Name: Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj metodę analizy kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych z uwzględnieniem rodzaju włókien i lokalizacji subkomórkowej. Protokół umożliwia jednoczesne przetwarzanie próbek, oszczędzając czas i minimalizując artefakty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) i Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. jest laureatem stypendium doktoranckiego od FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. otrzymał stypendium w ramach Międzynarodowego Programu Doskonałości Walonia-Bruksela.
Autorzy dziękują Alice Monnier za jej wkład w rozwój tego protokołu oraz Caroline Bouzin za jej wiedzę i pomoc techniczną w procesie pozyskiwania obrazów. Dziękujemy również platformie obrazowania 2IP-IREC za dostęp do kriostatu i mikroskopów (Platforma Obrazowania 2IP-IREC, Instytut Badań Eksperymentalnych i Klinicznych, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruksela, Belgia). Na koniec autorzy pragną podziękować Nicolasowi Dubuissonowi, Romainowi Versele i Michelowi Abou-Samrze za konstruktywną krytykę rękopisu. Niektóre z figur w tym artykule zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Szczegółowo opisany tutaj protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego oznaczania LD oznaczonych Bodipy na podstawie specyficznej dla rodzaju włókien i subkomórek. W ostatnich latach klasyczne barwniki lipidowe, takie jak ORO lub Sudan Black B, zostały zastąpione nową gamą przepuszczalnych dla komórek, lipofilowych, fluorescencyjnych barwników, które wiążą się z obojętnymi lipidami (np. Bodipy). Dostępny w postaci różnych koniugatów, Bodipy okazał się bardzo skuteczny w znakowaniu LD w celu zbadania ich morfologii, dyna...

Infiltracja lipidów do mięśni szkieletowych, znana jako myosteatoza, nasila się wraz z otyłością i wiekiem. Myosteatoza jest ujemnie skorelowana z masą i siłą mięśni oraz z wrażliwością na insulinę1. Ponadto najnowsze badania wskazują, że stopień myosteatozy może służyć jako czynnik prognostyczny dla innych schorzeń, takich jak choroby układu sercowo-naczyniowego2, niealkoholowa stłuszcza wątroby3 czy nowotwory4. Lipidy mogą gromadzić się w mięśniach szkieletowych pomiędzy włóknami mięśniowymi jako lipidy pozakomórkowe lub wewnątrz włókien jako wewnątrzkomórkowe lipidy mięśniowe (IMCLs). IMCLs są przechowywane głównie w formie trójglicerydów w kropelkach lipidowych (LDs), które służą jako paliwo metaboliczne podczas wysiłku fizycznego5,6. Jednakże, gdy podaż lipidów przewyższa zapotrzebowanie lub gdy mitochondria stają się dysfunkcyjne, IMCLs biorą udział w insulinoodporności mięśni, co obserwuje się u osób z otyłością z zaburzeniami metabolicznymi oraz u pacjentów z cukrzycą typu 27. Co ciekawe, sportowcy wytrzymałościowi mają podobne, a nawet wyższe poziomy IMCLs niż pacjenci z otyłością i cukrzycą typu 2, zachowując przy tym wysoką wrażliwość na insulinę. Zjawisko to opisuje się jako „paradoks sportowca”8,9, a wyjaśnia się je poprzez bardziej szczegółową analizę kropel lipidowych w mięśniach, dotyczącą ich wielkości, gęstości, lokalizacji, dynamiki oraz składu gatunków lipidów.
