Technika znakowania immunologicznego do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji białek

Zacznij od umycia nieruchomego odcinka serca w buforze kakodylanu sodu, który stabilizuje strukturę tkanki. Zanurz sekcję w czterotlenku osmu, aby wybarwić lipidy błony.

Potraktuj octanem sodu, aby utrzymać optymalne pH do barwienia.

Dodaj octan uranylu, aby wybarwić biomolekuły, zapewniając lepszy kontrast podczas mikroskopii.

Odwodnić tkankę w rosnących stężeniach etanolu, a następnie acetonu.

Zanurz tkankę w żywicy, uzyskaj ultracienkie skrawki i przenieś je na siatkę mikroskopową.

Wprowadź metaperiodynian sodu, aby usunąć tetratlenek osmu, demaskując białko komórkowe.

Związek utlenia również glikoproteinę, tworząc reaktywne grupy aldehydowe, które są neutralizowane przez obróbkę glicyną.

Wprowadzić bufor blokujący, zapobiegający niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Dodać przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla białka docelowego, a następnie biotynylowane przeciwciała drugorzędowe.

Dodaj kropki kwantowe sprzężone ze streptawidyną, które wiążą się z biotyną.

Pod mikroskopem elektronowym obszary znakowane kropkami kwantowymi wykazują wyższy kontrast, co pomaga w precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej docelowego białka.

Po 24 godzinach od utrwalenia przemyć tkankę w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu dwa razy przez 20 minut. Usunąć tkankę z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć w 2% roztworze tetratlenku osmu na 4 godziny w temperaturze pokojowej.

Po osmikacji zanurz tkankę w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz tkankę w 2% roztworze octanu uranylu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po barwieniu octanem uranylu należy kolejno odwodnić tkankę za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu.

Zanurz odwodnioną tkankę w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, jak opisano w manuskrypcie. Umieść tkankę w świeżej żywicy w 8-milimetrowych mikroforemkach, foremkach i utwardź osadzoną tkankę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez noc. Po znalezieniu obszaru zainteresowania za pomocą noża ultra 45 stopni, wyprodukuj ultracienkie sekcje w kolorze bladego złota. Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200.

Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu, umieszczając 20 mikrolitrów roztworu trawiącego metaperiodynian sodu na czystej folii parafinowej. Umieść wysuszoną siatkę z kawałkami tkanki na kropli roztworu do trawienia. Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj wytrawione skrawki tkanki, umieszczając je na kropli wody destylowanej na 60 sekund.

Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatkę przekroju na kropli 0,05 molowego roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny. Umieść siatkę sekcyjną w 10 do 20 mikrolitrach roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej.

Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść sekcje siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut. Inkubować sekcje siatki z pierwotnym przeciwciałem przez 1 godzinę 30 minut w wilgotnej komorze. Osuszyć siatkę i umyć jej sekcje rozcieńczalnikiem z przeciwciałami dwa razy po 5 minut każda.

Inkubować sekcje siatki z biotynylowanym przeciwciałem wtórnym przez 1 godzinę w wilgotnej komorze. Po wysuszeniu kratki należy umyć jej sekcje dwukrotnie rozcieńczalnikiem do przeciwciał przez 5 minut każda. Inkubować sekcje siatki w dostępnym w handlu QD sprzężonym ze streptawidyną przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową. Po wysuszeniu krawędzi siatki za pomocą bibuły filtracyjnej, umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na dwie minuty, a następnie osusz krawędzie siatki do wyschnięcia.