Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Protokół ten integruje analizę obrazu opartą na sztucznej inteligencji w celu segmentacji tkanek. Dzięki histologii selektywne zbieranie za pomocą mikrodysekcji laserowej zbliża nas do rzeczywistości patomiki. Wstępne definiowanie zwrotu z inwestycji w tkanki za pomocą sztucznej inteligencji ogranicza czas przebywania preparatów tkankowych w temperaturze otoczenia, zmniejsza wysiłek siły roboczej związany z wykonywaniem tych zbiorów i zmniejsza zmienność operatora.

Technika ta ma szerokie zastosowanie do wszelkich badań opartych na chorobach lub patologiach, obejmujących pobieranie lub wzbogacanie określonych populacji komórkowych z próbek tkanek. Ta metoda jest prosta dla użytkowników z podstawową wiedzą histopatologiczną i doświadczeniem w LMD. Kluczem jest upewnienie się, że wytnąłeś czysty kalibrator dla komórek i dobrze wytrenować klasyfikator.

Na początek upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche przed przecięciem referencyjnych wskaźników kalibracji. Otwórz oprogramowanie Laser Microdissection i otwórz domyślny plik sld z kropką kalibracji w opcji importu kształtów. Załaduj szkiełko chusteczką skierowaną w dół, stroną z etykietą bliżej operatora.

W uchwycie szkiełka na stoliku do mikrodysekcji laserowej wybierz opcję automatycznego ustawiania ostrości przed cięciem. Korzystając z mikroskopu laserowego i domyślnego pliku sld z kropką kalibracyjną, wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN. Tylko w przypadku kolekcji wzbogaconych o mikrodysekcję laserową otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.

Wybierz otwarte obrazy, a następnie w wyskakującym okienku wybierz plik obrazu z kropką svs wygenerowany podczas skanowania slajdu. Przejdź do zakładki adnotacje, wybierz i użyj narzędzia adnotacji prostokąta, aby narysować ramkę wokół tkanki. Wybierz adnotację pola i kliknij prawym przyciskiem myszy obraz.

Wybierz zaawansowane menu rozwijane, a następnie kliknij opcję partycjonowania. Ustaw rozmiar kafelka i odstęp odpowiednio między 500 i 40, a następnie wybierz opcję OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń adnotację pola obwodu używaną do generowania kafelków.

Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji kropkowej. Umieść zapisaną kopię algorytmu dapa języka Python, opracowanego w celu scalania warstw adnotacji sklasyfikowanych przez sztuczną inteligencję w tym samym folderze, co plik adnotacji kafelkowych. Skopiuj nazwę pliku adnotacji z kafelkami.

Otwórz program w języku Python przy użyciu bezczynnego zintegrowanego środowiska programistycznego i wklej nazwę pliku adnotacji kafelkowej między cytatami u dołu programu. Wybierz menu rozwijane uruchamiania, a następnie kliknij przycisk uruchom moduł. Poczekaj na wygenerowanie kilku plików, w których wszystkie adnotacje kafelkowe zostaną scalone w jednej warstwie.

Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i przejdź do karty adnotacji. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk importuj lokalny plik adnotacji.

W wyskakującym okienku wybierz scalony plik adnotacji kropkowej, który został wygenerowany przez skrypt. Upewnij się, że wszystkie zaimportowane kafelki znajdują się w tej samej warstwie adnotacji. Na karcie klasyfikatora postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby podświetlić reprezentatywne obszary guza, zrębu i czystego szklanego tła szkiełka.

Przed uruchomieniem klasyfikatora kliknij zaawansowane opcje klasyfikatora, wybierz żądaną warstwę adnotacji, zaznaczając pole ROI lub pola na karcie adnotacji. Użyj opcji warstwy adnotacji z menu akcji klasyfikatora, aby uruchomić klasyfikator. Po zakończeniu analizy klasyfikatora przejdź do karty adnotacji i wybierz warstwę adnotacji wygenerowaną na podstawie analizy.

Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij opcję usuń wszystkie warstwy oprócz bieżącej, aby usunąć wszystkie inne warstwy adnotacji z obrazu. Następnie wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje jako plik adnotacji kropkowej. Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji kropkowej w podfolderze.

Oznaczone unikatowym identyfikatorem slajdu. Przejdź do karty adnotacji, wybierz listę rozwijaną działań na warstwie, a następnie kliknij usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od każdego wzorca kalibracji.

Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności. Lewy górny róg, prawy górny róg, prawy dolny róg. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.

Dodaj calib podkreślenia do nazwy pliku i umieść plik w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących. Skopiuj adres projektu głównego. Otwórz malliator skryptów generujących import XML przy użyciu bezczynnego zintegrowanego środowiska programistycznego, a następnie wklej adres folderu projektu między cudzysłowy u dołu skryptu.

