Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Dwufunkcyjna strategia chromatografii powinowactwa do metalu immobilizowanego tytanem może wzbogacić zarówno N-glikopeptydy, jak i fosfopeptydy w tym samym przepływie pracy, zwiększając ilość informacji biomolekularnych z tej samej analizy. Główną zaletą tego wzbogacenia są dwa mechanizmy separacji, które umożliwiają jednoczesne rozdzielenie N-glikopeptydów i fosfopeptydów w oddzielnych frakcjach do dalszej analizy spektrometrii mas. Zastosowanie tej metody wzbogacania może poprawić wykrywanie glikozylacji i fosforylacji w złożonych próbkach biologicznych, takich jak tkanki trzustki, w kierunku odkrycia biomarkerów choroby, takich jak cukrzyca i rak.

Ponieważ metoda ta opiera się na końcówkach wirujących i wirowaniu, ważne jest, aby kontrolować prędkość wirowania i upewnić się, że próbki są wolne od cząstek stałych, aby zapobiec zatykaniu. Na początek należy wstępnie schłodzić części rozdrabniacza do tkanek, które będą miały kontakt z tkankami trzustki, a mianowicie komorę, rozdrabniacz i łyżkę regeneracyjną, wraz z dowolnymi szpatułkami, w pojemniku z polistyrenu. Następnie przenieś kawałki tkanek do wstępnie schłodzonego uchwytu na próbkę i dodaj ciekły azot do tkanki, aż zostaną zamrożone.

Po umieszczeniu rozdrabniacza w komorze, uderz go młotkiem pięć do dziesięciu razy, aby zmiażdżyć próbkę, a następnie wyjmij rozdrabniacz z komory i zeskrob przylegający proszek i kawałki tkanki. Następnie dodaj łyżkę ciekłego azotu do komory, jeśli tkanki zaczną się topić, i powtarzaj proces proszkowania, aż do uzyskania drobnego proszku i podziel próbki na około 100-miligramowe porcje do wstępnie schłodzonych probówek. Po przygotowaniu buforu do lizy rozpuścić po jednej tabletce proteazy i inhibitora fosfatazy w 500 mikrolitrach wody, aby uzyskać zapas 20-krotność pożądanego stężenia końcowego i dodać wymaganą objętość zapasu każdego inhibitora do buforu do lizy, aby osiągnąć końcowe stężenia inhibitora.

Po dodaniu 600 mikrolitrów buforu do lizy do probówki, inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez 10 minut z wytrząsaniem z prędkością 800 obr./min, następnie wyjąć próbki z bloku grzewczego i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie poddaj próbki sonikacji o energii 60 watów przez 45 sekund, używając 15-sekundowych impulsów z 30-sekundową przerwą pomiędzy nimi, a następnie poddaj próbki granulkom pod ciśnieniem 3000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodać supernatant do pięciokrotności objętości rozpuszczalnika strącającego.

Na przykład 300 mikrolitrów buforu do lizy na 1,5 mililitra rozpuszczalnika strącającego zawierającego 50% acetonu, 49,9% etanolu i 0,1% kwasu octowego, a następnie schłodzić przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Ponownie zagnieździć próbki w temperaturze 3000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant, a następnie umyć osad, rozbijając szpatułką i wymieszać z taką samą ilością rozpuszczalnika strącającego. Po odwirowaniu wysuszyć osad próbki na powietrzu w dygestorium przez 15 minut i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do kontynuowania.

Najpierw ponownie zawiesić osad białkowy w 300 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu wytrawiającego zawierającego 50 milimolowy bufor wodorowęglanu trietyloamoniowego i osiem molowych moczników. Do białka w roztworze dodać ditiotreitol do końcowego stężenia pięciu milimolów, wymieszać i redukować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie dodać jodoacetamid do końcowego stężenia 15 milimolów. Wymieszaj i alkiluj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.

Następnie dodaj Lys-C/Trypsin w stosunku enzymu do białka od 1 do 100 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze przez cztery godziny, a następnie dodaj 50-milimolowy bufor wodorowęglanu trietyloamonu, aby rozcieńczyć osiem molowych moczników używanych do mniej niż jednego zęba trzonowego. Po dodaniu trypsyny w stosunku enzymu do białka od 1 do 100, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze przez noc, a następnie wygasić trawienie dodatkiem kwasu trifluorooctowego. Na każdy miligram białka wyjściowego kondycjonuj wkład odsalający jednym mililitrem acetonitrylu i trzykrotnie jednym mililitrem 0,1% kwasu trifluorooctowego, a następnie załaduj strawioną mieszaninę na wkład odsalający i umyj mieszaninę trzykrotnie za pomocą jednego mililitra 0,1% kwasu trifluorooctowego.