Po pierwsze, rozmiar LD jest odwrotnie skorelowany z wrażliwością na insulinę i sprawnością fizyczną10,11. W rzeczywistości mniejsze LD wykazują stosunkowo większą powierzchnię dla działania lipazy, a tym samym potencjalnie mają większą zdolność do mobilizacji lipidów12. Po drugie, gęstość LD (liczba/powierzchnia) odgrywa kontrowersyjną rolę w działaniu insuliny8,10; wydaje się jednak, że jest ona zwiększona u sportowców. Po trzecie, istotna jest subkomórkowa lokalizacja LD, ponieważ LD znajdujące się tuż pod błoną powierzchniową (subsarcolemmal lub obwodowe) wywierają bardziej szkodliwy wpływ na wrażliwość na insulinę niż te centralne8,9,13. Te ostatnie dostarczają paliwa do mitochondriów centralnych, które wykazują większą aktywność oddechową i są bardziej wyspecjalizowane w zaspokajaniu wysokiego zapotrzebowania energetycznego niezbędnego do skurczu14. W przeciwieństwie do nich, obwodowe LD zaopatrują mitochondria subsarkolemmalne, które uczestniczą w procesach związanych z błoną8. Wreszcie, poza triglicerydami, konkretne złożone lipidy w mięśniach mogą być bardziej szkodliwe niż inne. Na przykład diacyloglicerol, długołańcuchowy acylo-CoA i ceramidy mogą gromadzić się w mięśniach przy niskim tempie obrotu triglicerydów, upośledzając tym samym sygnalizację insulinową9,15. Powracając do „paradoksu sportowca”, sportowcy wytrzymałościowi mają dużą liczbę mniejszych centralnych LD o podwyższonym tempie obrotu w włóknach typu I (oksydacyjnych), podczas gdy pacjenci otyli i z cukrzycą mają większe obwodowe LD o niskim tempie obrotu we włóknach typu II (glikolitycznych)8,15,16. Oprócz roli w magazynowaniu i uwalnianiu energii, LD via pochodne kwasy tłuszczowe (FA) i białko otoczki (perilipina 5) mogą również funkcjonować jako kluczowe elementy zaangażowane w regulację transkrypcyjną utleniania FA i biogenezę mitochondriów8. Ze względu na ich kluczowe znaczenie w fizjologii i patofizjologii, uzasadnione są pogłębione badania nad dynamiką i funkcjami LD.
Mimo że istnieje kilka technik badania IMCL, nie wszystkie z nich pozwalają na dokładne określenie wielkości, gęstości i rozmieszczenia kropli lipidowych (LD) w sposób specyficzny dla poszczególnych włókien. Na przykład ocena IMCL za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego, choć jest nieinwazyjna, oferuje rozdzielczość niewystarczającą do badania wielkości i dokładnej lokalizacji LD w obrębie włókna oraz nie jest specyficzna dla typu włókien17,18. Podobnie techniki biochemiczne wykonywane na homogenatach całego mięśnia19 nie pozwalają ocenić lokalizacji i wielkości lipidów. W związku z tym najodpowiedniejszą metodą analizy morfologii i rozmieszczenia LD jest ilościowa transmisyjna mikroskopia elektronowa13, jednak technika ta jest kosztowna i czasochłonna. Dlatego konfokalne obrazowanie fluorescencyjne preparatów z zastosowaniem barwników takich jak Oil Red O (ORO)20,21, monodansylopentan (MDH)22 lub Bodipy23,24,25 stało się najlepszym narzędziem do tych badań.
W niniejszym opracowaniu opisano kompletny protokół, obejmujący pobieranie i przetwarzanie tkanek, barwienie Bodipy oraz akwizycję i analizę obrazów konfokalnych w celu ilościowego określenia wielkości, liczby i lokalizacji kropel lipidowych (LD) w mrożonych przekrojach mięśni myszy. Ponieważ IMCL nie są równomiernie rozmieszczone pomiędzy włóknami oksydacyjnymi a glikolitycznymi, a każdy typ włókna reguluje dynamikę LD w inny sposób, badanie IMCL musi być specyficzne dla typu włókien16,25,26,27. Dlatego w niniejszym protokole zastosowano immunofluorescencję na seriach przekrojów w celu identyfikacji izoformy lub izoform ciężkiego łańcucha miozyny (MyHC) eksprymowanych przez każde włókno. Kolejną zaletą tego protokołu jest jednoczesne przetwarzanie mięśnia glikolitycznego (mięsień prostownik palców długi, EDL) oraz oksydacyjnego (mięsień płaszczkowaty), umieszczonych obok siebie przed zamrożeniem (Rycina 1). Takie jednoczesne przetwarzanie nie tylko oszczędza czas, ale także pozwala uniknąć zmienności wynikającej z oddzielnego przygotowania próbek.
