości (np. Lymphoprep) na dno probówki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. PBMC są teraz widoczne na wierzchu warstwy medium o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura przenieś komórki do dwóch nowych probówek o pojemności 50 ml. Umyj dwukrotnie PBS (napełnij tubki).</li>
	<li>Wirować przy 350 x g przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml PBS.</li>
	<li>Policz komórki przy użyciu preferowanej metody.</li>
	<li>Odwirować komórki przy stężeniu 350 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. UWAGA: Kroki od 1.8 do 3.2 są opcjonalne. Możliwe jest bezpośrednie przejście do kroku 3.3.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i zamrozić w odpowiednich porcjach za pomocą krioprobówek. 
	nuta: DMSO jest toksyczny dla komórek. Pracuj szybko po zmieszaniu komórek z FBS/DMSO. Komórki mogą być przechowywane przez długi czas w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie komórek
<ol>
	<li>Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	nuta: DMSO jest toksyczny dla komórek. Pracuj szybko, aby ograniczyć narażenie na DMSO.</li>
	<li>Umyj komórki raz 10 ml zimnego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 z dodatkowym GlutaMAX, patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej pirogronianem sodu, aminokwasami endogennymi MEM i penicyliną/streptomycyną (dodawaną w 1x rozcieńczeniu zgodnie z instrukcją) i 10% FBS. Przenieść komórki do małej kolby do hodowli komórkowej i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C na 1 godzinę, aby umożliwić kalibrację komórek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Policz żywe komórki przy użyciu preferowanej metody.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI 1640 (krok 2.2) uzupełnionej 1% FBS do nie więcej niż 50 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść wymaganą ilość zawiesiny komórek do studzienek w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V. 
	nuta: Liczba studzienek odpowiada liczbie warunków, które mają zostać przetestowane. Próbki do przebiegu stymulacji w czasie pobiera się z jednej studzienki. Obliczyć 50 μl próbki na punkt czasowy + 50 μl objętości martwej. Zachowaj próbki do kontroli kompensacji (jedna próbka niebarwiona + jedna próbka na barwnik do kodów kreskowych).</li>
	<li>Przenieść płytkę 96-dołkową do wstępnie podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odpocznij komórki przez 10 minut.</li>
</ol>
4. Stymulacja i utrwalanie komórek
UWAGA: Wykonaj kroki 4-8 na stole laboratoryjnym (tzn. nie sterylnie).
UWAGA: Głównym składnikiem Fix Buffer I jest paraformaldehyd, który jest toksyczny (wdychanie i kontakt ze skórą). Obchodź się ostrożnie.
<ol>
	<li>Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z 60 μl buforu fix I na studzienkę na próbkę. Pozostawić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	nuta: Komórki: Napraw bufor powinien mieć wartość 1:1. Aby umożliwić odparowanie w temperaturze 37 °C, bufor Fix jest początkowo dostępny w dużych ilościach.</li>
	<li>Opcjonalnie potraktuj komórki lekami przed stymulacją.</li>
	<li>Przenieść próbkę kontrolną o objętości 50 μl na płytkę utrwalającą. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Opcjonalnie rozpocznij przebieg stymulacji od dodania 10 μg/ml anty-IgM do komórek. Mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść próbkę o objętości 50 μl na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym. Mieszać pipetując w górę i w dół. 
	nuta: Sygnalizacja indukowana przez anty-IgM jest zwykle inicjowana wcześnie (minuty).</li>
	<li>Pozostawić płytkę utrwalającą w temperaturze 37 °C na 10 minut po dodaniu ostatniej próbki.</li>
</ol>
5. Fluorescencyjne kody kreskowe komórek (FCB)
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zobaczyć listę odczynników do kodów kreskowych.
