Name: Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metody oceny kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM przy użyciu mikromacierzy elektrod i patch clamp. Techniki te wspierają badania bezpieczeństwa kardiologicznego w rozwoju leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Blake'owi Wu za korektę rękopisu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 oraz NASA NNX16A069A (JCW) i AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Przygotowanie pożywek i roztworów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę podtrzymującą hiPSC-CM, mieszając 10 ml butelkę 50x suplement B27 i 500 ml pożywki RPMI 1640. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca. Przed użyciem należy zrównoważyć medium do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować pożywkę wysiewającą hiPSC-CM, mieszając 20 ml substytutu surowicy i 180 ml pożywki podtrzymującej hiPSC-CM (rozcieńczenie 10%, v/v). Preferowane jest świeżo przygotowane podłoże siewne, ale można je przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie. Przed użyciem zrównoważyć podłoże do RT.</li>
	<li>Przygotować roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową, rozmrażając jedną butelkę (10 ml) macierzy błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc i rozdzielając 500 μl matrycy błony podstawnej w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Zmieszać 500 μl matrycy błony podstawnej i 100 ml lodowatego podłoża DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:200, v/v), aby uzyskać roztwór do powlekania macierzy membrany podstawnej.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml roztworu Tyrode'a zawierającego 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukozy i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a w dniu eksperymentu.</li>
	<li>Przygotować 50 ml wewnątrzkomórkowego roztworu pipet zawierających 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA i 10 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Podwielokrotność roztworu pipety wewnątrzkomórkowej umieścić w sterylnych probówkach o pojemności 5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu eksperymentu świeżo dodać MgATP do roztworu, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 mM.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml roztworu nasycającego Fura-2 AM zawierającego 2 μM Fura-2 AM i 0,1% Pluronic F-127. Przygotuj świeży roztwór ładujący w dniu eksperymentu i chroń go przed światłem.</li>
</ol>
2. Pomiar ruchu skurczowego hiPSC-CM
<ol>
	<li>Przygotować płytki pokryte matrycą błony podstawnej, dodając 100 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej studzienki 96-dołkowych płytek. Inkubować 96-dołkowe płytki w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Enzymatyczna dysocjacja hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Zamów hiPSC w Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generuj hiPSC-CM zgodnie z poprzednimi publikacjami8,9. Obserwuj hiPSC-CM hodowane na płytkach sześciodołkowych pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. 
		UWAGA: Nie należy rozdzielać komórek, gdy są one nadal proliferacyjne. W przeciwnym razie komórki przerosną na studzienkach po ponownym posiewie i doprowadzą do niedokładnych wyników testów funkcjonalnych. Zwykle hiPSC-CM zatrzymują proliferację w dniach 18-23.</li>
		<li>Upewnij się, że hiPSC-CM mocno biją i mają czystość ponad 95%. Oceń czystość poprzez barwienie immunologiczne troponiny sercowej T, specyficznego markera kardiomiocytów8,9.</li>
		<li>Odessać pożywkę konserwacyjną i dwukrotnie przemyć komórki 1x DPBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka z sześciodołkowych płytek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Czas trwania inkubacji powinien być regularnie monitorowany. Upewnij się, że nie trawisz nadmiernie komórek, ponieważ zmniejszy to ich żywotność.</li>
		<li>Delikatnie pipetować hiPSC-CM w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety o pojemności 5 ml, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Dodać równą objętość pożywki wysiewającej hiPSC-CMs, aby zneutralizować roztwór do odrywania komórek.</li>
		<li>Odwirować hiPSC-CM przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1-2 ml pożywki wysiewającej hiPSC-CM.</li>
		<li>Określić ilościowo gęstość i żywotność komórek, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego. Krótko zmieszaj 10 μl zawiesiny komórek z równą objętością błękitu trypanowego, przenieś na szkiełko do liczenia komórek, a następnie policz za pomocą licznika komórek, jak opisano wcześniej21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z płytek 96-dołkowych.</li>
		<li>Wysiewać 50 000 komórek na studzienkę w 100 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM i umieścić 96-dołkowe płytki w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Zastąp podłoże wysiewające hiPSC-CM 100 μl pożywki konserwacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posiewie. Zmieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni, aż do momentu nagrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Zmierz ruch skurczowy hiPSC-CM co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane).</li>
		<li>Włącz regulator temperatury i ustaw 37 °C jako preferowaną temperaturę. Włącz mikroskop, kamerę i zasilanie CO2 .</li>
		<li>Napełnij płaszcz wodny uchwytu talerza odpowiednią ilością sterylnej wody dejonizowanej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). Umieścić 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki i pozwolić komórkom zaaklimatyzować się przez co najmniej 5 minut.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie widoku, ustaw liczbę klatek na sekundę kamery na 75 klatek na sekundę (fps), a rozdzielczość wideo/obrazu na 1024 × 1024 piksele. Zastosuj funkcje automatycznego ustawiania ostrości i automatycznej jasności. Nagrywanie filmów i obrazów hiPSC-CMs. 
