Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Nasz protokół opisuje prostą i niezawodną metodę testu resorpcji osteoklastycznej. Zastosowanie płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia można łatwo przygotować i zwizualizować przy użyciu materiałów dostępnych w laboratorium. W przeciwieństwie do nieprzezroczystych plastrów kości lub zębiny, powłoka z fosforanu wapnia umożliwia jednoczesną wizualizację wżerów resorpcyjnych i komórek.

W tym protokole używamy PBMC do różnicowania osteoklastów. Jednak może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak monocyty pochodzące ze szpiku kostnego lub surowe komórki 264,7. Najpierw weź płaską płytkę do hodowli komórkowej z 96 dołkami i odpipetuj 300 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu fosforanu wapnia do każdej studzienki.

Następnie przykryj płytkę pokrywką i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. Po trzech dniach odessać roztwór do wstępnego zwapnienia z wstępnie zwapnionych 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych i dodać 300 mikrolitrów roztworu fosforanu wapnia do każdej studzienki. Przykryj płytki pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień.

Następnie odwróć płytkę, aby wylać roztwór i dokładnie umyj płytkę trzykrotnie wodą dejonizowaną. Natychmiast osusz płytkę za pomocą suszarki do włosów lub sprężonego dwutlenku węgla lub azotu, aby zachować jednolitą powierzchnię. Teraz naświetlaj powlekaną płytkę na czystej ławce promieniami ultrafioletowymi przez godzinę.

Natychmiast użyj powlekanej płytki lub uszczelnij ją Parafilmem i przechowuj w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć 15 mililitrów świeżej krwi równą objętością PBS i wymieszać je przez kilkakrotne odwrócenie lub pipetowanie. Następnie weź 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, przechyl probówkę i ostrożnie ułóż 30 mililitrów rozcieńczonej próbki krwi na 15 mililitrach roztworu gradientu gęstości.

Później odwirować probówkę w wahadłowym wirniku kubełkowym bez przerwy pod ciśnieniem 810 razy G przez 20 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie odessaj górną warstwę, pozostawiając niezakłóconą warstwę komórki jednojądrzastej na granicy faz. Ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Napełnij probówkę PBS, wymieszaj i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić PBMC w kompletnym alfa-MEM zawierającym 20 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów i wysiać 2,5 razy 10 do piątych komórek na centymetr kwadratowy PBMC w kolbie. Inkubować płytki pokryte fosforanem wapnia z 50 mikrolitrami płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie przemyj kolbę dwukrotnie PBS, aby odłączyć prekursory osteoklastów od martwych lub nieprzylegających komórek, a następnie dodaj cztery mililitry trypsyny na kolbę o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Po 30 minutach przerwij trawienie, dodając cztery mililitry kompletnego alpha-MEM, a następnie ostrożnie odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki i policz całkowitą liczbę komórek za pomocą komory liczącej.

Odwiruj probówkę przy 350 razy G przez siedem minut, aby osadzać komórki i ponownie zawiesić osad i uzupełnić alpha MEM zawierający M-CSF i RANKL, aby uzyskać jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Odessać płodową surowicę bydlęcą z płytki pokrytej fosforanem wapnia i odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzienkę. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie PBS.

Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut i ponownie umyj PBS. W celu barwienia dodaj bufor przepuszczalny do utrwalonych komórek i inkubuj je przez pięć minut. Aby wybarwić włókna aktynowe, inkubuj komórki ze 100 mikrolitrami roztworu falloidyny znakowanego Alexa Fluor 546 w PBS przez 30 minut, a następnie odessaj roztwór barwiący i zabarwij jądra za pomocą 100 mikrolitrów Hoechst przez 10 minut.

Zabarwić powłokę fosforanu wapnia 100 mikrolitrami 10 mikromolowej kalceiny i PBS przez 10 minut. Po trzykrotnym umyciu PBS uchwyć obrazy. W przypadku barwienia powłoki fosforanem wapnia metodą Von Kossa dodaj 50 mikrolitrów 5% azotanu srebra i wody dejonizowanej do każdej studzienki i inkubuj płytkę pod promieniowaniem ultrafioletowym przez jedną godzinę, aż powłoka na dnie studzienek zmieni kolor na brązowy.

Powłoka fosforanu wapnia na dnie 96 płytek dołkowych wydawała się być jednolita i dobrze przylegała. Po dziewięciu dniach hodowli w M-CSF i RANKL na płytkach pokrytych fosforanem wapnia, prekursory osteoklastów utworzyły doły resorpcyjne i duże osteoklasty. Wielojądrzaste osteoklasty znajdujące się w dołach wyrażały wysokie poziomy TRAP.

Dojrzałe osteoklasty wykazywały obecność trzech lub więcej jąder i odrębnego pierścienia aktynowego. Zielona powłoka fosforanu wapnia wykazała obecność czarnych wgłębień resorpcyjnych. Obrazy fluorescencji obszaru dołu mierzono za pomocą narzędzia progowego obrazu J. Liczbę i wielkość osteoklastów obliczono za pomocą menedżera ROI i narzędzia do selekcji wielokątów obrazu J. Prekursory osteoklastów hodowane przy braku RANKL nie mogły tworzyć dołów resorpcyjnych, jednak M-CSF i RANKL ułatwiły tworzenie dołów osteoklastogennych.

Obszar wgłębienia został określony ilościowo za pomocą obrazu J. Natychmiastowe wysuszenie pokrytej płytki za pomocą przepływu powietrza pomaga uzyskać jednolitą powłokę fosforanu wapnia. W przeciwnym razie ma skłonność do tworzenia grubszej powłoki na środku studni.