<img alt="Schemat procedury przygotowania tkanek, kriosekcjonowania i analizy mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury. Po wycięciu mięśnia (1), wyselekcjonowane mięśnie o podobnej wielkości są przygotowywane i zamrażane razem (2). Za pomocą kriotomu otrzymuje się seryjne przekroje poprzeczne o grubości 10 µm, które są bezpośrednio montowane na szkiełkach adhezyjnych (3). Z dwóch seryjnych szkiełek pierwsze (4A) jest immunoznakowane pod kątem lamininy i barwione Bodipy w celu identyfikacji LDs, a drugie (4B) jest barwione immunofluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko MyHCs w celu rozpoznania typów włókien mięśniowych. Obrazy są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu konfokalnego dla Bodipy (5A) oraz mikroskopu epifluorescencyjnego dla typów włókien mięśniowych (5B). Obrazy są analizowane w programie Fiji poprzez zastosowanie progu i kwantyfikację cząstek (6A) w celu uzyskania liczby, średniej wielkości, gęstości i procentu całkowitej powierzchni zajmowanej przez LDs (7) lub poprzez liczenie komórek (6B) w celu uzyskania procentu włókien każdego typu w przekroju (7). Skróty: LDs = kropelki lipidowe; EDL = mięsień prostownik długi palców; MyHCs = izoformy ciężkich łańcuchów miozyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono 6 Mpix kamera</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1,4 MPix CCD&nbsp;</td><td>Kaptur chemiczny Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Potteau Labo</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Krążki korkowe (&oslash; 20 mm, grubość 3 mm)&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice kriogeniczne</td><td>Tempshield</td><td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>Preparacyjny mikroskop stereoskopowy SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Kleszcze</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie nożyczki Bonn</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Jednorazowe Formy bazowe (0,7 x 0,7 cm)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-363-552</td><td>Służy do wycinania kawałka do przytrzymywania mięśnia na korku do zamrażania</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego (H 25&nbsp; mm, & oslash; 150&nbsp; mm)</td><td>MARKOWA szalka Petriego, MERK</td><td>BR455751</td><td>Służy do umieszczania mięśni na lodzie podczas sekcji</td></tr><tr><td>ImmEdge Bariera hydrofobowa PAP Pen Vector</td><td>Labs</td><td>H-4000</td><td>Służy do tworzenia bariery hidropobowej wokół odcinków mięśniowych</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu (24x50 mm)</td><td>Assistent&nbsp;</td><td></td><td></td>40990151</tr><tr><td>Pudełka na szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>Używany jako wilgotne komory do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Uchwyt na szyję</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>Używany jako pasek do trzymania kubka ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Nr 15 Sterylne ostrze skalpela ze stali węglowej</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Pędzle malarskie</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>Służy do obsługi kriosekcji</td></tr><tr><td>Marker permanentny w pisaku</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>Służy do etykietowania prowadnic</td></tr><tr><td>Kleszcze mocujące do przebijania</td><td>FST</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko z polistyrenu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, używany jako pojemnik na ciekły azot oraz do transportu próbek do kriostatu</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela, 125 mm (5"), nr 3</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Kubek ze stali nierdzewnej 10 uncji&nbsp;</td><td>Eboxer</td><td>B07GFCBPFH</td><td>Kubek do wypełnienia izopentenem do zamrażania mięśni</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Ultra Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta chirurgiczna 1/2 zęba</td><td>Medische Vakhandel</td><td>1303152</td><td>Nazywana również "Pęsetą do zębów szczura"</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Krawędź tnąca</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>VWR międzynarodowy</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>Skaner całego szkiełka do fluorescencji</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21121</td><td>Używany w końcowe stężenie 