		UWAGA: Unikaj wibracji stołu mikroskopu podczas nagrywania.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie analizatora do automatycznej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar potencjału pola hiPSC-CM
<ol>
	<li>Przygotowanie płyt pokrytych matrycą membrany podstawnej
	<ol>
		<li>Ostrożnie umieścić kroplę 8 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na obszarze elektrody rejestrującej każdej studzienki z 48-dołkową matrycą mikroelektrod (MEA). Zobacz Rysunek 3A, aby zobaczyć odpowiedni obszar elektrody do umieszczenia kropel. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania koncentracji monowarstwy hiPSC-CM na elektrodach. Pod żadnym pozorem nie dotykaj elektrod.</li>
		<li>Dodaj 3 ml sterylnej wody dejonizowanej do obszaru otaczającego studzienki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A) 48-dołkowych płytek MEA, aby zapobiec parowaniu roztworu powlekającego. Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 45-60 min. 
		UWAGA: Nie inkubować zbyt długo, aby zapobiec wyschnięciu matrycy błony podstawnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	<li>Wysiewanie hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Usunąć większość pożywki z matrycy zewnątrzkomórkowej z powierzchni studzienki bez dotykania elektrod za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl w tym samym pojedynczym rzędzie lub kolumnie.</li>
		<li>Zasiać 50 000 komórek na studzienkę w kropli 8 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM na obszarze elektrody rejestrującej każdego dołka w tym samym rzędzie lub kolumnie.</li>
		<li>Powtarzaj ostatnie dwa kroki, aż wszystkie studzienki zostaną pokryte komórkami. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie studzienki mają zawieszenie hiPSC-CM. Aby uzyskać żądaną gęstość, zobacz Rysunek 3B. 
		UWAGA: Przyczepianie hiPSC-CM będzie zagrożone, jeśli matryca błony podstawnej zostanie całkowicie wysuszona, co sprawi, że przyłączenie komórek będzie nieoptymalne.</li>
		<li>Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 60 minut.</li>
		<li>Powoli i delikatnie dodać 150 μl pożywki wysiewającej hiPSC-CM do każdego dołka z 48-dołkowych płytek MEA. Aby dodać pożywkę bez rozpraszania wcześniej wysianych hiPSC-CMs, przytrzymaj płytkę pod kątem 45°, oprzyj końcówkę pipety o ściankę każdej studzienki i powoli uwalniaj pożywkę. 
		UWAGA: Zbyt szybkie dodanie pożywki lub pod wysokim ciśnieniem spowoduje usunięcie przylegających kardiomiocytów. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z zawiesiną kroplową hiPSC-CM.</li>
		<li>Inkubować 48-dołkowe płytki MEA w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Odświeżyć podłoże wysiewające hiPSC-CM za pomocą 300 μl pożywki pielęgnacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posianiu. Wymieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni przed nagrywaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Pomiar MEA należy wykonać co najmniej 10 dni po poszyciu (zalecane). W 10 dniu po posiewie sprawdź gęstość spontanicznie dudniącej monowarstwy hiPSC-CM pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, która powinna być taka, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 3C.</li>
		<li>Umieść 48-dołkową płytkę MEA w przyrządzie rejestrującym. Ekran dotykowy umożliwia obserwację temperatury (37 °C) i stanu CO2 (5%).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie nawigatora. W oknie ustawień eksperymentalnych wybierz opcję Cardiac Real-time Configuration (Konfiguracja serca w czasie rzeczywistym) i Field Potential Recordings (Zapisy potencjału pola). Stosuj konfiguracje dudnienia spontanicznego lub w tempie.</li>
		<li>W parametrach wykrywania dudnień ustaw próg wykrywania na 300 μV, minimalny okres dudnienia na 250 ms, a maksymalny okres dudnienia na 5 s. Wybierz Regresję wielomianową do obliczenia czasu trwania potencjału pola (FPD).</li>
		<li>Sprawdź, czy podstawowy sygnał aktywności elektrycznej jest dojrzały i stabilny. 
