Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Ocena bezpieczeństwa pracy serca jest kluczowym elementem procesu opracowywania leku. Ludzkie kardiomiocyty pochodzące z iPSC okazały się wiarygodnym, wydajnym i opartym na ludziach modelem do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego. Opracowaliśmy metodologie kompleksowego badania charakterystyki funkcjonalnej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, które mają bardzo ważne znaczenie w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych w kierunku kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycynie precyzyjnej.

Coraz powszechniejsze włączanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do standardowego procesu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa może poprawić dokładność przewidywania toksyczności potencjalnych związków. Rozpocznij od hodowli ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC przez co najmniej 10 dni przed wykonaniem pomiaru. Włącz regulator temperatury i ustaw go na 37 stopni Celsjusza.

Włącz mikroskop, kamerę i dopływ dwutlenku węgla. Napełnij płaszcz wodny uchwytu talerza odpowiednią ilością sterylnej wody dejonizowanej. Umieścić 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki i inkubować komórki przez co najmniej pięć minut.

Otwórz oprogramowanie do wyświetlania, a następnie ustaw liczbę klatek na sekundę kamery na 75 klatek na sekundę, a rozdzielczość wideo lub obrazu na 1024 x 1024 pikseli. Zastosuj funkcje automatycznego ustawiania ostrości i automatycznej jasności, nagrywaj filmy i obrazy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Ostrożnie umieść ośmiomikrolitrową kroplę roztworu do powlekania matrycy pozakomórkowej na obszarze elektrody rejestrującej każdej studzienki z 48 płytek układu mikroelektrod.

Następnie dodaj trzy mililitry sterylnej wody dejonizowanej do obszaru otaczającego studzienki, aby zapobiec parowaniu roztworu powlekającego. Używając końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, usuń większość dodatkowego podłoża z matrycy komórkowej z powierzchni studzienki w tym samym pojedynczym rzędzie lub kolumnie, nie dotykając elektrod. Wysiewaj 50 000 komórek na studzienkę w ośmiolitrowej kropli pożywki wysiewającej nad obszarem elektrody rejestrującej.

Powtarzaj, aż wszystkie studzienki zostaną pokryte komórkami. Następnie należy inkubować płytki z matrycą mikroelektrod w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych. Powoli dodawaj 150 mikrolitrów pożywki wysiewającej do każdego dołka z płytkami układu mikroelektrod.

W 10 dniu po posiewie sprawdź gęstość spontanicznie bijącej ludzkiej monowarstwy iPSC CM pod mikroskopem. Umieść 48-dołkową płytkę z matrycą mikroelektrod w przyrządzie rejestrującym. Upewnij się, że temperatura wynosi 37 stopni Celsjusza, a dwutlenek węgla wynosi 5%Otwórz oprogramowanie nawigatora.

W oknie ustawień eksperymentalnych wybierz opcję konfiguracji serca w czasie rzeczywistym i zapisów potencjału pola. Zastosuj konfiguracje bicia spontanicznego lub wklej. W parametrach wykrywania dudnień ustaw próg wykrywania na 300 mikrowoltów, minimalny okres dudnienia na 250 milisekund, a maksymalny okres dudnienia na pięć sekund.

Wybierz regresję wielomianową do obliczenia czasu trwania potencjału pola. Sprawdź, czy wyjściowy sygnał aktywności elektrycznej jest dojrzały i stabilny, a następnie uzyskaj wyjściową aktywność serca przez jedną do trzech minut. Wykonaj nagranie 10 dni po poszyciu.

Zastąp ludzką pożywkę podtrzymującą iPSC CM roztworem tyrode'a i pozwól komórkom zaaklimatyzować się przez 15 minut. Włóż czujniki temperatury do komory i włóż do niej 35-milimetrową miskę. Dostosuj temperaturę do 37 stopni Celsjusza.

Wyciągnij mikropipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Napełnij mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż je do uchwytu podłączonego do stopnia głowicy wzmacniacza patch clamp. Otwórz oprogramowanie akwizycyjne, załaduj protokół zapisu potencjału czynnościowego i wybierz konfigurację cęgów napięcia.