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM</td><td>Abcam</td><td>ab175702</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozie przeciwciało anty szczurzo-IgG (H+L) drugorzędowe</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:500</td></tr><tr><td>BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>BODIPY-558/568 C12 (4,4-difluoro-5-(2-tienylo)-4-Bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-dodekanowy)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 0,5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>Służy do roztworu Bodipy na roztwór podstawowy 1 mg/ml. UWAGA: Toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4%, buforowany, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004969011</td><td>UWAGA: Może powodować reakcję alergiczną skóry. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne. Może powodować raka. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Isopentan GPR RectaPur</td><td>VWR international</td><td>24872.298</td><td>CAUTION: Skrajnie łatwopalna ciecz i para. Może być śmiertelne w przypadku połknięcia i dostania się do dróg oddechowych. Może powodować senność lub zawroty głowy. Powtarzające się narażenie może powodować wysuszenie lub pękanie skóry. Nosić rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy.</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td><silny>UWAGA</mocny>:&nbsp; Ekstremalnie zimno. Nosić rękawice. Obchodź się powoli, aby zminimalizować gotowanie i rozpryskiwanie oraz w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Używaj pojemników przeznaczonych do płynów o niskiej temperaturze.</td></tr><tr><td>Mysz na myszy Odczynnik blokujący&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td><td>Stosowany w stężeniu 1:30</td></tr> Gen łańcucha <tr><td>ciężkiego miozyny typu I (przeciwciało pierwotne BA-D5-s): MYH7, monoklonalny bydlęcy anty mysi IgG2b</td><td>DSHB University of Iowa</td><td>BA-D5-supernatant</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:10</td>Miozyna</tr> łańcuch <tr><td>ciężki typu IIA (SC-71-s Pierwotne przeciwciało) Gen:&nbsp; MYH2, Monoklonalny bydlęcy anty mysi IgG1</td><td>DSHB University of Iowa</td><td>SC-71-supernatant</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:10</td></tr><tr><td>Łańcuch ciężki miozyny typu IIX (przeciwciało pierwotne 6H1-s), Gen:&nbsp; MYH1, Monoklonalny królik anty mysie</td><td>IgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>6H1-supernatant</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1:5</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Powszechnie stosowany w laboratoriach histologicznych</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antiblade Mountant</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało pierwszorzędowe anty-Laminin-2 (łańcuch alfa;-2) (monoklonalne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>Stosowane w końcowym stężeniu 1:1,000</td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Służy do projektowania figur</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie konfokalne</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>Służy do projektowania figur</td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td> <td>Służy do analizy pozyskanych obrazów</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Służy do rekonstrukcji histologii całego mięśnia po zeskanowaniu typów włókien</td></tr><tr><td>Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Służy do rekonstrukcji histologii całego mięśnia po zeskanowaniu typów włókien</td></tr></tbody></table>

analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Naciek lipidowy w mięśniach szkieletowych, znany jako miosteatoza, wzrasta wraz z otyłością i starzeniem się. Miosteatoza została również niedawno odkryta jako negatywny czynnik prognostyczny dla kilku innych zaburzeń, takich jak choroby sercowo-naczyniowe i nowotwory. Nadmierna infiltracja lipidów zmniejsza masę mięśniową i siłę. Powoduje to również lipotoksyczność i insulinooporność w zależności od całkowitej zawartości lipidów wewnątrzmięśniowokomórkowych, morfologii kropelek lipidów (LD) i dystrybucji subkomórkowej. Rodzaj błonnika (oksydacyjny lub glikolitologiczny) jest również ważny, ponieważ włókna oksydacyjne mają większą zdolność do wykorzystywania lipidów. Ze względu na ich kluczowe implikacje w patofizjologii, uzasadnione są dogłębne badania nad dynamiką LD i funkcją w sposób specyficzny dla rodzaju włókien.