		UWAGA: Dojrzałe przebiegi zarejestrowane przez każdą elektrodę z wielodołkowej płytki MEA muszą odzwierciedlać potencjał pola sercowego o łatwo identyfikowalnych cechach zbiegających się ze skokiem depolaryzacji serca i fazą repolaryzacji, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3D-F.</li>
		<li>Uzyskuj wyjściową aktywność serca przez 1-3 minuty. Jeśli konieczne jest leczenie farmakologiczne, dodaj związki do studzienek po zarejestrowaniu linii podstawowej. Umieścić płytkę w inkubatorze na co najmniej 30 minut przed kolejnym nagraniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar potencjału czynnościowego hiPSC-CM
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia pokryte matrycą błony podstawnej, umieszczając 500 μl roztworu do powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej na szklanej dolnej części szalek o średnicy 35 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Inkubować szalki o średnicy 35 mm w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	<li>Wysiewanie hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z szalek o średnicy 35 mm. Wysiewać 50 000 komórek na studzienkę w 500 μl podłoża wysiewającego hiPSC-CM na szklanej dolnej części szalek o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Inkubować szalki o średnicy 35 mm w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc. Usuń pożywkę wysiewającą hiPSC-CM i dodaj 2 ml pożywki konserwacyjnej hiPSC-CM do szalek o średnicy 35 mm. 
		UWAGA: Zaleca się nałożenie niefiltrowanej końcówki o pojemności 200 μl na pipetę aspiracyjną o pojemności 2 ml w celu usunięcia zużytego podłoża i uniknięcia dotykania komórek.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną hiPSC-CM co 2 dni przed rejestracją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Pomiar potencjału czynnościowego należy wykonać co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane). Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a zgodnie z opisem w kroku 1.4. Rozmrozić jedną podwielokrotność wewnątrzkomórkowego roztworu pipety i świeżo dodać MgATP do końcowego stężenia 3 mM.</li>
		<li>Wyciągnij mikropipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. 
		UWAGA: Preferowana jest rezystancja mikropipet na poziomie 2-5 MΩ.</li>
		<li>Zastąp pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM roztworem Tyrode'a i pozwól komórkom zaaklimatyzować się w roztworze Tyrode'a przez 15 minut (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C). Włóż czujniki temperatury do komory, umieść naczynie 35 mm w komorze, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 4C, i ustaw temperaturę na 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D).</li>
		<li>Napełnij mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż je do uchwytu podłączonego do stopnia głównego wzmacniacza z zaciskiem krosowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4E). Otwórz oprogramowanie do stymulacji/akwizycji, załaduj protokół zapisu potencjału czynnościowego i wybierz konfigurację cęgów napięcia.</li>
		<li>Włożyć mikropipetę do roztworu kąpieli, wybrać odpowiednie pojedyncze hiPSC-CM, a następnie wyregulować i opuścić pozycję mikropipety obok wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Po włożeniu końcówki pipety do roztworu kąpieli sprawdź rezystancję pipety, którą można zaobserwować na monitorze oscyloskopu.</li>
		<li>Umieść pipetę blisko celi, a impulsy prądu nieznacznie się zmniejszą, aby odzwierciedlić rosnący opór uszczelnienia. Zastosuj delikatne ssanie z podciśnieniem, aby zwiększyć opór, który utworzy gigaseal. Zastosuj funkcję Seal (Uszczelnienie).</li>
		<li>Zastosuj dodatkowe ssanie, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację nagrywania całej komórki. Gdy część błony w obszarze pipety zostanie rozerwana przez zasysanie, roztwór wewnętrzny jest w równowadze z cytoplazmą komórki. W tym momencie przełącz się z trybu cęgów napięciowych (V-clamp) na tryb cęgów prądowych lub brak wtrysku prądu (C-Clamp) za pomocą okna dialogowego wzmacniacza. Naciśnij przycisk nagrywania, aby wygenerować i zapisać nagranie potencjału czynnościowego files. 
