Name: Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę mikrotensjometru z mikroskopią konfokalną do badania dynamicznych interfejsów płyn-płyn. Technika umożliwia jednoczesny pomiar właściwości powierzchniowych i wizualizację morfologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie obrazy z mikroskopii konfokalnej uzyskano za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego Nikon A1RHD Multiphoton. Dziękujemy za wskazówki i pomoc personelu pomocniczego, zwłaszcza Guillermo Marquesa, z Uniwersyteckiego Centrum Obrazowania na Uniwersytecie Minnesoty. Prace te były wspierane przez NIH Grant HL51177. SI był wspierany przez Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Połączona metoda CPM/CFM jest potężnym narzędziem do badania dynamiki, równowagi i morfologii powierzchni międzyfazowych. Niniejszy protokół opisuje kroki niezbędne do uzyskania danych przy użyciu CPM/CFM.
Rysunek 2 przedstawia konstrukcję ogniwa z zaznaczonymi kanałami dla kapilary, rozpuszczalnika i wymiany ciepła. Wlot dla wymiany rozpuszczalnika powinien znajdować się na dole ogniwa, natomiast wylot na górze, aby zapobiec przepełnieniu ogniwa podczas wymiany. ...

Powierzchnie międzyfazowe powietrze-woda pokryte warstwami surfaktantów występują powszechnie w życiu codziennym. Iniekcje surfaktantowo-wodne są stosowane w celu zwiększenia odzysku ropy z wyeksploatowanych złóż oraz jako roztwory do szczelinowania hydraulicznego gazu i ropy z łupków. Piany gaz-ciecz oraz emulsje ciecz-ciecz są powszechne w wielu procesach przemysłowych i naukowych jako smary i środki czyszczące, a także występują często w żywności. Surfaktanty i białka na powierzchniach międzyfazowych stabilizują konformacje przeciwciał podczas pakowania, przechowywania i podawania1,2,3,4,5, stabilność filmu łzowego w oku6,7,8 oraz mechanikę płucną9,10,11,12,13,14,15.
Badanie substancji powierzchniowo czynnych (surfaktantów) adsorbujących się na granicach faz oraz ich właściwości ma długą historię, w której wykorzystano wiele różnych technik eksperymentalnych16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Niedawnym osiągnięciem jest mikrotensjometr ciśnienia kapilarnego (CPM), który umożliwia badanie właściwości międzyfazowych na silnie zakrzywionych granicach faz w znacznie mniejszej skali długości, przy jednoczesnym wykorzystaniu znacznie mniejszej ilości materiałów niż w innych popularnych metodach9,23,24,25. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna (CFM) może być stosowana do badania morfologii lipidów i białek na granicach powietrze-woda w CPM22 lub na korytach Langmuira20,26,27,28,29. W niniejszej pracy połączono CPM i CFM, aby powiązać zjawiska morfologiczne z dynamicznymi i równowagowymi właściwościami międzyfazowymi w celu opracowania relacji struktura-funkcja dla granic faz biologicznych i technologicznych.
