Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza
3 czerwca 2022
Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.
Protokół ten integruje analizę obrazu opartą na sztucznej inteligencji w celu segmentacji tkanek. Dzięki histologii selektywne zbieranie za pomocą mikrodysekcji laserowej zbliża nas do rzeczywistości patomiki. Wstępne definiowanie zwrotu z inwestycji w tkanki za pomocą sztucznej inteligencji ogranicza czas przebywania preparatów tkankowych w temperaturze otoczenia, zmniejsza wysiłek siły roboczej związany z wykonywaniem tych zbiorów i zmniejsza zmienność operatora.
Technika ta ma szerokie zastosowanie do wszelkich badań opartych na chorobach lub patologiach, obejmujących pobieranie lub wzbogacanie określonych populacji komórkowych z próbek tkanek. Ta metoda jest prosta dla użytkowników z podstawową wiedzą histopatologiczną i doświadczeniem w LMD. Kluczem jest upewnienie się, że wytnąłeś czysty kalibrator dla komórek i dobrze wytrenować klasyfikator.
Na początek upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche przed przecięciem referencyjnych wskaźników kalibracji. Otwórz oprogramowanie Laser Microdissection i otwórz domyślny plik sld z kropką kalibracji w opcji importu kształtów. Załaduj szkiełko chusteczką skierowaną w dół, stroną z etykietą bliżej operatora.
W uchwycie szkiełka na stoliku do mikrodysekcji laserowej wybierz opcję automatycznego ustawiania ostrości przed cięciem. Korzystając z mikroskopu laserowego i domyślnego pliku sld z kropką kalibracyjną, wytnij wzorce kalibracji w membranie PEN. Tylko w przypadku kolekcji wzbogaconych o mikrodysekcję laserową otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.
Wybierz otwarte obrazy, a następnie w wyskakującym okienku wybierz plik obrazu z kropką svs wygenerowany podczas skanowania slajdu. Przejdź do zakładki adnotacje, wybierz i użyj narzędzia adnotacji prostokąta, aby narysować ramkę wokół tkanki. Wybierz adnotację pola i kliknij prawym przyciskiem myszy obraz.
Wybierz zaawansowane menu rozwijane, a następnie kliknij opcję partycjonowania. Ustaw rozmiar kafelka i odstęp odpowiednio między 500 i 40, a następnie wybierz opcję OK, aby wygenerować kafelki. Zaznacz i usuń adnotację pola obwodu używaną do generowania kafelków.
Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji kropkowej. Umieść zapisaną kopię algorytmu dapa języka Python, opracowanego w celu scalania warstw adnotacji sklasyfikowanych przez sztuczną inteligencję w tym samym folderze, co plik adnotacji kafelkowych. Skopiuj nazwę pliku adnotacji z kafelkami.
Otwórz program w języku Python przy użyciu bezczynnego zintegrowanego środowiska programistycznego i wklej nazwę pliku adnotacji kafelkowej między cytatami u dołu programu. Wybierz menu rozwijane uruchamiania, a następnie kliknij przycisk uruchom moduł. Poczekaj na wygenerowanie kilku plików, w których wszystkie adnotacje kafelkowe zostaną scalone w jednej warstwie.
Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i przejdź do karty adnotacji. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk importuj lokalny plik adnotacji.
W wyskakującym okienku wybierz scalony plik adnotacji kropkowej, który został wygenerowany przez skrypt. Upewnij się, że wszystkie zaimportowane kafelki znajdują się w tej samej warstwie adnotacji. Na karcie klasyfikatora postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby podświetlić reprezentatywne obszary guza, zrębu i czystego szklanego tła szkiełka.
Przed uruchomieniem klasyfikatora kliknij zaawansowane opcje klasyfikatora, wybierz żądaną warstwę adnotacji, zaznaczając pole ROI lub pola na karcie adnotacji. Użyj opcji warstwy adnotacji z menu akcji klasyfikatora, aby uruchomić klasyfikator. Po zakończeniu analizy klasyfikatora przejdź do karty adnotacji i wybierz warstwę adnotacji wygenerowaną na podstawie analizy.
Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij opcję usuń wszystkie warstwy oprócz bieżącej, aby usunąć wszystkie inne warstwy adnotacji z obrazu. Następnie wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje jako plik adnotacji kropkowej. Utwórz folder dla sesji lub projektu i zapisz plik adnotacji kropkowej w podfolderze.
Oznaczone unikatowym identyfikatorem slajdu. Przejdź do karty adnotacji, wybierz listę rozwijaną działań na warstwie, a następnie kliknij usuń wszystkie warstwy, aby usunąć wszystkie adnotacje z obrazu. Wybierz narzędzie Pióro i narysuj krótką linię od każdego wzorca kalibracji.
Narysuj linie ze znaków w następującej kolejności. Lewy górny róg, prawy górny róg, prawy dolny róg. Wybierz menu rozwijane akcji warstwy, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać adnotacje kafelkowe jako plik adnotacji.
