Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów

Metoda ta łączy mikroskop konfokalny z mikrotensjometrem ciśnienia kapilarnego, tworząc potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania granicy faz płynu z krzywą w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Technika ta może badać zależności między strukturą i funkcją materiałów powierzchniowo czynnych poprzez jednoczesne pomiary właściwości powierzchni i konfokalne obrazy morfologii powierzchni na wysoce zakrzywionych powierzchniach. Stawiamy hipotezę, że produkty stanu zapalnego hamują działanie surfaktantu płucnego, powodując problemy z oddychaniem związane z dokładnym zespołem niewydolności oddechowej.

Drzwi te mogą badać właściwości i morfologię środków powierzchniowo czynnych płuc oraz stabilność płuc poddanych działaniu takich materiałów. Aby rozpocząć, zmontuj komórkę CPM, umieszczając dużą stronę kapilary w górnej części komórki, aż przepchnie się do spodu komórki. Delikatnie dokręć złącze szczytowe, aby zabezpieczyć kapilarę, a następnie przymocuj rurkę z pompy mikroprzepływowej do większej strony kapilary.

W razie potrzeby podłączyć zbiornik do wymiany rozpuszczalnika i/lub kąpiel kontrolującą temperaturę do odpowiednich wlotów i wylotów w komórce CPM. W przeciwnym razie zatkaj nieużywane wloty i wyloty. Przymocuj komórkę CPM do stolika mikroskopu konfokalnego, z grubsza wyrównując ją z obiektywem CFM, kamerą CPM i źródłem światła CPM.

Otwórz przepływ gazu do pompy mikroprzepływowej przy zalecanym ciśnieniu roboczym pompy i upewnij się, że przepływ do kapilary jest otwarty. Uruchom wirtualny interfejs CPM, ustawiając ciśnienie bazowe na 25 milibarów i przełączając się w tryb kontroli ciśnienia. Następnie napełnij kuwetę CPM wodą za pomocą pipety.

Skup się na końcówce kapilarnej za pomocą kamery mikrotensjometru i ułóż annus tak, aby nakładał się na pęcherzyk. Doprowadź obiektyw zanurzeniowy mikroskopu konfokalnego do kontaktu z płynem w komórce i ustaw ostrość na pęcherzyku za pomocą mikroskopu konfokalnego. Kliknij resetuj bańkę i upewnij się, że utworzyła się nowa bańka.

Jeśli bańka nie pęknie, zwiększ ciśnienie resetowania lub zwiększ czas opóźnienia resetowania w zakładce resetowania bąbelków poniżej viewokienko. Wyjmij wodę za pomocą strzykawki bezpośrednio do komórki, opróżnij ją i ponownie zamocuj. Wypełnij komórkę żądaną próbką.

Korzystanie z autoklawowanej pipety utrzymuje oprogramowanie CPM w trybie kontroli ciśnienia, zapewniając, że początkowe napięcie powierzchniowe wynosi około 73 miliniutonów na metr podczas tworzenia nowego interfejsu pęcherzykowego. Po określeniu promienia nowo utworzonego bąbelka wprowadź tę wartość do kontrolki obszaru linii środkowej i zmień typ kontrolki na kontrolkę obszaru, klikając kartę kontroli obszaru. Rozpocznij nagrywanie konfokalnego wideo, a następnie kliknij resetuj bańkę i natychmiast kliknij zbierz dane.

Dostosuj szybkość zapisu danych zgodnie z całkowitym czasem absorpcji próbki, przesuwając pasek. Po zakończeniu eksperymentu. Zapisz plik, wybierając odpowiednią ścieżkę do pliku i klikając przycisk Zapisz.

Zatrzymaj i zapisz nagranie również w CFM. Wprowadź żądaną wartość bazową procentu oscylacji i częstotliwości oscylacji, a następnie wybierz odpowiednią zakładkę, decydując, czy oscylacja będzie oscylacją ciśnienia, oscylacją obszarową czy oscylacją krzywizny. Rozpocznij nagrywanie konfokalnego wideo i kliknij zbierz dane w oprogramowaniu CPM.

Wybierz szybkość akwizycji danych, aby zapewnić odpowiednią liczbę punktów danych dla każdego cyklu oscylacji. Jeśli pożądane są inne amplitudy lub częstotliwości oscylacji, zmień wartości podczas eksperymentu i zapisz wyniki. Najpierw włóż rurkę wlotową pompy perystaltycznej do butelki z żądanym roztworem do wymiany i włóż rurkę wylotową do pojemnika na odpady.

Rozpocznij nagrywanie wideo w oprogramowaniu konfokalnym, a następnie kliknij zbierz dane w oprogramowaniu CPM. Następnie ustaw prędkość pompy perystaltycznej. Jeśli konieczna jest wymiana wielu płynów, zatrzymaj pompę perystaltyczną i podłącz wlot do innego roztworu do wymiany.

Po zakończeniu wymiany zapisz wyniki, jak pokazano wcześniej. Wyniki mikrotensjometru dla absorpcji stałego ciśnienia wykazały, że powierzchnia pęcherzyków znacznie zwiększa się w trakcie badania i prowadzi do znacznie wolniejszej absorpcji niż w przypadku stałej powierzchni. Podczas procesu absorpcji sygnał fluorescencyjny z granicy faz początkowo był niski i wzrastał w miarę absorpcji środka powierzchniowo czynnego do interfejsu.

Jeśli środek powierzchniowo czynny tworzy domeny powierzchniowe, można zaobserwować, jak domeny te tworzą się i rosną. Podczas wykonywania badania oscylacji, oscylacja jest naprawdę sinusoidalna tylko dla parametru, który jest kontrolowany. Jak pokazano tutaj, w przypadku badania o kontrolowanej powierzchni jest to ważne przy obliczaniu modulatywności dylatacyjnej powierzchni, ponieważ oscylacja w tym obszarze musi być sinusoidalna.

Dane dotyczące napięcia powierzchniowego i powierzchni zebrane z badania oscylacji wykorzystano do bezpośredniego obliczenia międzyfazowego modułu dylatacyjnego warstwy środka powierzchniowo czynnego. Podczas oscylacji monowarstwy fosfolipidów ruch skondensowanych domen czarnej cieczy można zaobserwować w całej ciągłej kolorowej fazie ekspandowanej cieczy. Odrębne domeny na interfejsie zreorganizowały się w rozgałęziającą się sieć, która rozrosła się, obejmując interfejs, gdy oscylacje miały miejsce na zakrzywionej bańce.

Potwierdza to jednoczesna zmiana napięcia powierzchniowego i powierzchniowego modułu dylatacyjnego. Podczas badania wymiany rozpuszczalnika dla monowarstwy środka powierzchniowo czynnego płuc z roztworem buforowym, a następnie roztworem lasso PC, morfologia domen zmieniła się drastycznie w miarę zachodzenia wymiany. Ważne jest, aby wizualnie śledzić oscylację i przypinanie pęcherzyka, aby upewnić się, że kapilara jest kwadratowa, a bańka zachowuje swój kulisty kształt.

Oprócz granic faz powietrze-woda, można również badać interfejsy olej-woda w celu określenia stabilności i właściwości emulsji. Technika ta oferuje podejście do konstruowania relacji właściwości struktury interfejsów krzywych za pomocą pojedynczych zmian. Pozwala to na nową eksplorację czynników rządzących morfologią międzyrasową, które wcześniej badano tylko na płaskich powierzchniach międzyrasowych.