W systemach powierzchniowych surfaktantów istnieje wiele istotnych parametrów, które można badać za pomocą CPM-CFM. W metodzie CPM pęcherzyk powietrza o średnicy 30-200 µm jest unieruchomiony na końcówce szklanej kapilary. Wcześniejsze wersje CPM kontrolowały różnicę ciśnienia kapilarnego między wnętrzem a zewnętrzną stroną pęcherzyka poprzez kolumnę wodną i oscylacyjną pompę strzykawkową9,30; nowa opisana tutaj wersja zastępuje je mikroprzepływową pompą sterowaną komputerowo o wyższej precyzji. Napięcie powierzchniowe (γ) wyznacza się za pomocą równania Laplace'a, ΔP = 2γ/R, na podstawie spadku ciśnienia na granicy faz ustalonego przez pompę, ΔP, oraz analizy optycznej promienia krzywizny pęcherzyka, R. Dynamiczne napięcie powierzchniowe granicy faz może być określane z rozdzielczością czasową 10 ms po wytworzeniu nowego pęcherzyka w kontakcie z cieczą zawierającą rozpuszczalny surfaktant. Dynamikę adsorpcji surfaktanta można opisać za pomocą klasycznego równania Warda-Tordaia10,31, aby wyznaczyć kluczowe właściwości surfaktanta, w tym dyfuzyjność, stopień pokrycia powierzchni oraz zależność między stężeniem w objętości a równowagowym napięciem powierzchniowym. Po osiągnięciu równowagowego napięcia powierzchniowego można oscylować powierzchnią międzyfazową, aby zmierzyć moduł dylatacyjny, <img alt="Równanie reologiczne E*=A₀(∂γ/∂A) szczegółowo opisujące naprężenie-odkształcenie w badaniu dynamiki płynów." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">, rejestrując zmiany napięcia powierzchniowego wywołane niewielkimi zmianami powierzchni pęcherzyka, A32. W przypadku bardziej złożonych granic faz, które tworzą własne struktury wewnętrzne, takie jak sploty polimerów lub białek, napięcie powierzchniowe zostaje zastąpione bardziej ogólnym naprężeniem powierzchniowym4,33, <img alt="Równanie: τ:E* = A₀(∂τ/∂A), ilustrujące dynamiczną równowagę w badaniu matematycznym." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">.
Stabilność płuc podczas oddychania może być bezpośrednio powiązana z utrzymaniem zarówno niskiego napięcia powierzchniowego, jak i wysokiego modułu dylatacyjnego na granicy faz powietrze-ciecz w pęcherzykach płucnych9,10. Wszystkie wewnętrzne powierzchnie płuc są wyścielone ciągłą, mikronową warstwą płynu wyściełającego nabłonek w celu utrzymania nawodnienia tkanek34. Płyn wyściełający nabłonek składa się głównie z wody, soli oraz różnych innych białek, enzymów, cukrów i surfaktantu płucnego. Podobnie jak w przypadku każdej zakrzywionej granicy faz ciecz-para, indukowane jest ciśnienie kapilarne, przy czym ciśnienie wewnątrz pęcherzyka (lub pęcherzyka powietrznego) jest wyższe. Jednak gdyby napięcie powierzchniowe było stałe w całym obszarze płuc, równanie Laplace'a, ΔP = 2γ/R, wskazywałoby, że mniejsze pęcherzyki miałyby wyższe ciśnienie wewnętrzne w stosunku do większych pęcherzyków, co wymuszałoby przepływ zawartości gazowej z mniejszych pęcherzyków do większych, o niższym ciśnieniu. Zjawisko to jest znane jako „niestabilność Laplace'a”9,35. W rezultacie najmniejsze pęcherzyki zapadałyby się, wypełniając się cieczą, co utrudniałoby ich ponowne nadmuchanie i prowadziło do zapadnięcia się części płuca, podczas gdy inne części ulegałyby nadmuchaniu – oba te stany są typowymi objawami zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Jednak w prawidłowo funkcjonującym płucu napięcie powierzchniowe zmienia się dynamicznie, gdy powierzchnia międzyfazowa powietrze-płyn nabłonkowy w pęcherzyku rozszerza się i kurczy podczas oddychania. Jeśli <img alt="Równanie statycznej równowagi ΔP/R, 2γ/R; analiza formuły matematycznej." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> lub <img alt="Formuła nierówności (2E*−γ)&gt;0, użyta w analizie statycznej równowagi." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4">, ciśnienie Laplace'a maleje wraz ze zmniejszaniem się promienia i rośnie wraz ze zwiększaniem się promienia, co eliminuje niestabilność Laplace'a, stabilizując tym samym płuco9. Zatem <img alt="Moduł zespolony E*(ω), zachowanie wiskoelastyczne, analiza materiałowa, dziedzina częstotliwości." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5"> oraz jego zależność od częstotliwości, morfologii i składu monowarstwy oraz składu płynu pęcherzykowego mogą mieć kluczowe znaczenie dla stabilności płuc. System CPM-CFM dostarczył również pierwszych dowodów na wpływ krzywizny międzyfazowej na adsorpcję surfaktantu25, morfologię monowarstwy22 oraz moduł dylatacyjny9. Mała objętość (~1 mL) zbiornika w CPM pozwala na szybkie wprowadzenie, usunięcie lub wymianę fazy ciekłej i minimalizuje wymaganą ilość drogich białek lub surfaktantów10.
Kontrast w obrazie CPM-CFM wynika z rozkładu niewielkich frakcji lipidów lub białek znakowanych fluorescencyjnie na granicy faz16,27. Dwuwymiarowe monowarstwy surfaktantów często wykazują lateralną separację faz w zależności od napięcia powierzchniowego lub ciśnienia powierzchniowego, <img alt="Równanie statycznej równowagi π=γ₀−γ; koncepcja różnicy napięć powierzchniowych w mechanice płynów." src="/files/ftp_upload/64110/64110eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 6"> π jest różnicą między napięciem powierzchniowym czystej granicy faz ciecz-ciecz, γ0, a granicą faz pokrytą surfaktantem, γ. π można interpretować jako dwuwymiarowe „ciśnienie” wywołane oddziaływaniami cząsteczek surfaktantu na granicy faz, które działa w kierunku obniżenia napięcia powierzchniowego czystego płynu. Przy niskich ciśnieniach powierzchniowych monowarstwy lipidowe znajdują się w zdezorganizowanym stanie przypominającym ciecz; jest to znana jako faza ciekła rozszerzona (LE). W miarę wzrostu ciśnienia powierzchniowego i zmniejszania się powierzchni przypadającej na jedną cząsteczkę lipidu, lipidy orientują się względem siebie i mogą przejść przejście fazowe pierwszego rodzaju do uporządkowanej dalekozasięgowo fazy ciekłej skondensowanej (LC)16,20,27. Fazy LE i LC mogą współistnieć przy różnych ciśnieniach powierzchniowych i mogą być wizualizowane, ponieważ lipidy znakowane fluorescencyjnie są wypierane z fazy LC i segregują się do fazy LE. W rezultacie faza LE jest jasna, a faza LC jest ciemna podczas obrazowania za pomocą CFM16.
Celem niniejszej pracy jest opisanie kroków niezbędnych do budowy i obsługi połączonego mikrotensiometru z mikroskopem konfokalnym. Pozwoli to czytelnikowi na jednoczesne przeprowadzanie badań adsorpcji, pomiar napięcia powierzchniowego, badanie właściwości reologicznych oraz analizę morfologii międzyfazowej na mikronowej granicy rozdziału powietrze/woda lub olej/woda. Obejmuje to omówienie sposobu wyciągania, cięcia i hydrofobizacji wymaganych kapilar, instrukcje korzystania z trybów kontroli ciśnienia, krzywizny i powierzchni oraz transfer międzyfazowy nierozpuszczalnego surfaktantu na zakrzywiony interfejs mikrotensiometru.