		UWAGA: Zmiana trybu zapewnia ciągłą rejestrację spontanicznych potencjałów czynnościowych hiPSC-CM za pośrednictwem protokołu nagrywania bez wyzwalania i bez stymulacji, który można monitorować na wyjściu V-mon wzmacniacza patch-clamp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar stanu przejściowego hiPSC-CM Ca2+
<ol>
	<li>Zapoznaj się z poprzednim protokołem, aby przygotować niestandardowe komory komórkowe do obrazowania Ca2+21. W celu przygotowania komory komórkowej pokrytej matrycą błony podstawnej, należy umieścić 200 μl roztworu powlekającego macierz zewnątrzkomórkową w komorach komórkowych. Inkubować komory komórkowe w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną hiPSC-CM zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	<li>Wysiewanie hiPSC-CM
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową z komór komórkowych. Wysiewaj 20 000 komórek na studzienkę w 200 μl podłoża wysiewającego hiPSC-CM.</li>
		<li>Zastąp podłoże wysiewające hiPSC-CM 200 μl pożywki pielęgnacyjnej hiPSC-CM 1 dzień po posiewie. Wymieniaj pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM co 2 dni przed nagrywaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Wykonaj pomiar stanu nieustalonego Ca2+ co najmniej 10 dni po posadzeniu (zalecane). Przygotuj świeży roztwór Tyrode'a zgodnie z opisem w kroku 1.4. Przygotuj świeży roztwór ładujący Fura-2 AM zgodnie z opisem w kroku 1.6.</li>
		<li>Odessać pożywkę konserwacyjną hiPSC-CM i dwukrotnie przemyć roztworem Tyrode'a. Zastosować 100 μl roztworu nasycającego Fura-2 AM i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp roztwór ładujący Fura-2 AM roztworem Tyrode i odczekaj co najmniej 5 minut na całkowitą deestryfikację Fura-2 AM.</li>
		<li>Dodaj kroplę olejku immersyjnego na 40-krotny obiektyw odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w 40-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem (0,95 NA). Umieść komorę celi w stage adapter mikroskopu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5A).</li>
		<li>Zamontuj przewody regulatora temperatury w komorze kąpieli i ustaw ją na 37 °C. Zamontuj elektrody stymulujące pole elektryczne i ustaw impulsy na 0,5 Hz o czasie trwania 20 ms.</li>
		<li>Włącz źródło światła o bardzo dużej prędkości przełączania długości fali i ustaw je na tryb szybkiego przełączania 340 nm i 380 nm zgodnie z instrukcjami przyrządu.</li>
		<li>Zastosuj czas naświetlania 20 ms dla obu długości fal i czas nagrywania 20 s w oprogramowaniu. Nagraj wideo odzwierciedlające zmiany w czasie rzeczywistym stanu nieustalonego Ca2+ w hiPSC-CM. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj je zgodnie z wcześniejszym opisem23.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+research+and+development+investment+needed+to+bring+a+new+medicine+to+market%2C+2009-2018%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018.</a> Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).</li>
<li>Pang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Workshop+report%3A+FDA+workshop+on+improving+cardiotoxicity+assessment+with+human-relevant+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms.</a> Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).</li>
<li>Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+broader+view+of+mechanisms+of+drug+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity.</a> Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).</li>
<li>Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+and+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+for+discovery+of+personalized+cardiovascular+drugs+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics.</a> Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).</li>
<li>Kaese, S., Verheule, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiology+in+mice%3A+a+matter+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size.</a> Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).</li>
<li>Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+correlations+between+cardiac+isomyosins.+A+comparison+of+electrophoretic+and+immunological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).</li>
<li>Werfel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+circular+RNAs+in+human%2C+mouse%2C+and+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+highly+purified+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+small+molecule-modulated+differentiation+and+subsequent+glucose+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+long+QT+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).</li>
<li>Chen, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGFRA+signaling+contributes+to+filamin+C-related+arrhythmogenic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy.</a> Science Advances. 8 (8), (2022).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+recapitulate+the+predilection+of+breast+cancer+patients+to+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).</li>
<li>Kitani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell+model+of+trastuzumab-induced+cardiac+dysfunction+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer.</a> Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).</li>
<li>Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+patient-specific+human+iPSC-cardiomyocytes+predicts+individual+drug+safety+and+efficacy+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).</li>
<li>Stillitano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+susceptibility+to+drug-induced+long+QT+with+a+panel+of+subject-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+measure+contraction%2C+calcium%2C+and+action+potential+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Greensmith, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca+analysis%3A+an+Excel+based+program+for+the+analysis+of+intracellular+calcium+transients+including+multiple%2C+simultaneous+regression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Methods+and+Programs+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).</li>
<li>Ma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+pathogenicity+of+a+genomic+variant+of+uncertain+significance+using+CRISPR%2FCas9+and+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).</li>
