Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki
11 listopada 2025
Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek przylegających przy użyciu tesselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki, znanej objętości, rozmiaru genomu oraz etapu cyklu komórkowego.
Obecna metoda pozwala na pomiary bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych w celu badania ograniczeń przestrzennych struktur chromatyny, które w przeciwnym razie charakteryzują się jedynie modyfikacjami histonów po translacji. Tesselacja Voronoi w połączeniu z SMLM pozwala na bezwzględne oszacowanie gęstości DNA w zależności od par zasad na mikrometr kwadratowy. Jedyną potrzebną wiedzą apriori jest całkowita zawartość DNA w mierzonym jądrze komórki.
W przyszłych eksperymentach ciekawe będzie zbadanie, czy bezwzględne różnice gęstości korelują z informacjami biologicznymi pochodzącymi z innych metod, takich jak immunofluorescencja modyfikacji epigenetycznych czy dane Hi-C. Zacznij od odtworzenia zeskanowanego obszaru, łącząc wcześniej nagrane pojedyncze obrazy. Otwórz CellProfiler i załaduj pipeline cellcycleanalysis.cpproj.
W pierwszym kroku obrazów pipeline przeciągnij i upuść obrazy, w tym obraz referencyjny. Następnie określ miejsce, w którym będą przechowywane obrazy referencyjne. Następnie kliknij ikonę Start Test, a następnie Uruchom.
Gdy histogram jąder na analizowanym obrazie zostanie wyświetlony, określ interwały intensywności dla faz G1, S i G2 oraz upewnij się, że są one wprowadzone w kolejnych etapach obiektu filtru w potoku oraz że te kroki są aktywne. Następnie kliknij ponownie przycisk Run, aby kontynuować drugą połowę pipeline. Spójrz na trzy zdjęcia z nakładkami reprezentującymi różne etapy cyklu komórkowego, G1, S lub G2, i wybierz jądra w G1 lub G2 do dalszego obrazowania, aby ilość DNA w parach zasad jąder obrazowych była znana.
Przemieszczenie komórek na mikroskopie lokalizacyjnym pojedynczątkowej i zapewnienie prawidłowego mrugania procesu FPALM. Najpierw nagraj stos 3D wybranego jądra, używając tylko 500 klatek na fragment. Pozwala to określić względną ilość DNA w środkowej części ciała, które później jest obrazowane z wieloma ramkami, aby odsłonić jego ultrastrukturę.
Rozpocznij akwizję serii zdjęć z czasem naświetlania 50 milisekund, co daje szybkostrzelność około 20 klatek na sekundę. Przeprowadź stos Z przez jądro z odstępami krokowymi 200 nanometrów i tylko 500 klatek na przekrój optyczny światła. Po pozyskaniu stosu wróć do początkowej pozycji z i pobierz główny zestaw danych 50 000 klatek z tym samym czasem ekspozycji wynoszącym 50 milisekund.
Otwórz zbiór danych FPALM w ImageJ. Aby zoptymalizować ustawienia wykrywania sygnałów, kliknij ThunderSTORM, a następnie Uruchom analizę. Teraz wybierz ustawienie kamery.
Wprowadź poprawny rozmiar pikseli danych obrazu, liczbę A/D, efektywność kwantową używanego aparatu, poziom bazowy i wzmocnienie elektromagnetyczne, a następnie kliknij OK. Wybierz algorytm do określenia współrzędnych lokalizacji, dopasowując sygnały. W sekcji filtrowania obrazów użyj filtra falkowego B-Spline z B-Spline rzędu 3 i skalą B-Spline 2. Następnie ustaw metodę przybliżonej lokalizacji cząsteczek na maksimum lokalne, ustaw próg maksymalnej intensywności szczytowej i łączność na ośmiokątne sąsiedztwo.
W sekcji lokalizacji cząsteczek subpikselowych, jako metodę, wybierz zintegrowany Gaussian z PSF, ustaw promień dopasowania px na 3, wybierz metodę dopasowania jako maksymalne prawdopodobieństwo i ustaw początkową sigmę na 1,6. Następnie kliknij OK, aby rozpocząć wykrywanie sygnałów i rekonstrukcję obrazu. Jeśli akwizycja jest podzielona na różne stosy obrazów, połącz tabele lokalizacyjne w ThunderSTORM.