Tutaj, przedstawiono kompletny protokół do ilościowego oznaczania zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych oraz analizy morfologii LD i dystrybucji subkomórkowej w sposób specyficzny dla typu włókna. W tym celu seryjne kriosekcje mięśni barwiono barwnikiem fluorescencyjnym Bodipy i przeciwciałami przeciwko izoformom łańcucha ciężkiego miozyny. Protokół ten umożliwia jednoczesne przetwarzanie różnych mięśni, oszczędzając czas i unikając ewentualnych artefaktów, a dzięki spersonalizowanemu makrowi stworzonemu na Fidżi możliwa jest również automatyzacja analizy LD.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu zapewnia wydajną metodę łatwego ilościowego oznaczania LD w sposób specyficzny dla typu włókien i lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Przedstawia on, w jaki sposób poprzez wspólne zamrażanie dwóch mięśni o podobnej wielkości, takich jak EDL i mięsień soleus, czas i zasoby poświęcane na kolejne kroki zostają zredukowane o połowę.
Przedstawiono kompletny protokół barwienia immunocytochemicznego, akwizycji obrazów oraz analizy różnych izoform MyHC ekspresyjny...

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Protokół ten umożliwia ilościowe oznaczanie kropelek lipidów oraz analizę ich morfologii i dystrybucji subkomórkowej w sposób specyficzny dla rodzaju włókna. Technika ta umożliwia jednoczesne przetwarzanie różnych mięśni, oszczędzając czas i unikając artefaktów, które mogłyby wystąpić podczas niezależnego przetwarzania. Pozwala również na automatyzację kwantyfikacji kropelek lipidów.Miosteatozę oceniano w mięśniach morskich, ale protokół ten można przełożyć na ludzi w różnych stanach, takich jak otyłość, starzenie się i rak. Rozpoznanie tych samych włókien w przekroju równoległym może być trudne, ale niezwykłe struktury, takie jak poprawki aksonów lub wrzeciona mięśniowe, są dobrymi punktami orientacyjnymi, które pomogą badaczowi zlokalizować te same włókna na obu szkiełkach. Na początek umieść dwa seryjnie zamrożone przekroje poprzeczne próbki mięśniowej na dwóch wstępnie oznaczonych szkiełkach adhezyjnych.Jeden szkiełko do określania rodzajów włókien, a drugi do ilościowego określania zawartości lipidów. W celu immunohistochemicznego wykrycia typu włókien mięśniowych należy otoczyć skrawki konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem. Umieść go w wilgotnej komorze i płucz lodowatym 0,1 molowym PBS przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie usuń PBS, dodaj roztwór blokujący do szkiełka i inkubuj przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Później usunąć roztwór blokujący i inkubować szkiełka przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z roztworem zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut każde, w temperaturze pokojowej.Dodać roztwór zawierający przeciwciała drugorzędowe i inkubować szkiełka w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej, następnie upewnić się, że szkiełko jest trzymane z dala od światła i kontynuować trzy płukania w PBS przez pięć minut każde, a następnie przepłukać szkiełko w wodzie podwójnie destylowanej, po usunięciu nadmiaru wody, zamontować szkiełko z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronić przed światłem. Aby zabarwić kroplę lipidu bodipy, otocz odcinek mięśniowy konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem, a następnie spłucz go lodowatym 0,1 molowym PBS przez 10 minut. Oba szkiełka muszą być barwione jednocześnie.Przymocuj sekcję zimnym czteroprocentowym paraformaldehydem bez metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po pierwszym szybkim spłukaniu umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut. Zablokuj szkiełko 5% normalną surowicą kozią w PBS przez godzinę w komorze ludzkiej.Następnie inkubuje się szkiełko z roztworem pierwszorzędowego przeciwciała zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i antylamininy szczura w PBS przez 90 minut. Po trzykrotnym umyciu szkiełek w PBS, przeprowadzić