<li>Lam, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+transcriptome+signatures+of+calcium+channel+blockers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).</li>
<li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+premature+termination+codon+mutation+in+MYBPC3+causes+hypertrophic+cardiomyopathy+via+chronic+activation+of+nonsense-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li>
<li>Zhang, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+assessing+drug+safety+response+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles.</a> Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).</li>
<li>Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvoluting+the+cells+of+the+human+heart+with+iPSC+technology%3A+cell+types%2C+protocols%2C+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses.</a> Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).</li>
<li>Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+research%3A+current+approaches+in+cardiac+differentiation%2C+maturation+strategies%2C+and+scalable+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production.</a> Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).</li>
<li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+developmental+cues+for+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).</li>
<li>Feyen, D. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+maturation+media+improve+physiological+function+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+preclinical+cancer+drug+cardiotoxicity+testing%3A+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).</li>
<li>Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiPSCs+Derived+cardiac+cells+for+drug+and+toxicity+screening+and+disease+modeling%3A+what+micro-+electrode-array+analyses+can+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us.</a> Cells. 8 (11), (2019).</li>
<li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li>
<li>Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+patch+clamp+in+drug+discovery%3A+major+breakthroughs+and+innovation+in+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).</li>
<li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li>
<li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662(2019).</li>
<li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565(2021).</li>
<li>Milligan, C. J., Möller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilligan%2C+CJ+%22Ion+Channels%3A+Methods+and+Protocols%22">Ion Channels: Methods and Protocols</a>. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).</li>
</ol>

J.C.W. jest współzałożycielem Greenstone Biosciences, ale nie ma konkurencyjnych interesów, ponieważ prezentowane tu prace są całkowicie niezależne. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Technologia ludzkiego iPSC stała się potężną platformą do modelowania chorób i badań przesiewowych leków. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół pomiaru kurczliwości hiPSC-CM, potencjału pola, potencjału czynnościowego i stanu przejściowego Ca2+. Protokół ten zapewnia kompleksową charakterystykę kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM. Te testy funkcjonalne zostały zastosowane w wielu publikacjach z naszej grupy 12,13,18,24,25,26,27....

Rozwój leków to długi i kosztowny proces. Badanie nowych leków terapeutycznych zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w latach 2009-2018 wykazało, że szacowany średni koszt skapitalizowanych badań i prób klinicznych wyniósł 985 milionów dolarów na produkt1. Kardiotoksyczność wywołana przez lek jest główną przyczyną wyczerpania leków i wycofywania ich z rynku2. Warto zauważyć, że kardiotoksyczność jest zgłaszana w wielu klasach leków terapeutycznych3. W związku z tym ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym elementem procesu opracowywania leku. Obecny paradygmat oceny bezpieczeństwa kardiologicznego jest nadal w dużym stopniu zależny od modeli zwierzęcych. Jednak różnice gatunkowe wynikające z zastosowania modeli zwierzęcych są coraz częściej uznawane za główną przyczynę niedokładnych prognoz kardiotoksyczności wywołanej lekami u ludzi4. Na przykład morfologia potencjału czynnościowego serca różni się znacznie między ludźmi i myszami ze względu na udział różnych prądów repolaryzacyjnych5. Ponadto zróżnicowane izoformy miozyny sercowej i kolistych RNA, które mogą wpływać na fizjologię serca, zostały dobrze udokumentowane wśród gatunków6,7. Aby wypełnić te luki, konieczne jest ustanowienie wiarygodnego, wydajnego i opartego na człowieku modelu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego.
Przełomowy wynalazek technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stworzył bezprecedensowe platformy do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. W ciągu ostatniej dekady metody generowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) stały się dobrze znane8,9. hiPSC-CM cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich potencjalne zastosowania w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycynie precyzyjnej. Na przykład hiPSC-CM zostały wykorzystane do modelowania patologicznych fenotypów chorób serca spowodowanych dziedziczeniem genetycznym, takich jak zespół długiego odstępu QT10, kardiomiopatia przerostowa11,12 i kardiomiopatia rozstrzeniowa13,14,15. W związku z tym zidentyfikowano kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w patogenezę chorób serca, które mogą rzucić światło na potencjalne strategie terapeutyczne skutecznego leczenia. Co więcej, hiPSC-CM zostały wykorzystane do badań przesiewowych kardiotoksyczności wywołanej lekami związanych ze środkami przeciwnowotworowymi, w tym doksorubicyną, trastuzumabem i inhibitorami kinazy tyrozynowej16,17,18; Strategie mające na celu złagodzenie wynikającej z tego kardiotoksyczności są obecnie badane. Wreszcie, informacja genetyczna zachowana w hiPSC-CM pozwala na badanie przesiewowe i przewidywanie kardiotoksyczności wywołanej lekiem zarówno na poziomie indywidualnym, jak i populacyjnym19,20. Reasumując, hiPSC-CM okazały się nieocenionym narzędziem do spersonalizowanego przewidywania bezpieczeństwa kardiologicznego.