Aby to zrobić, kliknij Import w oknie wyskakującym (pop-up). Upewnij się, że opcja Dodaj do bieżącej tabeli jest aktywowana oraz że użyto poprawnej liczby początkowej, aby uniknąć nadpisywania lokalizacji w tabeli. Następnie wybierz ścieżkę do pliku i kliknij OK, aby zaimportować jeden plik po drugim.
Aby zapobiec nadmiernemu liczeniu sygnałów w kolejnych klatkach, połącz dane lokalizacyjne z maksymalną odległością 20 nanometrów, 1 maksymalną liczbą klatek niedostępnych i 0 maksymalnych klatek na cząsteczkę, a następnie kliknij Merge. Aby zmierzyć i skorygować dryf poprzez krzyżowe korelacje podsekcji danych, otwórz menu Korekcji dryfu i kliknij strzałki. Dodaj 3 pojemniki i ustaw powiększenie na 5.
Następnie kliknij Apply, a pojawi się okno pokazujące dryf x i y. Aby określić ilość sygnału proporcjonalną do zawartości DNA w każdym przekroju wcześniej nagranego stosu 3D z 500 klatkami dla każdego fragmentu, wybierz Wtyczki, następnie ThunderSTORM, następnie Import/Eksport i importuj tabelę wyników dla pierwszego fragmentu stosu. Aby uniknąć nadmiernego liczenia sygnałów z innych planów obrazu stosu 3D, należy usunąć sygnały spoza 200-nanometrowego odstępu krokowego w z między fragmentami.
Naciśnij histogram Plot i w otwartym dialogu Dystrybucja wybierz z i naciśnij OK. Określ pozycję piku i użyj pola filtra do wyboru sygnałów o optycznym kroku 200 nanometrów. Kliknij na Wizualizację i wybierz opcję Histogramów, a następnie OK. Zapisz powstały obraz w folderze w formacie TIFF. Otwórz wszystkie fragmenty i połącz je za pomocą Obrazu, następnie Stosów, a następnie Obrazów do stosu.
Po zaznaczeniu całego obszaru obrazu przejdź do Analizuj, kliknij Narzędzia i wybierz Menedżera ROI. Kliknij Dodaj (Dodaj), następnie Analizuj, następnie Zestaw pomiarów i wybierz Zintegrowana gęstość. Teraz wybierz opcję Więcej, wybierz Wielokrotne miary, zaznaczy Mierz wszystkie stosy oraz Jeden wiersz na kawałek.
Kliknij OK, a pojawią się wyniki. Suma intensywności wszystkich przekrojów jest proporcjonalna do zawartości DNA w całym jądrze, tak jak intensywności poszczególnych przekrojów są proporcjonalne do ich ułamku w całym genomie. Po otwarciu tabeli wyników płaszczyzny centralnej, która zawiera sygnały 50 000 klatek, przefiltruj ją do grubości 100 nanometrów.
Stwórz histogram powstałych sygnałów, jak pokazano wcześniej, i zmierz całkowitą gęstość sekcji środkowej. Przekonwertuj dużą tabelę lokalizacji ThunderSTORM zawierającą informacje ultrastrukturalne z sekcji centralnej z formatu csv do formatu ORTE, uruchamiając skrypt MATLAB TS2orte. m, który przekształca tabelę lokalizacyjną w macierz MATLAB i zapisuje ją w formacie MAT.
Wejdź do folderu LAND-voronoi, a w podfolderze coreAlgorithm otwórz zestaw plików voronoicluster. m oraz dostosowują zawartość DNA, ułamek obserwowanego centralnego przekroju całego ułamku jądra DNA oraz lokalizacje oraz współczynnik konwersji zgodnie z typem komórki i etapem cyklu komórkowego do obliczeń gęstości bezwzględnej. Edytuję skrypt, który rozpoczyna analizę voronoi.m.
Dostosuj ścieżkę pliku do danych lokalizacji orte oraz folderu wyjściowego dla plików wyników. Określ współrzędne definiujące obszar, w którym należy wykonać tesselację. Zdefiniuj wiele obszarów do obliczeń w tym samym zbiorze danych wejściowych.
Po uruchomieniu skryptu poszukaj obrazu pokazującego bezwzględne gęstości DNA wraz z innymi plikami zawierającymi wykresy pokazujące histogram rozkładu powierzchni oraz gęstości. m zawierającym gęstości każdej pojedynczej obliczonej komórki Voronoi w folderze wyjściowym. Pomiar FPALM, obejmujący 50 000 klatek, dał wykrycie lokalizacji w obrębie 100-nanometrowej grubości w obszarze środkowym o grubości 2,68 razy 100 razy 100 razy 100 000.