Następnie eluuj peptydy za pomocą jednego mililitra 60% roztworu acetonitrylu i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego, a następnie wysusz eluowane peptydy w temperaturze około 35 stopni Celsjusza za pomocą odśrodkowego koncentratora próżniowego, aż rozpuszczalnik całkowicie odparuje. Po ponownym zawieszeniu peptydów w wodzie, oszacuj stężenia peptydów za pomocą testu peptydowego zgodnie z protokołem producenta, a następnie podziel peptydy na podwielokrotności 500 mikrogramów i całkowicie wysusz. Zważ około trzech miligramów waty i zapakuj ją do pustej końcówki wirowej.

Po przeniesieniu jednego grama materiału do chromatografii powinowactwa do metalu immobilizowanego tytanem do probówki, dodaj 0,1% kwasu trifluorooctowego do znanego stężenia materiału. Po dodaniu wystarczającej ilości zawiesiny do końcówki wirowej, aby przenieść 20 miligramów materiału, umyj końcówkę wirowania, odwirowując 200 mikrolitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego. Ponownie zawiesić próbki w 200 mikrolitrach rozpuszczalnika do ładowania/mycia i przepuścić przez końcówkę wirującą.

Po umyciu końcówki wirowej przez odwirowanie rozpuszczalnikiem ładującym/myjącym, umyj końcówkę wirującą 200 mikrolitrami 80% roztworu acetonitrylu 0,1 kwasu mrówkowego, a następnie eluuj peptydy 200 mikrolitrami E1 i E2 i analizuj każdą elucję osobno. Powtórzyć proces elucji przy użyciu rozpuszczalników E3 i E4 i połączyć odpowiednie frakcje elucyjne przed dalszą analizą. Przed wykonaniem elucji przy zasadowym pH należy trzykrotnie kondycjonować materiał za pomocą 200 mikrolitrów 90% acetonitrylu w 2,5% wodorotlenku amonu, następnie eluować peptydy za pomocą 200 mikrolitrów rozpuszczalników E5 i E6 i analizować te elucjacje oddzielnie po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki.

Następnie wymyj peptydy 200 mikrolitrami o różnych stężeniach acetonitrylu i wodorotlenku amonu. Następnie połącz te elucjacje i przeanalizuj jako jedną próbkę, E7, po odsoleniu za pomocą wypełnionej końcówki. Uzyskano anotowane widma MS/MS o wysokim poziomie ufności z N-glikozylowanych i fosforylowanych peptydów z bogatą fragmentacją prekursorów, zwiększając pewność identyfikacji przypisanej przez oprogramowanie do przeszukiwania baz danych.

Identyfikacje peptydów stwierdzono w próbkach wzbogaconych przy użyciu dwufunkcyjnej metody chromatografii spinowej z powinowactwem do metalu immobilizowanego tytanem na każdej frakcji elucyjnej. Większość glikopeptydów eluuje się w pierwszych czterech frakcjach, podczas gdy większość fosfopeptydów wymywa się w ostatnich trzech frakcjach, zmniejszając potencjalne zakłócenia w jonizacji. Wyniki glikoproteomiki metodą podwójnego tytanu porównano ze wzbogaceniem samym glikopeptydem Ehrlicha, wykazując, że proporcje każdego rodzaju glikanu po zaliczeniu do sześciu kategorii na podstawie ich składu są podobne w obu metodach.

Wyniki fosfoproteomiki metodą podwójnego tytanu porównano z konwencjonalną chromatografią powinowactwa do immobilizowanych metali, wzbogacaniem wyłącznie fosfopeptydem lub przy użyciu obu metod. Większość fosforylowanych aminokwasów zidentyfikowano jako serynę i treoninę, z około 1% fosforylowaną tyrozyną. Prawidłowa konstrukcja końcówki wirującej jest ważna, aby zapewnić płynną elucję.

Mocno włóż bawełnę do końcówki, tak aby materiał wzbogacający można było zapakować na wierzch bawełny. Zastosowaliśmy dwufunkcyjną metodę tytanu IMAC do jednoczesnej charakterystyki glikozylacji i fosforylacji w większości tkanek oraz białka kolca SARS-CoV-2.