<ol>
	<li>Umyj stałe komórki 3x PBS (napełnij studzienki).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych. Odpipetować 5 μl każdego odczynnika do kodów kreskowych na studzienkę w liczbie kombinacji wymaganych do wybarwienia wszystkich próbek zgodnie z matrycą barwienia, np. w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Każda próbka będzie miała unikalną kombinację różnych stężeń kodów kreskowych.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 190 μl PBS i przenieść na płytkę z kodami kreskowymi. Dokładnie wymieszaj. 
	nuta: Wybarwić jedną próbkę kompensacyjną o najwyższym stężeniu końcowym stosowanym dla każdego odczynnika do kodów kreskowych i zachować jedną niebarwioną próbkę.</li>
	<li>Pozostaw komórki na 20 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Przepłukać wybarwione komórki 2x płukaniem przepływowym (PBS, 1% FBS, 0,09% azydku sodu) (napełnić studzienki).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 190 μl płynu do płukania do komórek i połączyć próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej probówce o pojemności 15 ml. Przenieś każdą kontrolkę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
</ol>
6. Przepuszczalność komórek do wewnątrzkomórkowego barwienia antygenów
UWAGA: Głównym składnikiem Perm Buffer III jest metanol, który jest toksyczny (wdychanie i kontakt ze skórą) i łatwopalny. Obchodź się ostrożnie.
<ol>
	<li>Przenieść 2 ml buforu do trwałej ondulacji III do probówki o pojemności 15 ml. Pozostawić w temperaturze -20 °C, aby po użyciu była lodowata. 
	nuta: Bufor do trwałej ondulacji można pozostawić w temperaturze -20 °C od początku eksperymentu.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml lodowatego buforu do populacji komórek z kodem kreskowym (w probówce o pojemności 15 ml) i 100 μl do każdej kontroli kompensacyjnej (w probówkach o pojemności 1,7 ml) kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki bezpośrednio do temperatury -80 °C. Pozostawić na minimum 30 min. 
	nuta: Naturalne jest, że w tym momencie przerywa się eksperyment. Komórki w buforze Perm mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Barwienie przeciwciał
UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać listę zgłoszonych przeciwciał specyficznych dla fosfonu.
<ol>
	<li>Przenieść komórki z temperatury -80 °C do pojemnika z lodem.</li>
	<li>Mycie 3x z flow wash. 
	nuta: Ważne jest, aby dodać płukanie przepływowe w nadmiarze, aby zobaczyć osad komórek, np. dodać 3 ml płukania przepływowego do populacji komórek z kodem kreskowym i 1 ml do każdej kontroli kompensacji.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, co pozwala na 25 μl zawiesiny komórek na barwienie przeciwciałami fosfologicznymi. Zawiesić regulatory kompensacji w 200 μl płukania przepływowego.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała do barwienia w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V. Ostateczna objętość wyniesie 50 μl/studzienkę. Na basenik dodać przeciwciało specyficzne dla fosfologii rozcieńczone w płukaniu przepływowym do końcowej objętości 10 μl, marker powierzchniowy rozcieńczony w płukaniu przepływowym do końcowej objętości 15 μl i 25 μl zawiesiny komórkowej. 
	nuta: Rozcieńczenia przeciwciał należy miareczkować przed eksperymentem. Uwzględnij kontrolę izotypu.</li>
	<li>Pozostaw komórki na 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Umyj poplamione komórki 2x płukaniem przepływowym (napełnij studzienki).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 150 μl płukania przepływowego.</li>
</ol>
8. Przygotowanie kontroli kompensacji
<ol>
	<li>Przygotować kontrole kompensacyjne dla fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami równolegle z barwieniem przeciwciał. Użyj koralików kompensacyjnych zgodnie z instrukcjami sprzedawcy.</li>
</ol>
9. Analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić na cytometrze przepływowym z próbnikiem o wysokiej przepustowości (HTS).