<table><tbody><tr><td>1.5 Rurka Tygon OD</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>Rurka</td></tr><tr><td>A1RHD Wielofotonowy pionowy mikroskop konfokalny</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny roztwór</td><td></td><td></td> czyszczący <td>Kwas siarkowy i Alnochromix rozcieńczone wodą 50% objętościowo, poczekaj, aż będą klarowne przed rozcieńczeniem</td></tr><tr><td>Alnochromix</td><td>Alconox</td><td>2510</td><td>Zmieszany z kwasem siarkowym zgodnie z instrukcją dołączoną do opakowania i rozcieńczony w celu uzyskania kwaśnego roztworu czyszczącego</td></tr><tr><td>Nóż do szkła ceramicznego</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650471</td><td>HPLC Plus</td></tr><tr><td>Curosurf</td><td>Chiesi</td><td></td><td>&nbsp; Płuca Surfaktant</td></tr><tr><td>Di Water</td><td></td><td></td><td>18,5 M&Omega; - cm</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>dowolny</td><td></td><td>200 proof używany do hydrofobizacji, denaturowany używany do czyszczenia</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Model 190 oświetlacz światłowodowy</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>281900100</td><td>Źródło światła; inne źródła światła również powinny działać</td></tr><tr><td>Flow EZ F69 mbar z modułem Link</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-0069</td><td>Pompa mikroprzepływowa</td></tr><tr><td>Fluigent SDK VIs</td><td>Płynny Wymagany</td><td></td><td>dla wirtualnego interfejsu CPM</td></tr><tr><td>Uszczelki z fluoroelastomeru</td><td>Wykonane z arkusza Vitonu</td><td></td><td></td> o grubości 1 mm, patrz rysunek 3</tr><tr><td>Filtr gazu</td><td>Norgren</td><td>F07-100-A3TG</td><td>Umieszczony między pompą mikroprzepływową a regulatorem ciśnienia</td></tr><tr><td>Reduktor gazu</td><td>Norgren</td><td>10R0400R</td><td>Obniża ciśnienie z sorce do zakresu pompy, podłączonej do zakresu filtra gazu 2-120 psi</td></tr><tr><td>Szklany kapilarz</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10</td><td>Szkło borokrzemianowe OD 1,5 mm ID 0,86 mm</td></tr><tr><td>Szklana prowadnica</td><td>dowolna</td><td></td><td>75 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>84878</td><td>25 &mu; Szklana strzykawka L</td></tr><tr><td>Środek hydrofobizujący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>667420</td><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoro-oktylotrietoksysilan 98%, można zastąpić innym hydrofobowym trietoksysilanem</td></tr><tr><td>Nierozpuszczalny środek powierzchniowo czynny</td><td>Avanti</td><td>850355C-200mg</td><td>16:0 DPPC w chloroformie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>2017</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0650</td><td>Filtr długoprzepustowy 650 nm, długość fali musi usuwać wzbudzenie częstotliwości lazer</td></tr><tr><td>Lyso-PC</td><td>Avanti</td><td>855675P</td><td>16:0 Lyso PC 1-palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina</td></tr><tr><td>Masterflex L/S analogowy system pomp o zmiennej prędkości w/&nbsp; Głowica pompy Easy-Load II</td><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Masterflex</td><td>HV-77916-20</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>R2019</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Ściągacz kapilarny</td></tr><tr><td>Komórka mikrotensjometru i uchwyt</td><td></td><td></td><td>Komórka obrabiana z PEEK, uchwyt obrabiany z aluminium, patrz rysunek 3 i 4</td></tr><tr><td>Obiektyw mikrotensjometru</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 &infin;/0 WD 2.0 mm</td></tr><tr><td>NI Vision Development Module</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Wymagane do wirtualnego interfejsu CPM</td></tr><tr><td>Złączki palcowe PEEK</td><td>IDEX</td><td>F-120x</td><td>10-32 Porty stożkowe</td></tr><tr><td>Wtyczka PEEK</td><td>IDEX</td><td>P-551</td><td>10-31 Porty stożkowe</td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22492225</td><td>100 &mu; L - 1000 &mu; L, Autoklawizowane</td></tr><tr><td>kleszcze z tworzywa sztucznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Części hydrauliczne</td> Zawory 3-drogowe <td>Fischer Scientific</td><td></td><td>i inne części hydrauliczne do łączenia przewodów.</td></tr><tr><td>Badania Plus 1-kanałowy 100 &mu; L&ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td>Micro pipeter</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>dowolny</td><td></td><td>Używany do roztworu do czyszczenia kwasem</td></tr><tr><td>T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop konfokalny Obiektyw</td></tr><tr><td>Texas Red DHPE sól trietyloamoniowa</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>1395MP</td><td>Pompa próżniowa fluoroforowa</td></tr><tr><td></td><td>Gast</td><td>DOA-P704-AA</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej wizualizacja dynamicznych interfejsów

Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces

Adsorpcja cząsteczek powierzchniowo czynnych na granicy faz płyn-płyn jest powszechna w przyrodzie. Scharakteryzowanie tych granic faz wymaga pomiaru szybkości adsorpcji środków powierzchniowo czynnych, oceny równowagowych napięć powierzchniowych w funkcji masowego stężenia środka powierzchniowo czynnego oraz powiązania, jak zmienia się napięcie powierzchniowe ze zmianami w obszarze międzyfazowym po zrównoważeniu. Jednoczesna wizualizacja granicy faz za pomocą obrazowania fluorescencyjnego za pomocą szybkiego mikroskopu konfokalnego pozwala na bezpośrednią ocenę zależności struktura-funkcja. W mikrotensjometrze kapilarnym (CPM) półkulisty pęcherzyk powietrza jest przypinany na końcu kapilary w zbiorniku cieczy o objętości 1 ml. Ciśnienie kapilarne na granicy faz pęcherzyków jest kontrolowane przez komercyjny mikroprzepływowy regulator przepływu, który umożliwia kontrolę ciśnienia w oparciu o model, krzywiznę pęcherzyków lub obszar pęcherzyków w oparciu o równanie Laplace'a. W porównaniu z poprzednimi technikami, takimi jak rynna Langmuir i kropla wisząca, precyzja pomiaru i kontroli oraz czas reakcji są znacznie zwiększone; Zmiany ciśnienia kapilarnego mogą być stosowane i kontrolowane w ciągu milisekund. Dynamiczna reakcja interfejsu bąbelkowego jest wizualizowana przez drugą soczewkę optyczną, gdy bańka rozszerza się i kurczy. Kontur pęcherzyka jest dopasowywany do profilu kołowego w celu określenia promienia krzywizny pęcherzyka, R, a także wszelkich odchyleń od kołowości, które unieważniłyby wyniki. Równanie Laplace'a służy do określania dynamicznego napięcia powierzchniowego interfejsu. Po zrównoważeniu, sterowana komputerowo pompa mikroprzepływowa może narzucać małe oscylacje ciśnienia w celu oscylacji promienia pęcherzyka (częstotliwości 0,001-100 cykli/min) w celu określenia modułu dylatacyjnego Całkowite wymiary systemu są na tyle małe, że mikrotensjometr mieści się pod soczewką szybkiego mikroskopu konfokalnego, co pozwala na ilościowe śledzenie fluorescencyjnie znakowanych związków chemicznych z submikronową rozdzielczością boczną.

Głównym źródłem błędów pomiarowych są kapilary z defektami powstałymi albo podczas procesu cięcia (Rysunek 5A,B), albo podczas procesu powlekania (Rysunek 5D). Oba rodzaje defektów prowadzą do błędów w określaniu kształtu i wielkości pęcherzyka przez system optycznej analizy obrazu, co skutkuje nieprawidłowymi wartościami napięcia powierzchniowego. Ważne jest, aby każdą nową kapilarę po wyciągnięciu i powleczeniu dokładnie zbadać pod mikroskopem...

Ten manuskrypt opisuje konstrukcję i działanie mikrotensjometru/mikroskopu konfokalnego do wykonywania jednoczesnych pomiarów napięcia międzyfazowego i reologii dylatacyjnej powierzchni przy jednoczesnej wizualizacji morfologii międzyfazowej. Zapewnia to konstruowanie w czasie rzeczywistym relacji struktura-właściwości interfejsów ważnych w technologii i fizjologii.

Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów

Adsorption of surface-active molecules to fluid-fluid interfaces is ubiquitous in nature. Characterizing these interfaces requires measuring surfactant ...