Wybierz menu rozwijane uruchamiania, a następnie kliknij przycisk uruchom moduł, aby wykonać skrypt. Załaduj oznaczone szkiełko membranowe z tkanką skierowaną w dół i stroną z etykietą bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego. Wybierz opcję importuj kształty z menu rozwijanego pliku.

Wybierz plik importu LMD z kropką XML wygenerowany dla slajdu. Wybierz nie w wyskakującym okienku, aby uniknąć wczytywania punktów odniesienia z pliku, i nie w drugim wyskakującym okienku, aby uniknąć używania wcześniej zapisanych punktów odniesienia do kalibracji. Postępuj zgodnie z instrukcjami aplikacji do mikropreparacji laserowej i dopasuj krzyżyk kalibracyjny do każdego z trzech wzorców kalibracji na szkiełku.

Poszukaj elementów odniesienia kalibracji, które pojawiają się w lewym górnym, prawym górnym rogu i prawym dolnym rogu obrazu slajdu. W oprogramowaniu do analizy obrazu, które będzie odpowiadało punktom referencyjnym szkiełka z odwróconej mikrodysekcji laserowej na stoliku mikroskopowym. Przełączaj się między użyciem obiektywu subiektywnego 5x do lokalizacji i obiektywu subiektywnego 63x, aby wyrównać każdy punkt odniesienia kalibracji.

Wybierz nie w wyskakującym okienku, aby uniknąć zapisywania punktów odniesienia do pliku, i w porządku w drugim wyskakującym okienku, aby potwierdzić, że slajd został wstawiony. Przesuń obiektyw subiektywny 5x na miejsce i wybierz tak w wyskakującym okienku, aby użyć rzeczywistego powiększenia. Gdy pojawią się zaimportowane kształty, ustaw ostrość aparatu na tkance.

Wyróżnij i zaznacz wszystkie kształty w oknie listy kształtów. Przeciągnij je na miejsce, używając jednej lub dwóch adnotacji w polu widzenia jako odniesień i wyrównaj pionową oś z do cięcia za pomocą lasera. Załaduj probówki do uniwersalnego uchwytu na probówki przeznaczonego do mikroprobówek PCT.

Przejrzyj zaimportowane kształty i przypisz je do odpowiedniej pozycji rury do pobrania. Naciśnij start cięcie, aby uruchomić laser. Rozładować i zamknąć probówkę z próbką chusteczkami LMD i umieścić na suchym lodzie.

Po termocyklingu i odwirowaniu, LMD pobrał próbki tkanek, usunął i wyrzucił mikrokapsułki z mikroprobówek PCT. Dodaj trypsynę, dodaj proporcję jednego mikrograma na 30 milimetrów kwadratowej tkanki. I włóż mikro tłuczek do mikrorurki za pomocą narzędzia do mikronasadek.

Przenieś mikroprobówki do naboju z cyklem beczkowym i zmontuj cały wkład. Umieść nabój w komorze ciśnieniowej cyklu beczki i zabezpiecz pokrywę. Cykl beczki przy 45 000 PSI przez 50 sekund i ciśnienie atmosferyczne przez 10 sekund w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 cykli.

W przypadku analizy LC-MS MS należy załadować fiolki automatycznego próbnika w odpowiednich pozycjach do automatycznego próbnika do chromatografii cieczowej. Zamknij automatyczny próbnik i przeanalizuj poszczególne frakcje odpowiednią metodą gradientu i spektrometrii mas. Nienadzorowane grupowanie hierarchiczne przy użyciu 100 najbardziej zmiennych białek.

Stwierdzono segregację typów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości i raka jasnokomórkowego jajnika z mikrodysekcji laserowej wzbogaconej i całych próbek guza. Natomiast mikrodysekcja laserowa wzbogaciła próbki zrębu zarówno z surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości, jak i raka jasnokomórkowego jajnika. Zgrupowane razem i niezależnie od mikrodysekcji laserowej wzbogacone próbki guza i całego guza.

Spośród 5 971 oznaczonych ilościowo białek, 215 uległo znaczącym zmianom między całymi kolekcjami guzów z próbek surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości i raka jasnokomórkowego jajnika. Spośród 76 białek sygnaturowych w ogóle oznaczonych ilościowo przez Hughesa, 57 zostało współoznaczonych ilościowo w tym zestawie danych i było silnie skorelowanych. Postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania Indica Lab i udoskonalając klasyfikator, uzyskano najdokładniejsze wyniki.

Wszystko inne jest ustandaryzowane. Tkanka pobrana za pomocą tego opartego na sztucznej inteligencji przepływu pracy LMD jest kompatybilna z różnymi dalszymi aplikacjami analitycznymi, w tym opisaną tutaj proteomiką opartą na spektrometrii mas lub analizami genomowymi, transkryptomicznymi lub innymi analizami omicznymi.