Włóż mikropipetę do roztworu kąpieli i wybierz odpowiednie CM iPSC dla pojedynczego człowieka. Wyreguluj i opuść położenie mikropipety obok wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Po włożeniu końcówki pipety do roztworu kąpieli sprawdź rezystancję pipety na monitorze oscyloskopu.

Umieść pipetę blisko celi, a impulsy prądu nieznacznie się zmniejszą, aby odzwierciedlić rosnący opór uszczelnienia. Zastosuj delikatne ssanie z podciśnieniem, aby zwiększyć opór. W ten sposób powstanie gigafoka.

Następnie zastosuj funkcję uszczelnienia. Zastosuj dodatkowe ssanie, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację zapisu całej komórki. W tym momencie przełącz się z trybu cęgów napięciowych na tryb cęgów prądowych lub brak wstrzykiwania prądu za pomocą okna dialogowego wzmacniacza.

Naciśnij przycisk nagrywania, aby wygenerować i zapisać nagranie potencjału czynnościowego files. Wykonaj pomiar stanu nieustalonego wapnia co najmniej 10 dni po posiewaniu. Przygotuj świeży roztwór tyrode i roztwór ładujący Fura-2 AM.

Odessać ludzką pożywkę konserwacyjną iPSC CM i dwukrotnie umyć komory roztworem tyrode'a. Zastosuj 100 mikrolitrów roztworu ładującego Fura-2 AM i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór ładujący Fura-2 AM roztworem Tyrode'a i inkubuj przez co najmniej pięć minut w celu całkowitej deestryfikacji Fura-2 AM. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na 40-krotny obiektyw immersyjny w odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym.

Umieść komorę celi w stage adapterze mikroskopu. Zamontuj przewody regulatora temperatury do komory kąpieli i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj elektrody do stymulacji pola elektrycznego i ustaw impulsy na 0,5 herca o czasie trwania 20 milisekund.

Włącz ultraszybkie przełączające źródło światła o długości fali i ustaw je na tryb szybkiego przełączania 340 nanometrów i 380 nanometrów. Zastosuj czas naświetlania wynoszący 20 milisekund dla obu długości fal i czas nagrywania wynoszący 20 sekund. Nagraj wideo odzwierciedlające zmiany stanu nieustalonego wapnia w czasie rzeczywistym, wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

Do pomiaru ruchu skurczowego użyto monowarstwy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Analiza śladu ruchu relaksacyjnego skurczu za pomocą oprogramowania analizatora wykryła początek skurczu, szczyt skurczu, koniec skurczu, szczyt relaksacyjny i koniec relaksacji. Zaobserwowano pełne pokrycie monowarstwy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC na wszystkich elektrodach w płytkach układu mikroelektrod.

Dojrzałe przebiegi zarejestrowane przez każdą elektrodę odzwierciedlały potencjał pola serca o możliwej do zidentyfikowania charakterystyce. Po analizie uzyskano okres dudnienia, czas trwania potencjału pola i amplitudę skoku. Zapisy klamry krosowej całych komórek w bieżącym trybie zaciskania rejestrowały spontaniczne potencjały czynnościowe pojedynczych kardiomiocytów.

Po analizie uzyskano kilka parametrów, w tym amplitudę, maksymalny potencjał rozkurczowy i czas trwania potencjału czynnościowego. Po analizie obrazowania wapnia uzyskano stosunek F340 do F380 w czasie i wykreślono surowe ślady stymulowanych stanów przejściowych wapnia. Ponadto uzyskano takie parametry jak amplituda, rozkurczowe ciśnienie wapnia i tau w rozpadzie wapnia.

Ważne jest, aby używać ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, które są w dobrym stanie, a także zapewnić wysoką czystość ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Protokół ten obejmuje cztery specyficzne techniki badania funkcjonalności kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC, innej konfiguracji lub automatycznej, czy badać prądy jonowe serca, które odgrywają kluczową rolę w pracy serca