Metoda ta łączy mikroskop konfokalny z mikrotensjometrem ciśnienia kapilarnego, tworząc potężne narzędzie, które można wykorzystać do badania granicy faz płynu z krzywą w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Technika ta może badać zależności między strukturą i funkcją materiałów powierzchniowo czynnych poprzez jednoczesne pomiary właściwości powierzchni i konfokalne obrazy morfologii powierzchni na wysoce zakrzywionych powierzchniach. Stawiamy hipotezę, że produkty stanu zapalnego hamują działanie surfaktantu płucnego, powodując problemy z oddychaniem związane z dokładnym zespołem niewydolności oddechowej.Drzwi te mogą badać właściwości i morfologię środków powierzchniowo czynnych płuc oraz stabilność płuc poddanych działaniu takich materiałów. Aby rozpocząć, zmontuj komórkę CPM, umieszczając dużą stronę kapilary w górnej części komórki, aż przepchnie się do spodu komórki. Delikatnie dokręć złącze szczytowe, aby zabezpieczyć kapilarę, a następnie przymocuj rurkę z pompy mikroprzepływowej do większej strony kapilary.W razie potrzeby podłączyć zbiornik do wymiany rozpuszczalnika i/lub kąpiel kontrolującą temperaturę do odpowiednich wlotów i wylotów w komórce CPM. W przeciwnym razie zatkaj nieużywane wloty i wyloty. Przymocuj komórkę CPM do stolika mikroskopu konfokalnego, z grubsza wyrównując ją z obiektywem CFM, kamerą CPM i źródłem światła CPM.Otwórz przepływ gazu do pompy mikroprzepływowej przy zalecanym ciśnieniu roboczym pompy i upewnij się, że przepływ do kapilary jest otwarty. Uruchom wirtualny interfejs CPM, ustawiając ciśnienie bazowe na 25 milibarów i przełączając się w tryb kontroli ciśnienia. Następnie napełnij kuwetę CPM wodą za pomocą pipety.Skup się na końcówce kapilarnej za pomocą kamery mikrotensjometru i ułóż annus tak, aby nakładał się na pęcherzyk. Doprowadź obiektyw zanurzeniowy mikroskopu konfokalnego do kontaktu z płynem w komórce i ustaw ostrość na pęcherzyku za pomocą mikroskopu konfokalnego. Kliknij resetuj bańkę i upewnij się, że utworzyła się nowa bańka.Jeśli bańka nie pęknie, zwiększ ciśnienie resetowania lub zwiększ czas opóźnienia resetowania w zakładce resetowania bąbelków poniżej viewokienko. Wyjmij wodę za pomocą strzykawki bezpośrednio do komórki, opróżnij ją i ponownie zamocuj. Wypełnij komórkę żądaną próbką.Korzystanie z autoklawowanej pipety utrzymuje oprogramowanie CPM w trybie kontroli ciśnienia, zapewniając, że początkowe napięcie powierzchniowe wynosi około 73 miliniutonów na metr podczas tworzenia nowego interfejsu pęcherzykowego. Po określeniu promienia nowo utworzonego bąbelka wprowadź tę wartość do kontrolki obszaru linii środkowej i zmień typ kontrolki na kontrolkę obszaru, klikając kartę kontroli obszaru. Rozpocznij nagrywanie konfokalnego wideo, a następnie kliknij resetuj bańkę i natychmiast kliknij zbierz dane.Dostosuj szybkość zapisu danych zgodnie z całkowitym czasem absorpcji próbki, przesuwając pasek. Po zakończeniu eksperymentu. Zapisz plik, wybierając odpowiednią ścieżkę do pliku i klikając przycisk Zapisz.Zatrzymaj i zapisz nagranie również w CFM. Wprowadź żądaną wartość bazową procentu oscylacji i częstotliwości oscylacji, a następnie wybierz odpowiednią zakładkę, decydując, czy oscylacja będzie oscylacją ciśnienia, oscylacją obszarową czy oscylacją krzywizny. Rozpocznij nagrywanie konfokalnego wideo i kliknij zbierz dane w oprogramowaniu CPM.Wybierz szybkość akwizycji danych, aby zapewnić odpowiednią liczbę punktów danych dla każdego cyklu oscylacji. Jeśli pożądane są inne amplitudy lub częstotliwości oscylacji, zmień