<ol>
	<li>Zoptymalizuj napięcie lampy fotopowielacza (PMT) za pomocą niezabarwionego sterowania.</li>
	<li>Uruchom kontrolki wynagrodzeń i oblicz macierz wynagrodzeń.</li>
	<li>Uruchamianie próbek. Częstotliwość zdarzeń powinna być zgodna ze specyfikacją instrumentu.</li>
</ol>
10. Strategia bramkowania i analiza danych
<ol>
	<li>Zaimportuj pliki FCS z eksperymentu do oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, takiego jak FlowJo lub Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).</li>
	<li>Strategia bramkowania
	<ol>
		<li>Wybierz limfocyty, wykreślając SSC-A i FSC-A na wykresie kropkowym gęstości.</li>
		<li>Wyświetl limfocyty i wybierz podkoszulki, wykreślając SSC-A w stosunku do FSC -W.</li>
		<li>Wyświetl pojedyncze komórki i bramkuj typ komórki, wykreślając SSC-A w stosunku do znacznika powierzchni.</li>
		<li>Wyświetl populację typów komórek na wykresie gęstości Pacific Blue w porównaniu z SSC-A i wybierz różne populacje FCB na podstawie ich intensywności barwienia Pacific Blue (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Wykreśl kanał przeciwciała fosfo względem kanału FCB lub jako mapę cieplną (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A), aby wyświetlić zdarzenia fosforylacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz fosfosygnały za pomocą odwrotnego sinusa hiperbolicznego (arcsinh) MFI (mediana intensywności fluorescencji) kontroli sygnału fosfo w porównaniu z izotypem (podstawowe poziomy fosforylacji, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1D) lub populacji komórek stymulowanych i niestymulowanych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
<li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li>
<li>Parente-Ribes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+tyrosine+kinase+inhibitors+reduce+CD40L-induced+proliferation+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+but+not+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells.</a> Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).</li>
<li>Blix, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-specific+flow+cytometry+identifies+aberrant+signaling+in+indolent+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma.</a> BMC Cancer. 12, 478(2012).</li>
<li>Irish, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+potentiated+phospho-protein+networks+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells.</a> Cell. 118 (2), 217-228 (2004).</li>
<li>Myklebust, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+B-cell+receptor+signaling+in+non-Hodgkin+lymphomas+identified+by+single-cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling.</a> Blood. 129 (6), 759-770 (2017).</li>
<li>World Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Medical+Association+Declaration+of+Helsinki%3A+ethical+principles+for+medical+research+involving+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22THE+JOURNAL+OF+THE+AMERICAN+MEDICAL+ASSOCIATION%22%5BJournal%5D)">World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects.</a> THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).</li>
<li>Siveen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+STAT3+signaling+pathway+in+cancer%3A+role+of+synthetic+and+natural+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).</li>
<li>Fabbri, G., Dalla-Favera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+pathogenesis+of+chronic+lymphocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).</li>
<li>Arnason, J. E., Brown, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+B+Cell+Signaling+in+Chronic+Lymphocytic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).</li>
<li>Landskron, J., Tasken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+Detection+by+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Pollheimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+drives+a+proinflammatory+endothelial+activation+that+selectively+targets+nonquiescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).</li>
<li>Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsphere+cytometry+to+interrogate+microenvironment-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).</li>
<li>Lin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+phospho-specific+flow+cytometry+can+detect+dynamic+changes+of+phospho-Stat1+level+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells.</a> Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Fosfochromatyczna cytometria przepływowa jest potężną techniką pomiaru poziomu fosforylacji białek w pojedynczych komórkach. Ponieważ metoda opiera się na barwieniu przeciwciałami, fosfoprzepływowa cytometria jest ograniczona dostępnością przeciwciał. Ponadto, w celu uzyskania wiarygodnych wyników, wszystkie przeciwciała powinny być miareczkowane i weryfikowane przed użyciem. Szczegółowy protokół miareczkowania przeciwciał swoistych dla fosfo został opisany w innym miejscu12. Podczas projektowania...

