Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Protokół ten umożliwia ilościowe oznaczanie kropelek lipidów oraz analizę ich morfologii i dystrybucji subkomórkowej w sposób specyficzny dla rodzaju włókna. Technika ta umożliwia jednoczesne przetwarzanie różnych mięśni, oszczędzając czas i unikając artefaktów, które mogłyby wystąpić podczas niezależnego przetwarzania. Pozwala również na automatyzację kwantyfikacji kropelek lipidów.

Miosteatozę oceniano w mięśniach morskich, ale protokół ten można przełożyć na ludzi w różnych stanach, takich jak otyłość, starzenie się i rak. Rozpoznanie tych samych włókien w przekroju równoległym może być trudne, ale niezwykłe struktury, takie jak poprawki aksonów lub wrzeciona mięśniowe, są dobrymi punktami orientacyjnymi, które pomogą badaczowi zlokalizować te same włókna na obu szkiełkach. Na początek umieść dwa seryjnie zamrożone przekroje poprzeczne próbki mięśniowej na dwóch wstępnie oznaczonych szkiełkach adhezyjnych.

Jeden szkiełko do określania rodzajów włókien, a drugi do ilościowego określania zawartości lipidów. W celu immunohistochemicznego wykrycia typu włókien mięśniowych należy otoczyć skrawki konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem. Umieść go w wilgotnej komorze i płucz lodowatym 0,1 molowym PBS przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń PBS, dodaj roztwór blokujący do szkiełka i inkubuj przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Później usunąć roztwór blokujący i inkubować szkiełka przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z roztworem zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut każde, w temperaturze pokojowej.

Dodać roztwór zawierający przeciwciała drugorzędowe i inkubować szkiełka w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej, następnie upewnić się, że szkiełko jest trzymane z dala od światła i kontynuować trzy płukania w PBS przez pięć minut każde, a następnie przepłukać szkiełko w wodzie podwójnie destylowanej, po usunięciu nadmiaru wody, zamontować szkiełko z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronić przed światłem. Aby zabarwić kroplę lipidu bodipy, otocz odcinek mięśniowy konturem narysowanym hydrofobowym pisakiem, a następnie spłucz go lodowatym 0,1 molowym PBS przez 10 minut. Oba szkiełka muszą być barwione jednocześnie.

Przymocuj sekcję zimnym czteroprocentowym paraformaldehydem bez metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po pierwszym szybkim spłukaniu umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut. Zablokuj szkiełko 5% normalną surowicą kozią w PBS przez godzinę w komorze ludzkiej.

Następnie inkubuje się szkiełko z roztworem pierwszorzędowego przeciwciała zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i antylamininy szczura w PBS przez 90 minut. Po trzykrotnym umyciu szkiełek w PBS, przeprowadzić następną inkubację z roztworem przeciwciała drugorzędowego zawierającym kozie, przeciwciało antyszczurze, Alexa fluor 647 w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Upewnij się, że zjeżdżalnia jest chroniona przed światłem.

Po inkubacji przemyć szkiełko trzykrotnie PBS. Następnie inkubuj sekcję przez 20 minut z dapi i roztworem bodipy. Po szybkim spłukaniu przemyj trzykrotnie PBS i raz wodą podwójnie destylowaną, a następnie usuń nadmiar wody i zamontuj sekcję odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.

Po zeskanowaniu mięśnia prześlij przechwycone obrazy cyfrowe do dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu w celu rekonstrukcji. Na podstawie morfologii włókien i histologii odcinka mięśniowego zapisz obraz w odpowiednim formacie ze scalonymi wszystkimi kanałami. W celu obserwacji i akwizycji obrazu cielesnego należy ustawić parametry mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową z 40-krotnym zanurzeniem w oleju i aperturą numeryczną 1,4, zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Aby uniknąć przesłuchów między bodipy a 558, 568 i lamininą Alexa fluor 647; Użyj trybu skanowania sekwencyjnego w oprogramowaniu konfokalnym. Wzbudz bodipy i 493, 503 za pomocą linii laserowej 488 nanometrów lub linii lasera argonowego, a wzbudz bodipy i 555, 568 za pomocą linii lasera diodowego 561 nanometrów. Na koniec wykryj lamininę Alexa fluor 647 za pomocą linii lasera diodowego o długości 640 nanometrów, w zależności od wybranego barwnika, ustaw szybkość emisji na 570 do 650 nanometrów dla bodipy i 493, 503.

I przy 565 do 620 nanometrach dla bodipy i 558, 568. Ustaw zakres emisji lamininy na 656 do 700 nanometrów. Następnie odpowiednio ustaw wzmocnienie i wzmocnienie cyfrowe, aby uniknąć wykrywania nasyconych pikseli na wskaźniku zasięgu.

Popraw sygnał tła, dostosowując przesunięcie. Do identyfikacji rodzaju włókna na mikroskopie konfokalnym należy użyć laptopa, na którym można sprawdzić obraz wcześniej zrekonstruowanego preparatu z detekcją immunologiczną typu światłowodu. Gdy grupa włókien zostanie prawidłowo zidentyfikowana, uzyskaj obraz z kanałami bodipy i lamininy.