wartości podczas eksperymentu i zapisz wyniki. Najpierw włóż rurkę wlotową pompy perystaltycznej do butelki z żądanym roztworem do wymiany i włóż rurkę wylotową do pojemnika na odpady.Rozpocznij nagrywanie wideo w oprogramowaniu konfokalnym, a następnie kliknij zbierz dane w oprogramowaniu CPM. Następnie ustaw prędkość pompy perystaltycznej. Jeśli konieczna jest wymiana wielu płynów, zatrzymaj pompę perystaltyczną i podłącz wlot do innego roztworu do wymiany.Po zakończeniu wymiany zapisz wyniki, jak pokazano wcześniej. Wyniki mikrotensjometru dla absorpcji stałego ciśnienia wykazały, że powierzchnia pęcherzyków znacznie zwiększa się w trakcie badania i prowadzi do znacznie wolniejszej absorpcji niż w przypadku stałej powierzchni. Podczas procesu absorpcji sygnał fluorescencyjny z granicy faz początkowo był niski i wzrastał w miarę absorpcji środka powierzchniowo czynnego do interfejsu.Jeśli środek powierzchniowo czynny tworzy domeny powierzchniowe, można zaobserwować, jak domeny te tworzą się i rosną. Podczas wykonywania badania oscylacji, oscylacja jest naprawdę sinusoidalna tylko dla parametru, który jest kontrolowany. Jak pokazano tutaj, w przypadku badania o kontrolowanej powierzchni jest to ważne przy obliczaniu modulatywności dylatacyjnej powierzchni, ponieważ oscylacja w tym obszarze musi być sinusoidalna.Dane dotyczące napięcia powierzchniowego i powierzchni zebrane z badania oscylacji wykorzystano do bezpośredniego obliczenia międzyfazowego modułu dylatacyjnego warstwy środka powierzchniowo czynnego. Podczas oscylacji monowarstwy fosfolipidów ruch skondensowanych domen czarnej cieczy można zaobserwować w całej ciągłej kolorowej fazie ekspandowanej cieczy. Odrębne domeny na interfejsie zreorganizowały się w rozgałęziającą się sieć, która rozrosła się, obejmując interfejs, gdy oscylacje miały miejsce na zakrzywionej bańce.Potwierdza to jednoczesna zmiana napięcia powierzchniowego i powierzchniowego modułu dylatacyjnego. Podczas badania wymiany rozpuszczalnika dla monowarstwy środka powierzchniowo czynnego płuc z roztworem buforowym, a następnie roztworem lasso PC, morfologia domen zmieniła się drastycznie w miarę zachodzenia wymiany. Ważne jest, aby wizualnie śledzić oscylację i przypinanie pęcherzyka, aby upewnić się, że kapilara jest kwadratowa, a bańka zachowuje swój kulisty kształt.Oprócz granic faz powietrze-woda, można również badać interfejsy olej-woda w celu określenia stabilności i właściwości emulsji. Technika ta oferuje podejście do konstruowania relacji właściwości struktury interfejsów krzywych za pomocą pojedynczych zmian. Pozwala to na nową eksplorację czynników rządzących morfologią międzyrasową, które wcześniej badano tylko na płaskich powierzchniach międzyrasowych.

microtensiometer-for-confocal-microscopy-visualization-dynamic

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Napięcie integryny odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach komórki. Dzięki zintegrowanemu czujnikowi naprężenia, napięcie integryny jest kalibrowane z czułością pikoNewtona (pN) i obrazowane w rozdzielczości submikronowej.

Obrazowanie napięcia integryny i siły komórkowej w rozdzielczości submikronowej za pomocą zintegrowanego czujnika napięcia

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Poznaj metodę mikrotensjometru z mikroskopią konfokalną do badania dynamicznych interfejsów płyn-płyn. Technika umożliwia jednoczesny pomiar właściwości powierzchniowych i wizualizację morfologii.

Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów

Przeglądaj więcej filmów