Fosfochromatyczna cytometria przepływowa jest używana do analizy poziomów fosforylacji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ogólnym celem metody jest mapowanie wzorców sygnalizacji komórkowej w określonych warunkach. Wykorzystując wieloparametrową zdolność cytometrii przepływowej, można jednocześnie analizować kilka szlaków sygnałowych w różnych podzbiorach niejednorodnej populacji komórek, takich jak krew obwodowa. Cechy te mają przewagę nad innymi technologiami opartymi na przeciwciałach, takimi jak immunohistochemia, test immunoenzymatyczny (ELISA), macierz białkowa i macierz białek z odwróconymi fazami (RPPA)1. Fosfomorfometria przepływowa może być połączona z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek (FCB), co oznacza, że poszczególne próbki komórek są znakowane unikalnymi sygnaturami barwników fluorescencyjnych, dzięki czemu można je mieszać ze sobą, barwić i analizować jako pojedynczą próbkę2. Zmniejsza to zużycie przeciwciał, zwiększa odporność danych dzięki połączeniu próbek kontrolnych i poddanych działaniu substancji oraz zwiększa szybkość akwizycji. Połączoną populację FCB można następnie podzielić na mniejsze próbki i wybarwić maksymalnie 35 różnymi przeciwciałami specyficznymi dla fosfo, w zależności od ilości materiału wyjściowego. W związku z tym duże eksperymenty profilowania można przeprowadzać przy użyciu standardowego sprzętu cytometrycznego. Fosfo cytometria przepływowa została zastosowana do profilowania szlaków sygnałowych w próbkach pacjentów z kilku nowotworów hematologicznych, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL)3,4,5, ostra białaczka szpikowa (AML)6 i chłoniaki nieziarnicze7. Fosfo-przepływowa cytometria jest zatem skutecznym podejściem do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.
Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół analizy próbek pacjentów z PBL za pomocą fosfocymetrii przepływowej (Rysunek 1A). Przedstawiono przykłady charakterystyki sygnalizacji podstawowej, stymulacji receptora komórek anty-IgM/B i zaburzeń działania leków. Znajduje się tam szczegółowy opis matrycy FCB. Protokół można łatwo dostosować do innych typów komórek zawiesinowych.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>Medium gradientu gęstości</td></tr><tr><td>Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>Do stymulacji receptora komórek B</td></tr><tr><td>BD Phosflow Fix Buffer I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>Bufor utrwalający</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm Buffer III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>Bufor permeabilizacyjny</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>Odczynnik do kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Pacific Blue Succinimidyl Ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>Odczynnik do kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidylowy, sól trietyloamonowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>Odczynnik do kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Koraliki kompensacyjne</td><td>Zdefiniowane przez użytkownika</td><td></td><td>Prawidłowe gatunki reaktywność</td></tr><tr><td>Probówki Falcon<</td><td>em>Zdefiniowane przez użytkownika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Zdefiniowane przez użytkownika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V</td><td>Zdefiniowane przez użytkownika</td><td></td><td>Kompatybilne z cytometrem przepływowym</td></tr><tr><td>Wirówki</td><td>Zdefiniowane przez użytkownika</td><td></td><td>Do probówek Eppendorf, probówek Falcon i płytek</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Zdefiniowany przez użytkownika</td><td></td>Cytometr przepływowy <td>z regulacją temperatury</td></tr><tr><td></td><td>Zdefiniowany przez użytkownika</td><td></td><td>Z próbnikiem o wysokiej przepustowości (HTS)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Antygen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4075</td><td>Clone: D9E Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone: F-1 Odniesienie: Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone: J117-1278 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Redukcja inhibitorów kinazy tyrozynowej śledziony&hellip;, Hematologica, 101(2):e59-62 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust i wsp., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>Clone: N35-86 Odniesienie: Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td>Klon: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Odniesienie: Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>Clone: 24a/BTK (Y551)&nbsp; Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce&hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta; (pY142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td>Clone: K25-407.69 Reference: Sk&aring; nland i in., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>9716</td><td>Clone: D2C8 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa; B&alfa;</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>5743</td><td>Clone: L35A5 