Dokładność lokalizacji zrekonstruowanego obrazu wyniosła 10 nanometrów. Duża liczba lokalizacji umożliwiła połączenie obrazowania superrozdzielczości z pokazem absolutnej gęstości DNA. Było oczywiste, że zmierzone gęstości DNA nie były równomiernie rozłożone w całym jądrze i obejmowały szeroki zakres dynamiczny.
Większe powiększenia obszarów w jądrze pokazujące większe komórki Voronoi wskazywały na niską gęstość DNA, podczas gdy mniejsze komórki wskazywały na wysoką gęstość DNA. Gęstość DNA mierzona w G1C3H10T półjądrze wykazała bezwzględny rozkład gęstości DNA w jądrze innego typu i gatunku. Chociaż podstawowa struktura przypominała wczesne jądro G1 HeLa, posiadała także skupiska paracentrycznej heterochromatyny.
Nie zaobserwowano dramatycznych zmian architektonicznych w jądrze G2, mimo nieznacznie zwiększonego rozmiaru jądra. Jądro HeLa poddane TSA wykazywało znaczące różnice pod względem topografii jądrowej i gęstości DNA. Z wyjątkiem obwodowej heterochromatyny, która wykazywała wyspy o wyższej gęstości DNA, reszta chromatyny wyglądała znacznie bardziej jednorodnie i zdekondensowana.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie opisuje metodę pomiaru bezwzględnych gęstości DNA w jądrach komórkowych przyczepianych, wykorzystującą teselacje Voronoi danych z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM). Takie podejście umożliwia badanie ograniczeń przestrzennych w strukturach chromatyny, łącząc informacje genetyczne z fazami cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Genetyka
- Mikroskopia i techniki obrazowania
Tło
- Zrozumienie gęstości DNA jest kluczowe dla badania architektury chromatyny.
- Obecne metody często opierają się na modyfikacjach post-translacyjnych histonów.
- Znajomość całkowitego zawartości DNA jest niezbędna dla dokładnych pomiarów.
Stosowane metody
- Teselacja Voronoi danych SMLM
- Przyczepiane jądra komórkowe jako system biologiczny
- Oprogramowanie do analizy obrazów takie jak CellProfiler i ImageJ
Główne wyniki
- Pomiary dają gęstości DNA wyrażone w parach zasad na mikrometr kwadratowy.
- Przyszłe kierunki obejmują korelację różnic gęstości z modyfikacjami epigenetycznymi.
- Metoda potwierdza wpływ faz cyklu komórkowego na pomiar zawartości DNA.
Wnioski
- Ten protokół pozwala na precyzyjne oceny gęstości DNA w jądrach komórkowych.
- Badanie otwiera drogę dla integracji danych genomowych z fizycznymi cechami chromatyny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of absolute DNA density in cell nuclei addresses a critical gap in understanding chromatin architecture beyond epigenetic marks, enabling direct assessment of spatial constraints that may influence gene regulation. This capability enhances predictive confidence in early discovery by providing high-resolution, quantitative data on nuclear organization relevant to target validation and mechanistic de-risking. Integrating such spatially resolved DNA density measurements supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of chromatin spatial organization for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying DNA density variations linked to gene activity states.
- Provides a quantitative framework for hypothesis testing regarding spatial constraints in gene regulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated nuclear models for downstream chromatin or epigenetic assays.
- Delivers reproducible, quantitative DNA density outputs for assay standardization.
- Enables robust comparison of chromatin states across cell cycle stages and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin density mapping with disease-relevant nuclear phenotypes when integrated with orthogonal data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking physical chromatin features to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for chromatin-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model refinement, enabling integration of spatial chromatin data with functional and epigenetic analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of chromatin spatial constraints and their regulatory implications.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DNA density metrics for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates high-resolution, statistically robust density maps for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of chromatin architecture with disease models when combined with additional molecular data.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for nuclear architecture analysis across diverse cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Standardizes nuclear density measurement with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative spatial data on chromatin organization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying targets and strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule localization microscopy and advanced image analysis.
- Demands access to high-resolution microscopy platforms and computational infrastructure for data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptation across cell types and cell cycle stages requires careful calibration of DNA content and segmentation parameters.
- Practical limitations include the need for accurate total DNA content and potential integration with orthogonal molecular data.