Otwórz każdy obraz za pomocą importera bioformatu z Fidżi. W obszarze stosu widoku z opcją wybierz hyper stack, a następnie tryb koloru i domyślny. Upewnij się, że wybrano okno automatycznego skalowania.

Użyj narzędzia wyboru z wolnej ręki, aby ręcznie wybrać sarkolemmę włókna na podstawie kanału lamininy. I naciśnij T na klawiaturze, aby nagrać obszar zainteresowania w oknie ROI. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj i ustaw pomiary.

Następnie w wyskakującym okienku wybierz obszar i dla podniesionej średnicy pozostaw pozostałe pola niezaznaczone, a inne parametry tak, jak są wyświetlane domyślnie. Kliknij na pomiar w oknie ROI, aby uzyskać powierzchnię i minimalną dla podniesionej średnicy wybranego włókna i zanotować je do późniejszego wykorzystania. Oblicz wartość jednej szóstej minimalnej podniesionej średnicy, aby wyznaczyć środkową część włókna.

Kliknij okno ROI, kliknij dodaj, aby uzyskać duplikat pierwszego ROI i wybierz drugi ROI, który pojawi się w oknie. W głównym oknie Fidżi kliknij edytuj, a następnie zaznacz i powiększ. Aby wprowadzić wcześniej obliczoną wartość ze znakiem minus przed liczbą i kliknij w porządku.

W oknie ROI kliknij dodaj, musi pojawić się trzeci ROI i usuń, aby usunąć drugi ROI. W oknie ROI wybierz oba ROI i kliknij więcej niż ZOR i dodaj, poczekaj, aż pojawi się trzeci ROI, który odpowiada obwodowi światłowodu. Jeśli potrzebna jest ponowna analiza tych samych włókien, zapisz zwrot z inwestycji, klikając więcej, a następnie zapisz.

Wybierz kanał bodipy i otwórz narzędzie progu, klikając zakładki obrazu, regulacji i progu w głównym oknie Fidżi. W wyskakującym oknie progu ustaw wartości na 70 i 255. Następnie wybierz YEN i metodę czarno-białą.

Przed kliknięciem na ciemne tło. Na koniec kliknij zakładkę Zastosuj. Przejdź do głównego okna Fidżi i kliknij Analizuj i ustaw pomiary.

W wyskakującym okienku wybierz obszar, ułamek obszaru i ogranicz do progu. Pozostaw pozostałe pola i parametry jako domyślne. Przejdź do okna ROI i wybierz pierwszy ROI.

W oknie głównym Fidżi kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki. W oknie analizowanych cząstek ustaw wartości od dwóch do nieskończoności i zaznacz pole pikseli. Zachowaj domyślną wartość cykliczności i wybierz pozycję podsumuj przed kliknięciem przycisku OK.

Aby uzyskać wartości środka i obwodu światłowodu, należy za każdym razem powtórzyć wybór drugiego i trzeciego ROI. Następnie zapisz wyniki, klikając plik, a następnie zapisz jako w oknie podsumowania. Uwzględnij typ światłowodu w nazwie pliku.

Ten protokół immunohistochemiczny pozwala na rozpoznanie myszy, wolnych włókien oksydacyjnych, takich jak typ 1 i 2A, szybkich włókien glikolitycznych, takich jak typ 2X i 2B, oraz obecności włókien hybrydowych. Mierząc powierzchnię i minimalną dla podniesionej średnicy włókna mięśniowego, zastosowano redukcję zależną od wielkości, aby uzyskać obszary centralne i obwodowe każdego włókna. Niezwykłe struktury każdej sekcji mięśniowej, takie jak gałązki aksonów lub wrzeciona mięśniowe, są dobrymi punktami orientacyjnymi, które mogą pomóc zlokalizować te same włókna po obu stronach.

Ustawienia opisane do uzyskiwania barwienia bodpylaminy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Umożliwiona wizualizacja i analiza wielkości, liczby i rozkładu kropelek lipidów z trzech do sześciu włókien jednocześnie. Metoda pozwoliła również na ilościowe określenie trzech ważnych parametrów, a mianowicie procentowego udziału powierzchni włókien zajmowanej przez kropelki lipidów, gęstości i średniej wielkości kropelek lipidów.

Niewłaściwa procedura zamrażania i nieosiągnięcie odpowiedniej temperatury izopentanu spowodowało powstanie kryształków lodu wewnątrz włókien mięśniowych. Gdy sekcje nie były wyrównane poprzecznie, nie można było przeprowadzić kwantyfikacji kropelek lipidów i porównania między włóknami, mięśniami lub zwierzętami. Przetwarzanie drugiego slajdu musi odbywać się jednocześnie z pierwszym.

Suszenie szkiełka na powietrzu po kriosekcji przez 15 minut znacznie zmniejszy wielkość i liczbę kropelek lipidów. Bodipy może być stosowany do badania interakcji kropelek lipidów z innymi organellami subkomórkowymi lub stosem białkowym z fluorescencją o innym spektrum lub z genetycznie zmodyfikowanymi modelami GFP. Doniesiono, że miosteatoza jest złym czynnikiem prognostycznym dla wielu chorób.

W związku z tym technika ta może być stosowana do monitorowania postępu choroby lub do oceny efektu leczenia.