Odniesienie: Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>Klon: I58-1169 Odniesienie: Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone: 4/LCK-Y505&nbsp; Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>Clone: J114-64 Źródło: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa; B p65 (pS536)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4887</td><td>Klon: 93H1 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>4552</td><td>Clone: 28B10 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland i in., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4375</td><td>Clone: E10 Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Inhibitory kinazy tyrozynowej śledziony reduce&hellip;, Hematologica, 101(2):e59-62 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer i wsp., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>NN</td><<td>silny>klon:</silny> 16G8 <silny>Odniesienie:</silny> Irish i in., 2007, duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2&hellip;, Krew, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2&hellip;, Krew, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>NN</td><<td>strong>Clone: Poliklonalny <silny>Odniesienie:</silny> Irish i wsp., 2007, duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2&hellip;, Krew, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>NN</td><<td>strong>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplikacja i nadekspresja Bcl-2&hellip;, Krew, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>NN</td><td>Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Duplikacja Flt3 Y591 i nadekspresja Bcl-2&hellip;, Krew, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma; 2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>Klon: K86-689.37 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>Klon: J112-906 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Zakrzep tętniczy Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4851</td><td>klon: D57.2.2E Reference: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>9257</td><td>Clone: G9 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer i in., 2013, Interleukina-33 napędza prozapalny śródbłonek&hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>klon: J141-668.36.58&nbsp; Indeks: Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja limfocytów T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone: 4a&nbsp; Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>Klon: 4/P-STAT3 Odniesienie: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Klon: Poliklonalny <silny>Referencyjny:</silny> Uzel i wsp., 2001, Wykrywanie wewnątrzkomórkowego fosforylowanego STAT-4 za pomocą cytometrii przepływowej, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold i in., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust i in., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>Clone: 18/P-Stat6 Odniesienie: Myhrvold i wsp., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfobiałka w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>12081</td><td>Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Profilowanie pojedynczych komórek poziomów fosfoprotein w.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes i wsp., 2016, Redukcja inhibitorów kinazy tyrozynowej śledziony&hellip;, Hematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Sk&aring; nland i wsp., 2014, Kostymulacja komórek T przez CD2 i CD28&hellip;, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland i wsp., 2012, Modulacja sygnalizacji proksymalnej w normalnych i przekształconych&hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust i wsp., 2017, Wyraźne wzorce sygnalizacji receptora komórek B w&hellip;, Krew, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Nieprawidłowa sygnalizacja komórkowa odgrywa kluczową rolę w rozwoju i progresji raka. Większość nowatorskich terapii celowanych jest rzeczywiście ukierunkowana na białka i funkcje białek, a aberracje sygnalizacji komórkowej mogą zatem służyć jako biomarkery wskazujące spersonalizowane opcje leczenia. W przeciwieństwie do analiz DNA i RNA, zmiany w aktywności białek mogą skuteczniej oceniać mechanizmy leżące u podstaw wrażliwości i oporności na leki. Fosfo cytometria przepływowa to potężna technika, która mierzy zdarzenia fosforylacji białek na poziomie komórkowym, co jest ważną cechą, która odróżnia tę metodę od innych podejść opartych na przeciwciałach. Metoda pozwala na jednoczesną analizę wielu białek sygnałowych. W połączeniu z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek, większe zestawy danych o średniej i wysokiej przepustowości mogą być pozyskiwane przez standardowy sprzęt cytometryczny w krótkim czasie. Fosfo cytometria przepływowa ma zastosowanie zarówno w badaniach biologii podstawowej, jak i w badaniach klinicznych, w tym w analizie sygnalizacji, odkrywaniu biomarkerów i ocenie farmakodynamiki. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny do analizy przepływu fosfo oczyszczonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, na przykładzie komórek przewlekłej białaczki limfocytowej.