następną inkubację z roztworem przeciwciała drugorzędowego zawierającym kozie, przeciwciało antyszczurze, Alexa fluor 647 w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Upewnij się, że zjeżdżalnia jest chroniona przed światłem.Po inkubacji przemyć szkiełko trzykrotnie PBS. Następnie inkubuj sekcję przez 20 minut z dapi i roztworem bodipy. Po szybkim spłukaniu przemyj trzykrotnie PBS i raz wodą podwójnie destylowaną, a następnie usuń nadmiar wody i zamontuj sekcję odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.Po zeskanowaniu mięśnia prześlij przechwycone obrazy cyfrowe do dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu rekonstrukcji. Na podstawie morfologii włókien i histologii odcinka mięśniowego zapisz obraz w odpowiednim formacie ze scalonymi wszystkimi kanałami. W celu obserwacji i akwizycji obrazu cielesnego należy ustawić parametry mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową z 40-krotnym zanurzeniem w oleju i aperturą numeryczną 1,4, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Aby uniknąć przesłuchów między bodipy a 558, 568 i lamininą Alexa fluor 647; Użyj trybu skanowania sekwencyjnego w oprogramowaniu konfokalnym. Wzbudz bodipy i 493, 503 za pomocą linii laserowej 488 nanometrów lub linii lasera argonowego, a wzbudz bodipy i 555, 568 za pomocą linii lasera diodowego 561 nanometrów. Na koniec wykryj lamininę Alexa fluor 647 za pomocą linii lasera diodowego o długości 640 nanometrów, w zależności od wybranego barwnika, ustaw szybkość emisji na 570 do 650 nanometrów dla bodipy i 493, 503.I przy 565 do 620 nanometrach dla bodipy i 558, 568. Ustaw zakres emisji lamininy na 656 do 700 nanometrów. Następnie odpowiednio ustaw wzmocnienie i wzmocnienie cyfrowe, aby uniknąć wykrywania nasyconych pikseli na wskaźniku zasięgu.Popraw sygnał tła, dostosowując przesunięcie. Do identyfikacji rodzaju włókna na mikroskopie konfokalnym należy użyć laptopa, na którym można sprawdzić obraz wcześniej zrekonstruowanego preparatu z detekcją immunologiczną typu światłowodu. Gdy grupa włókien zostanie prawidłowo zidentyfikowana, uzyskaj obraz z kanałami bodipy i lamininy.Otwórz każdy obraz za pomocą importera bioformatu z Fidżi. W obszarze stosu widoku z opcją wybierz hyper stack, a następnie tryb koloru i domyślny. Upewnij się, że wybrano okno automatycznego skalowania.Użyj narzędzia wyboru z wolnej ręki, aby ręcznie wybrać sarkolemmę włókna na podstawie kanału lamininy. I naciśnij T na klawiaturze, aby nagrać obszar zainteresowania w oknie ROI. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj i ustaw pomiary.Następnie w wyskakującym okienku wybierz obszar i dla podniesionej średnicy pozostaw pozostałe pola niezaznaczone, a inne parametry tak, jak są wyświetlane domyślnie. Kliknij na pomiar w oknie ROI, aby uzyskać powierzchnię i minimalną dla podniesionej średnicy wybranego włókna i zanotować je do późniejszego wykorzystania. Oblicz wartość jednej szóstej minimalnej podniesionej średnicy, aby wyznaczyć środkową część włókna.Kliknij okno ROI, kliknij dodaj, aby uzyskać duplikat pierwszego ROI i wybierz drugi ROI, który pojawi się w oknie. W głównym oknie Fidżi kliknij edytuj, a następnie zaznacz i powiększ. Aby wprowadzić wcześniej obliczoną wartość ze znakiem minus przed liczbą i kliknij w porządku.W oknie ROI kliknij dodaj, musi pojawić się trzeci ROI i usuń, aby usunąć drugi ROI. W oknie ROI wybierz oba ROI i kliknij więcej niż ZOR i dodaj, poczekaj, aż pojawi się trzeci ROI, który odpowiada obwodowi światłowodu. Jeśli potrzebna jest ponowna analiza tych samych włókien, zapisz zwrot z inwestycji, klikając więcej, a następnie zapisz.Wybierz kanał bodipy i otwórz narzędzie progu, klikając zakładki obrazu, regulacji i progu w głównym oknie Fidżi. W wyskakującym oknie progu ustaw wartości na 70 i 255. Następnie wybierz YEN i metodę czarno-białą.Przed kliknięciem na ciemne tło. Na koniec kliknij zakładkę Zastosuj. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj i ustaw pomiary.W wyskakującym okienku wybierz obszar, ułamek obszaru i ogranicz do progu. Pozostaw pozostałe pola i parametry jako domyślne. Przejdź do okna ROI i wybierz pierwszy ROI.W oknie głównym Fidżi kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki. W oknie analizowanych cząstek ustaw wartości od dwóch do nieskończoności i zaznacz pole pikseli. Zachowaj domyślną wartość cykliczności i wybierz pozycję podsumuj przed kliknięciem przycisku OK.Aby uzyskać wartości środka i obwodu światłowodu, należy za każdym razem powtórzyć wybór drugiego i trzeciego ROI. Następnie zapisz wyniki, klikając plik, a następnie zapisz jako w oknie podsumowania. Uwzględnij typ światłowodu w nazwie pliku.Ten protokół immunohistochemiczny pozwala na rozpoznanie myszy, wolnych włókien oksydacyjnych, takich jak typ 1 i 2A, szybkich włókien glikolitycznych, takich jak typ 2X i 2B, oraz obecności włókien hybrydowych. Mierząc powierzchnię i minimalną dla podniesionej średnicy włókna mięśniowego, zastosowano redukcję zależną od wielkości, aby uzyskać obszary centralne i obwodowe każdego włókna. Niezwykłe struktury każdej sekcji mięśniowej, takie jak gałązki aksonów lub wrzeciona mięśniowe, są dobrymi punktami orientacyjnymi, które mogą pomóc zlokalizować te same włókna po obu stronach.Ustawienia opisane do uzyskiwania barwienia bodpylaminy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Umożliwiona wizualizacja i analiza wielkości, liczby i rozkładu kropelek lipidów z trzech do sześciu włókien jednocześnie. Metoda pozwoliła również na ilościowe określenie trzech ważnych parametrów, a mianowicie procentowego udziału powierzchni włókien zajmowanej przez kropelki lipidów, gęstości i średniej wielkości kropelek lipidów.Niewłaściwa procedura zamrażania i nieosiągnięcie odpowiedniej temperatury izopentanu spowodowało powstanie kryształków lodu wewnątrz włókien mięśniowych. Gdy sekcje nie były wyrównane poprzecznie, nie można było przeprowadzić kwantyfikacji kropelek lipidów i porównania między włóknami, mięśniami lub zwierzętami. Przetwarzanie drugiego slajdu musi odbywać się jednocześnie z pierwszym.Suszenie szkiełka na powietrzu po kriosekcji przez 15 minut znacznie zmniejszy wielkość i liczbę kropelek lipidów. Bodipy może być stosowany do badania interakcji kropelek lipidów z innymi organellami subkomórkowymi lub stosem białkowym z fluorescencją o innym spektrum lub z genetycznie zmodyfikowanymi modelami GFP. Doniesiono, że miosteatoza jest złym czynnikiem prognostycznym dla wielu chorób.W związku z tym technika ta może być stosowana do monitorowania postępu choroby lub do oceny efektu leczenia.

fiber-type-subcellular-specific-analysis-lipid-droplet-content

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie pokazujemy przygotowanie próbki ludzkiej tkanki mięśni szkieletowych i jej barwienie do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu wizualizacji i ilościowego określenia subkomórkowego rozkładu glikogenu.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa w celu ilościowego określenia dystrybucji glikogenu w ludzkich mięśniach szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Zastąpienie zdrowej tkanki mięśniowej tłuszczem śródmięśniowym jest charakterystyczną cechą ludzkich chorób i schorzeń. Protokół ten określa, jak wizualizować, obrazować i określać ilościowo śródmięśniową tkankę tłuszczową, umożliwiając rygorystyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw tworzenia się śródmięśniowej tkanki tłuszczowej.

Przewodnik po badaniu śródmięśniowego tworzenia się tłuszczu i jego komórkowego pochodzenia w mięśniach szkieletowych

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Poznaj metodę analizy kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych z uwzględnieniem rodzaju włókien i lokalizacji subkomórkowej. Protokół umożliwia jednoczesne przetwarzanie próbek, oszczędzając czas i minimalizując artefakty.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Przeglądaj więcej filmów