Ogólnym celem tego protokołu jest ustanowienie metodologii kompleksowego i efektywnego badania funkcjonalnych cech hiPSC-CMs, które mają ogromne znaczenie w zastosowaniu hiPSC-CM do modelowania chorób, badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycyny precyzyjnej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szereg testów funkcjonalnych do oceny właściwości funkcjonalnych hiPSC-CM, w tym pomiar kurczliwości, potencjału pola, potencjału czynnościowego i obchodzenia się z wapniem (Ca2+) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Szklana dzienka 35 mm ze szklanym dnem 20 mm mikro-studzienka #1,5 szklana osłona</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Zacisk krosowy</td></tr><tr><td>50x B27 suplementy</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>hiPSC-CM pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>hodowlana E & K Scientific</td><td>EK-27160</td><td>kultura hiPSC-CM</td></tr><tr><td>96-dołkowe płaskie przezroczyste dno z czarnego polistyrenu Mikropłytki poddane TC</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Pomiar ruchu skurczowego</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>Dysocjacja enzymatyczna</td></tr><tr><td>Zintegrowane Studio Axion (AxIS)</td><td>Oprogramowanie nawigacyjne</td> <td>Axion Biosystems</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat Harvarda</td><td>BF 100-50-10,</td> <td>zacisk krosowy</td></tr><tr><td>CaCl2 1 M w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Zliczanie komórek</td></tr><tr><td>CytoView 48-dołkowe płytki MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-tMEA-48B</td><td>MEA</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Podłoże do macierzy zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>Płyn do pipet wewnątrzkomórkowych</td></tr><tr><td>EPC 10 USB&nbsp; wzmacniacz patch clamp</td><td>Warner Instruments</td><td>89-5000</td><td>Patch clamp</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, permeant cell permeant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Ca2+ pomiar stanów nieustalonych</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' s rozwiązanie</td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Stanford Instytut Sercowo-Naczyniowy iPSC Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529552</td><td>Tyrode" s roztwór</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>hiPSC-CM podłoże wysiewające</td></tr><tr><td>KOH 8&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td>Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet</td></tr><tr><td>Lambda DG 4</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td>Ca2+ pomiar stanów nieustalonych; ultraszybkie źródło światła przełączające długość fali</td></tr><tr><td>Luna-FL automatyczny licznik komórek fluorescencyjnych</td><td>WISBIOMED</td><td>LB-L20001</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>Maestro Pro&nbsp; System MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>MEA</td></tr><tr><td>Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR) Macierz błony podstawnej</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Podłoże macierzy zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Tyrode" s roztwór</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Tyrode' s roztwór</td></tr><tr><td>NaOH 10&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Tyrode' s</td></tr><tr><td>rozwiązanie NIS Elements AR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Ca2+ pomiar stanów nieustalonych</td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>pożywka hodowlana hiPSC-CM</td></tr><tr><td>System obrazowania ruchu komórek Sony SI8000 System obrazowania ruchu</td> komórkowego <td>Sony Biotechnology</td><td></td><td>Pomiar ruchu skurczowego</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Zacisk krosowy</td></tr><tr><td>Trypan niebieska plama</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Liczenie komórek</td></tr></tbody></table>

techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Kardiotoksyczność wywołana lekami jest główną przyczyną wycofywania leków z rynku. W związku z tym stosowanie odpowiednich przedklinicznych modeli oceny bezpieczeństwa kardiologicznego jest kluczowym krokiem podczas opracowywania leku. Obecnie ocena bezpieczeństwa kardiologicznego jest nadal w dużym stopniu uzależniona od badań na zwierzętach. Jednak modele zwierzęce są nękane słabą specyficznością translacyjną dla ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku, szczególnie pod względem cech elektrofizjologicznych serca. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania wiarygodnego, wydajnego i opartego na człowieku modelu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CM) okazały się nieocenionym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. hiPSC-CM można uzyskać od osób o różnym pochodzeniu genetycznym i różnych stanach chorobowych, co czyni je idealnym substytutem do indywidualnej oceny kardiotoksyczności wywołanej lekiem. W związku z tym należy ustanowić metodologie kompleksowego badania charakterystyki funkcjonalnej hiPSC-CM. W tym protokole szczegółowo opisujemy różne testy funkcjonalne, które można ocenić na hiPSC-CM, w tym pomiar kurczliwości, potencjału pola, potencjału czynnościowego i obchodzenia się z wapniem. Ogólnie rzecz biorąc, włączenie hiPSC-CM do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego może zrewolucjonizować opracowywanie leków.

Niniejszy protokół opisuje sposób pomiaru ruchu skurczowego, potencjału polowego, potencjału czynnościowego oraz przejściowego wzrostu stężenia Ca2+ w kardiomiocytach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs). Schemat obejmujący trawienie enzymatyczne, wysiew komórek, ich utrzymanie oraz przeprowadzenie analizy funkcjonalnej przedstawiono na Rysunku 1. Utworzenie monowarstwy hiPSC-CMs jest niezbędne do pomiaru ruchu skurczowego (<str...