Główne etapy protokołu fosfo-cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 1A. W prezentowanym przykładzie komórki CLL zabarwiono odczynnikiem do kodowania kreskowego Pacific Blue w czterech rozcieńczeniach. Trójwymiarowe kodowanie kreskowe można przeprowadzić poprzez połączenie trzech barwników kodujących, co zilustrowano na Rysunku 1B. Poszczególne próbki są następnie dekonwolwowane poprzez następujące bramkowanie każdego od...

Tutaj przedstawiono protokół średnio- i wysokoprzepustowej analizy zdarzeń fosforylacji białek na poziomie komórkowym. Fosfomorfometria przepływowa to potężne podejście do charakteryzowania aberracji sygnałowych, identyfikacji i walidacji biomarkerów oraz oceny farmakodynamiki.

Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i immunologii, takie jak wpływ różnych bodźców lub leków na szlaki sygnałowe? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na przeprowadzanie analizy sygnalizacji pojedynczej komórki w trybie średnio- i wysokoprzepustowym. Po ponownym zawieszeniu komórek w uzupełnionym podłożu RPMI 16/40, przenieś wymaganą ilość zawiesiny ogniw do studzienek 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V.Przenieś płytkę do podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozostaw ją tam na 10 minut. Następnie dodaj 60 mikrolitrów stałego buforu po jednym do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej, aby ustawić płytkę utrwalającą. Umieść tę płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Przenieść próbkę kontrolną o pojemności 50 mikrolitrów na płytkę i mieszać, pipetując w górę i w dół. Opcjonalnie dodaj 10 mikrolitrów na mililitr anty-IgM do komórek, aby rozpocząć przebieg symulacji w czasie i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę o objętości 50 mikrolitrów na płytkę utrwalającą w każdym punkcie czasowym, mieszając każdą próbkę podczas jej dodawania.Po dodaniu ostatniej próbki pozostawić płytkę utrwalającą w łaźni wodnej na 10 minut. Najpierw umyj komórki trzykrotnie PBS. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.Następnie należy przygotować świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z odczynnikami do kodów kreskowych, pipetując pięć mikrolitrów każdego odczynnika do kodów kreskowych do każdej studzienki, wypełniając liczbę studzienek wymaganą do zabarwienia każdej z próbek. W stałej płytce komórkowej ponownie zawieś komórki w każdej studzience za pomocą 190 mikrolitrów PBS. Następnie przenieś każdą studzienkę komórek do odpowiedniego dołka na płytce z kodowaniem kreskowym, dokładnie mieszając każdą studzienkę.Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 20 minut w ciemności. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie za pomocą płukania przepływowego.Następnie dodaj 190 mikrolitrów płynu do każdej studzienki komórek. Połącz wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej 15-mililitrowej probówce i przenieś każdą kontrolę kompensacyjną do oddzielnej probówki o pojemności 1,7 mililitra. Wirować w temperaturze 500 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant.Aby rozpocząć, przenieś dwa mililitry buforu trwałej ondulacji trzy do 15-mililitrowej probówki. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby po użyciu był lodowato zimny. Gdy będziesz gotowy, dodaj 1,5 mililitra lodowatego buforu do 15-mililitrowej probówki zawierającej populację komórek z kodem kreskowym kroplami podczas wirowania, aby uniknąć zlepiania się komórek.Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu do trwałej ondulacji do każdej z kontrolek kompensacyjnych w ten sam sposób. Natychmiast przenieś komórki do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na minimum 30 minut. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia antygenem, wyjmij komórki z zamrażarki i przenieś je do pudełka z lodem.Umyj komórki trzykrotnie nadmiarem płynnego płukania. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić populację komórek z kodem kreskowym w objętości płukania przepływowego, tak aby na jedno barwienie przeciwciałami fosfologicznymi przypadało 25 mikrolitrów zawiesiny komórek.Ponownie zawiesić elementy sterujące kompensacją w 200 mikrolitrach prania przepływowego. Aby rozpocząć przygotowywanie przeciwciał do barwienia, dodaj 10 mikrolitrów przeciwciała swoistego dla fosfony, rozcieńczonego w płynnym płukaniu, do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 15 mikrolitrów markera powierzchniowego, rozcieńczonego w płynie do płukania i 25 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów na studzienkę.Pozwól komórkom odpoczywać przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dwukrotnie umyj poplamione komórki myciem przepływowym. Wirować przy 500 razy G przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 mikrolitrach płynnego płukania. Następnie wykonaj analizę cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W prezentowanym protokole trójwymiarowe kodowanie kreskowe odbywa się poprzez połączenie trzech barwników do kodów kreskowych.Poszczególne próbki są następnie dekonwolucyjne przez późniejsze bramkowanie na każdym odczynniku do kodów kreskowych w stosunku do obszaru rozproszonego bocznego. Podstawowe i indukowane stymulacją poziomy fosforylacji 20 cząsteczek sygnałowych za receptorem komórek B są następnie charakteryzowane w komórkach B od pacjentów z PBL i normalnych kontroli w różnych warunkach. Stat3 phospho tyrozyna 705 jest znacznie regulowana w górę.Komórki są stymulowane anty-IgM przez okres do 30 minut w celu zidentyfikowania aberracji sygnałowych indukowanych przez szlak receptora komórek B. Podczas gdy komórki PBL od pacjentów z niezmutowanym IGVH wykazują zwiększoną wrażliwość na stymulację anty-IgM, jest to statystycznie istotne tylko dla AKT foseryny 473. Komórki są następnie poddawane działaniu inhibitora kinazy PI 3-delta, idelalizybu, w celu sprawdzenia, czy nieprawidłowy sygnał AKT pS473 można odwrócić.Jak pokazano tutaj, nieprawidłowe poziomy są znacznie zmniejszone po leczeniu w sposób zależny od stężenia, co pokazuje, że inhibitory kinaz mogą być stosowane w celu normalizacji nieprawidłowej sygnalizacji w komórkach CLL. Przed przystąpieniem do tej procedury należy pamiętać o miareczkowaniu odczynników do kodów kreskowych i przeciwciał oraz o sprawdzeniu, czy wybrane markery powierzchniowe są kompatybilne z odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Komórki muszą być w zawiesinie do analizy luminoforowej, mimo to protokół można dostosować do nieprawidłowych komórek lub tkanek po procedurach w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, takiej jak cała trypzynacja.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

W tym filmie pokazujemy interakcję między białkami a sztucznymi pęcherzykami fosfolipidowymi za pomocą ilościowej cytometrii przepływowej. Wiązanie białek znakowanych fluorescencyjnie z pęcherzykami fosfolipidowymi znakowanymi fluorescencyjnie zwiększa średnią intensywność fluorescencji, a wzrost ten jest wykrywany przez cytometr przepływowy.

Ilościowa cytometria przepływowa do badania znakowanych interakcji pęcherzyków białko-fosfolipid

Ten film przedstawia metodę proteomiczną pojedynczej komórki, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi do odrębnego kodowania kreskowego komórek. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne i cytometrię masową w celu oceny zmian immunologicznych fenotypowych i funkcjonalnych w ludzkich komórkach odpornościowych pochodzących z krwi pełnej.

Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Poznaj fosfomorfometrię przepływową do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów. Ta metoda umożliwia badanie fosforylacji białek w skali średniej i wysokiej przepustowości.

Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów (Wideo) | JoVE Journal

Fosfomorfometria przepływowa z fluorescencyjnym kodowaniem kreskowym komórek do analizy sygnalizacji pojedynczej komórki i odkrywania biomarkerów

Przeglądaj więcej filmów