Dodaj calib podkreślenia do nazwy pliku i umieść plik w podfolderze zawierającym współrzędne kształtów sąsiadujących. Skopiuj adres projektu głównego. Otwórz malliator skryptów generujących import XML przy użyciu bezczynnego zintegrowanego środowiska programistycznego, a następnie wklej adres folderu projektu między cudzysłowy u dołu skryptu.
Wybierz menu rozwijane uruchamiania, a następnie kliknij przycisk uruchom moduł, aby wykonać skrypt. Załaduj oznaczone szkiełko membranowe z tkanką skierowaną w dół i stroną z etykietą bliżej operatora do uchwytu szkiełka na stoliku mikroskopu laserowego. Wybierz opcję importuj kształty z menu rozwijanego pliku.
Wybierz plik importu LMD z kropką XML wygenerowany dla slajdu. Wybierz nie w wyskakującym okienku, aby uniknąć wczytywania punktów odniesienia z pliku, i nie w drugim wyskakującym okienku, aby uniknąć używania wcześniej zapisanych punktów odniesienia do kalibracji. Postępuj zgodnie z instrukcjami aplikacji do mikropreparacji laserowej i dopasuj krzyżyk kalibracyjny do każdego z trzech wzorców kalibracji na szkiełku.
Poszukaj elementów odniesienia kalibracji, które pojawiają się w lewym górnym, prawym górnym rogu i prawym dolnym rogu obrazu slajdu. W oprogramowaniu do analizy obrazu, które będzie odpowiadało punktom referencyjnym szkiełka z odwróconej mikrodysekcji laserowej na stoliku mikroskopowym. Przełączaj się między użyciem obiektywu subiektywnego 5x do lokalizacji i obiektywu subiektywnego 63x, aby wyrównać każdy punkt odniesienia kalibracji.
Wybierz nie w wyskakującym okienku, aby uniknąć zapisywania punktów odniesienia do pliku, i w porządku w drugim wyskakującym okienku, aby potwierdzić, że slajd został wstawiony. Przesuń obiektyw subiektywny 5x na miejsce i wybierz tak w wyskakującym okienku, aby użyć rzeczywistego powiększenia. Gdy pojawią się zaimportowane kształty, ustaw ostrość aparatu na tkance.
Wyróżnij i zaznacz wszystkie kształty w oknie listy kształtów. Przeciągnij je na miejsce, używając jednej lub dwóch adnotacji w polu widzenia jako odniesień i wyrównaj pionową oś z do cięcia za pomocą lasera. Załaduj probówki do uniwersalnego uchwytu na probówki przeznaczonego do mikroprobówek PCT.
Przejrzyj zaimportowane kształty i przypisz je do odpowiedniej pozycji rury do pobrania. Naciśnij start cięcie, aby uruchomić laser. Rozładować i zamknąć probówkę z próbką chusteczkami LMD i umieścić na suchym lodzie.
Po termocyklingu i odwirowaniu, LMD pobrał próbki tkanek, usunął i wyrzucił mikrokapsułki z mikroprobówek PCT. Dodaj trypsynę, dodaj proporcję jednego mikrograma na 30 milimetrów kwadratowej tkanki. I włóż mikro tłuczek do mikrorurki za pomocą narzędzia do mikronasadek.
Przenieś mikroprobówki do naboju z cyklem beczkowym i zmontuj cały wkład. Umieść nabój w komorze ciśnieniowej cyklu beczki i zabezpiecz pokrywę. Cykl beczki przy 45 000 PSI przez 50 sekund i ciśnienie atmosferyczne przez 10 sekund w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 cykli.
W przypadku analizy LC-MS MS należy załadować fiolki automatycznego próbnika w odpowiednich pozycjach do automatycznego próbnika do chromatografii cieczowej. Zamknij automatyczny próbnik i przeanalizuj poszczególne frakcje odpowiednią metodą gradientu i spektrometrii mas. Nienadzorowane grupowanie hierarchiczne przy użyciu 100 najbardziej zmiennych białek.
Stwierdzono segregację typów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości i raka jasnokomórkowego jajnika z mikrodysekcji laserowej wzbogaconej i całych próbek guza. Natomiast mikrodysekcja laserowa wzbogaciła próbki zrębu zarówno z surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości, jak i raka jasnokomórkowego jajnika. Zgrupowane razem i niezależnie od mikrodysekcji laserowej wzbogacone próbki guza i całego guza.
Spośród 5 971 oznaczonych ilościowo białek, 215 uległo znaczącym zmianom między całymi kolekcjami guzów z próbek surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości i raka jasnokomórkowego jajnika. Spośród 76 białek sygnaturowych w ogóle oznaczonych ilościowo przez Hughesa, 57 zostało współoznaczonych ilościowo w tym zestawie danych i było silnie skorelowanych. Postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania Indica Lab i udoskonalając klasyfikator, uzyskano najdokładniejsze wyniki.