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Ocena bezpieczeństwa pracy serca jest kluczowym elementem procesu opracowywania leku. Ludzkie kardiomiocyty pochodzące z iPSC okazały się wiarygodnym, wydajnym i opartym na ludziach modelem do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa kardiologicznego. Opracowaliśmy metodologie kompleksowego badania charakterystyki funkcjonalnej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, które mają bardzo ważne znaczenie w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych w kierunku kardiotoksyczności indukowanej lekami i medycynie precyzyjnej.Coraz powszechniejsze włączanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do standardowego procesu przedklinicznej oceny bezpieczeństwa może poprawić dokładność przewidywania toksyczności potencjalnych związków. Rozpocznij od hodowli ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC przez co najmniej 10 dni przed wykonaniem pomiaru. Włącz regulator temperatury i ustaw go na 37 stopni Celsjusza.Włącz mikroskop, kamerę i dopływ dwutlenku węgla. Napełnij płaszcz wodny uchwytu talerza odpowiednią ilością sterylnej wody dejonizowanej. Umieścić 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki i inkubować komórki przez co najmniej pięć minut.Otwórz oprogramowanie do wyświetlania, a następnie ustaw liczbę klatek na sekundę kamery na 75 klatek na sekundę, a rozdzielczość wideo lub obrazu na 1024 x 1024 pikseli. Zastosuj funkcje automatycznego ustawiania ostrości i automatycznej jasności, nagrywaj filmy i obrazy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Ostrożnie umieść ośmiomikrolitrową kroplę roztworu do powlekania matrycy pozakomórkowej na obszarze elektrody rejestrującej każdej studzienki z 48 płytek układu mikroelektrod.Następnie dodaj trzy mililitry sterylnej wody dejonizowanej do obszaru otaczającego studzienki, aby zapobiec parowaniu roztworu powlekającego. Używając końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, usuń większość dodatkowego podłoża z matrycy komórkowej z powierzchni studzienki w tym samym pojedynczym rzędzie lub kolumnie, nie dotykając elektrod. Wysiewaj 50 000 komórek na studzienkę w ośmiolitrowej kropli pożywki wysiewającej nad obszarem elektrody rejestrującej.Powtarzaj, aż wszystkie studzienki zostaną pokryte komórkami. Następnie należy inkubować płytki z matrycą mikroelektrod w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych. Powoli dodawaj 150 mikrolitrów pożywki wysiewającej do każdego dołka z płytkami układu mikroelektrod.W 10 dniu po posiewie sprawdź gęstość spontanicznie bijącej ludzkiej monowarstwy iPSC CM pod mikroskopem. Umieść 48-dołkową płytkę z matrycą mikroelektrod w przyrządzie rejestrującym. Upewnij się, że temperatura wynosi 37 stopni Celsjusza, a dwutlenek węgla wynosi 5%Otwórz oprogramowanie nawigatora.W oknie ustawień eksperymentalnych wybierz opcję konfiguracji serca w czasie rzeczywistym i zapisów potencjału pola. Zastosuj konfiguracje bicia spontanicznego lub wklej. W parametrach wykrywania dudnień ustaw próg wykrywania na 300 mikrowoltów, minimalny okres dudnienia na 250 milisekund, a maksymalny okres dudnienia na pięć sekund.Wybierz regresję wielomianową do obliczenia czasu trwania potencjału pola. Sprawdź, czy wyjściowy sygnał aktywności elektrycznej jest dojrzały i stabilny, a następnie uzyskaj wyjściową aktywność serca przez jedną do trzech minut. Wykonaj nagranie 10 dni po poszyciu.Zastąp ludzką pożywkę podtrzymującą iPSC CM roztworem tyrode'a i pozwól komórkom zaaklimatyzować się przez 15 minut. Włóż czujniki temperatury do komory i włóż do niej 35-milimetrową miskę. Dostosuj temperaturę do 37 stopni Celsjusza.Wyciągnij mikropipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Napełnij mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż je do uchwytu podłączonego do stopnia głowicy wzmacniacza patch clamp. Otwórz oprogramowanie akwizycyjne, załaduj protokół zapisu potencjału czynnościowego i wybierz konfigurację cęgów napięcia.Włóż mikropipetę do roztworu kąpieli i wybierz odpowiednie CM iPSC dla pojedynczego człowieka. Wyreguluj i opuść położenie mikropipety obok wybranej komórki za pomocą mikromanipulatora. Po włożeniu końcówki pipety do roztworu kąpieli sprawdź rezystancję pipety na monitorze oscyloskopu.Umieść pipetę blisko celi, a impulsy prądu nieznacznie się zmniejszą, aby odzwierciedlić rosnący