Wszystko inne jest ustandaryzowane. Tkanka pobrana za pomocą tego opartego na sztucznej inteligencji przepływu pracy LMD jest kompatybilna z różnymi dalszymi aplikacjami analitycznymi, w tym opisaną tutaj proteomiką opartą na spektrometrii mas lub analizami genomowymi, transkryptomicznymi lub innymi analizami omicznymi.
Przegląd
Ten protokół opisuje przepływ pracy o wysokiej efektywności dla segmentacji opartej na sztucznej inteligencji potwierdzonych patologicznie regionów zainteresowania z barwionych obrazów tkanek. Wzbogaca ono uodparniające populacje komórek za pomocą mikrodyssekcji laserowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Patologia
- Histologia
Tło
- Analiza obrazów oparta na sztucznej inteligencji poprawia segmentację tkanek.
- Mikrodyssekcja laserowa umożliwia selektywne pobieranie określonych populacji komórek.
- Ta metoda zmniejsza zmienność operatora i wysiłek personelu.
- Może być zastosowana w różnych badaniach związanych z chorobami lub patologią.
Cel badania
- Aby usprawnić proces zbierania określonych populacji komórkowych z próbek tkankowych.
- Aby zminimalizować czas przechowywania slajdów tkankowych w temperaturze pokojowej.
- Aby poprawić dokładność analizy histologicznej poprzez integrację sztucznej inteligencji.
Zastosowane metody
- Algorytmy sztucznej inteligencji do definiowania regionów zainteresowania (ROI) w tkankach.
- Mikrodyssekcja laserowa do precyzyjnego pobierania tkanek.
- Oprogramowanie do analizy obrazów do annotacji i klasyfikacji.
- Skrypty Pythona do łączenia warstw adnotacji klasyfikowanych przez sztuczną inteligencję.
Główne wyniki
- Udana segmentacja obrazów tkanek przy użyciu sztucznej inteligencji.
- Zmniejszenie czasu i wysiłku wymaganego do przetwarzania tkanek.
- Poprawa spójności w zbieraniu populacji komórek.
- Zadokumentowana przydatność w różnych kontekstach badawczych.
Wnioski
- Integracja sztucznej inteligencji w analizie tkanek poprawia efektywność badań.
- Ta metoda jest dostępna dla użytkowników z podstawową wiedzą na temat histopatologii.
- Możliwość szerszych zastosowań w badaniach patologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
AI-guided laser microdissection enables precise, high-throughput isolation of histology-defined cell populations from the tumor microenvironment, supporting robust proteomic and multiomic analyses. This workflow reduces operator variability and manual effort, enhancing reproducibility and scalability for discovery-stage oncology research. Integration with digital pathology and mass spectrometry positions this method as a critical enabler for translational biomarker discovery and mechanistic de-risking in solid tumor portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables selective enrichment of tumor, stroma, and immune cell populations for pathway interrogation.
- Supports functional target validation by isolating pathology-confirmed regions of interest.
- Reduces biological ambiguity through AI-driven segmentation and classifier training.
- Facilitates predictive confidence in early-stage biomarker and target studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, histology-resolved samples for downstream proteomic and multiomic workflows.
- Standardizes sample collection, minimizing operator-dependent variability and dwell time.
- Enables reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Scales to high-throughput studies, supporting platform reuse across oncology programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample enrichment with disease-relevant cellular heterogeneity for translational biomarker studies.
- Maintains continuity from digital pathology review through proteomic analysis.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust, cell-type-specific molecular data.
- Enables mechanistic de-risking in preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This AI-enabled LMD workflow bridges digital pathology, sample enrichment, and quantitative proteomics, supporting the continuum from early discovery through translational research.
- Discovery Biology: Provides high-fidelity isolation of cell populations for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers standardized, reproducible samples for downstream assay and screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative proteomic readouts for comparative analysis of tumor heterogeneity.
- Translational Research: Enables alignment of molecular data with histopathological features for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a harmonized, generalizable workflow adaptable to diverse solid tumor and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker studies.
- Operational Value: Standardizes tissue segmentation and collection, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, multiplexed analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets through high-content molecular profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histopathology, digital image analysis, and LMD operation.
- Depends on access to AI-enabled image analysis software and high-resolution mass spectrometry infrastructure.
- Demands rigorous classifier training and calibration for accurate tissue segmentation.
- Necessitates cross-team standardization of annotation and collection protocols.
- Adaptable to various tissue types and omic analyses, but classifier performance may vary by indication.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
LMD Slide(s) Preparation
1:58
Automated Feature Selection Using Image Analysis Software
6:58
Laser Microdissectionvvv
9:41
Protein Digestion by Pressure-Cycle Technology (PCT) and Sample Analysis Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
10:55
Results: Analysis of the Proteins in LMD-Enriched and Whole Tumor Samples
12:09
Conclusion