opór uszczelnienia. Zastosuj delikatne ssanie z podciśnieniem, aby zwiększyć opór. W ten sposób powstanie gigafoka.Następnie zastosuj funkcję uszczelnienia. Zastosuj dodatkowe ssanie, aby przerwać membranę, aby uzyskać konfigurację zapisu całej komórki. W tym momencie przełącz się z trybu cęgów napięciowych na tryb cęgów prądowych lub brak wstrzykiwania prądu za pomocą okna dialogowego wzmacniacza.Naciśnij przycisk nagrywania, aby wygenerować i zapisać nagranie potencjału czynnościowego files. Wykonaj pomiar stanu nieustalonego wapnia co najmniej 10 dni po posiewaniu. Przygotuj świeży roztwór tyrode i roztwór ładujący Fura-2 AM.Odessać ludzką pożywkę konserwacyjną iPSC CM i dwukrotnie umyć komory roztworem tyrode'a. Zastosuj 100 mikrolitrów roztworu ładującego Fura-2 AM i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór ładujący Fura-2 AM roztworem Tyrode'a i inkubuj przez co najmniej pięć minut w celu całkowitej deestryfikacji Fura-2 AM. Dodaj kroplę olejku immersyjnego na 40-krotny obiektyw immersyjny w odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym.Umieść komorę celi w stage adapterze mikroskopu. Zamontuj przewody regulatora temperatury do komory kąpieli i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj elektrody do stymulacji pola elektrycznego i ustaw impulsy na 0,5 herca o czasie trwania 20 milisekund.Włącz ultraszybkie przełączające źródło światła o długości fali i ustaw je na tryb szybkiego przełączania 340 nanometrów i 380 nanometrów. Zastosuj czas naświetlania wynoszący 20 milisekund dla obu długości fal i czas nagrywania wynoszący 20 sekund. Nagraj wideo odzwierciedlające zmiany stanu nieustalonego wapnia w czasie rzeczywistym, wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.Do pomiaru ruchu skurczowego użyto monowarstwy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Analiza śladu ruchu relaksacyjnego skurczu za pomocą oprogramowania analizatora wykryła początek skurczu, szczyt skurczu, koniec skurczu, szczyt relaksacyjny i koniec relaksacji. Zaobserwowano pełne pokrycie monowarstwy ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC na wszystkich elektrodach w płytkach układu mikroelektrod.Dojrzałe przebiegi zarejestrowane przez każdą elektrodę odzwierciedlały potencjał pola serca o możliwej do zidentyfikowania charakterystyce. Po analizie uzyskano okres dudnienia, czas trwania potencjału pola i amplitudę skoku. Zapisy klamry krosowej całych komórek w bieżącym trybie zaciskania rejestrowały spontaniczne potencjały czynnościowe pojedynczych kardiomiocytów.Po analizie uzyskano kilka parametrów, w tym amplitudę, maksymalny potencjał rozkurczowy i czas trwania potencjału czynnościowego. Po analizie obrazowania wapnia uzyskano stosunek F340 do F380 w czasie i wykreślono surowe ślady stymulowanych stanów przejściowych wapnia. Ponadto uzyskano takie parametry jak amplituda, rozkurczowe ciśnienie wapnia i tau w rozpadzie wapnia.Ważne jest, aby używać ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, które są w dobrym stanie, a także zapewnić wysoką czystość ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Protokół ten obejmuje cztery specyficzne techniki badania funkcjonalności kardiomiocytów pochodzących z ludzkiego iPSC, innej konfiguracji lub automatycznej, czy badać prądy jonowe serca, które odgrywają kluczową rolę w pracy serca

technical-applications-microelectrode-array-patch-clamp-recordings-on

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Aby odkryć najwcześniejsze mechanizmy molekularne leżące u podstaw inicjacji raka prostaty, desperacko potrzebne są nowatorskie i innowacyjne systemy i podejścia do modelowania ludzi.  Potencjał mezenchymy zatok układu moczowo-płciowego przed gruczołem krokowym (UGSM) do indukowania pluripotencjalnych populacji komórek macierzystych do tworzenia ludzkiego nabłonka prostaty jest potężnym narzędziem eksperymentalnym w badaniach nad prostatą.

Tworzenie ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą rekombinacji tkankowej mezenchymy zatok moczowo-płciowych gryzoni i ludzkich komórek macierzystych

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Poznaj metody oceny kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM przy użyciu mikromacierzy elektrod i patch clamp. Techniki te wspierają badania bezpieczeństwa kardiologicznego w rozwoju leków.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów