Name: Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych przy użyciu teselacji Voronoia i mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki. Technika ta pozwala badać przestrzenne ograniczenia struktur chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Sandrze Ritz za umożliwienie korzystania z IMB Imaging Core Facility, dr Shih-Ya Chen za możliwość korzystania z jej specjalnie zbudowanego mikroskopu SMLM, dr Leonardowi Kubbenowi (IMB) za dostarczenie ludzkich fibroblastów, dr Christofowi Niehrsowi (IMB) za dostarczenie linii komórkowej C3H10T1/2 oraz dr Jan Neumann za zmodyfikowany przez nas MATLAB-Script do tej pracy. Chcemy również podziękować dr Marion Cremer, dr Thomasowi Cremerowi oraz dr Christophowi Cremerowi za owocne dyskusje.

<ol><li>Passarge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emil+Heitz+and+the+concept+of+heterochromatin%3A+longitudinal+chromosome+differentiation+was+recognized+fifty+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago.</a> American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).</li>
<li>Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+halogenated+precursors+for+simultaneous+DNA+and+RNA+detection+by+means+of+immunoelectron+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).</li>
<li>Solimando, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+nucleotide+excision+repair+proteins+after+UV-induced+DNA+damage+in+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus.</a> Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).</li>
<li>Niedojadlo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribed+DNA+is+preferentially+located+in+the+perichromatin+region+of+mammalian+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei.</a> Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).</li>
<li>Padeken, J., Heun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolus+and+nuclear+periphery%3A+velcro+for+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin.</a> Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of histone modification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Saul, D., Kosinsky, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+aging+and+aging-associated+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of aging and aging-associated diseases).</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).</li>
<li>Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+epigenetic+landscape+during+the+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%2C+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition.</a> Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).</li>
<li>Stevens, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structures+of+individual+mammalian+genomes+studied+by+single-cell+Hi-C%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C.</a> Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Cremer, C., Masters, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+enhancement+techniques+in+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+H%22%5BJournal%5D)">Resolution enhancement techniques in microscopy.</a> The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).</li>
<li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Szczurek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+binding+activated+localization+microscopy+through+reversible+change+of+DNA+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation.</a> Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).</li>
<li>Szczurek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+chromatin+nanostructure+with+binding-activated+localization+microscopy+based+on+DNA+structure+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).</li>
<li>Levet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-Tesseler%3A+a+method+to+segment+and+quantify+localization-based+super-resolution+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data.</a> Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).</li>
<li>Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+staging+of+individual+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).</li>
<li>Stirling, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>Team, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTeam%2C+RC+%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , (2016).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Maeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+size+of+transcription+factors+is+key+to+transcriptional+regulation+in+chromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics.+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).</li>
<li>Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-like+chromatin+in+the+cell%3A+What+can+we+learn+from+imaging+and+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling.</a> Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).</li>
<li>Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+miniSOG+tagged+DNA+repair+proteins+in+combination+with+Electron+Spectroscopic+Imaging+%28ESI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI).</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRD2+compartmentalizes+the+accessible+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">BRD2 compartmentalizes the accessible genome.</a> Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).</li>
<li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+softening+expedites+interstitial+cell+migration+in+fibrous+networks+and+dense+connective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues.</a> Science Advances. 6 (25), (2020).</li>
<li>Gelléri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True-to-scale+DNA-density+maps+correlate+with+major+accessibility+differences+between+active+and+inactive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+in+situ%3A+the+contribution+of+DNA+ultrastructural+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4D+nucleome%3A+Evidence+for+a+dynamic+nuclear+landscape+based+on+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).</li>
<li>Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+evaluation+of+shrinkage+artefacts+induced+by+fixatives+and+embedding+resins+on+osteocyte+processes+and+pericellular+space+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+A%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).</li>
<li>Gavelis, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dinoflagellate+nucleus+contains+an+extensive+endomembrane+network%2C+the+nuclear+net%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net.</a> Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).</li>
<li>Rouquette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+high-resolution+three-dimensional+network+of+chromatin+and+interchromatin+space%3A+a+novel+electron-microscopic+approach+to+reconstructing+nuclear+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture.</a> Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).</li>
<li>Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-limited+compartmentalization+of+mammalian+cell+nuclei+assessed+by+microinjected+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules.</a> Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).</li>
<li>Lenart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+in+starfish+oocytes+proceeds+by+partial+NPC+disassembly+followed+by+a+rapidly+spreading+fenestration+of+nuclear+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).</li>
<li>Verschure, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+chromatin+domains+in+the+mammalian+nucleus+are+accessible+to+large+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules.</a> EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).</li>
<li>Strickfaden, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+chromatin+behaves+like+a+solid+on+the+mesoscale+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells.</a> Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).</li>
<li>Lin, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M33+condenses+chromatin+through+nuclear+body+formation+and+methylation+of+both+histone+H3+lysine+9+and+lysine+27%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).</li>
<li>Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+charge-dependent+phase+transition+determines+interphase+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Artykuł ten opisuje, jak mierzyć bezwzględne gęstości DNA w jądrach komórek ssaków za pomocą SMLM. Ponadto pokazaliśmy, jak określić etap cyklu komórkowego hodowanych komórek oraz jak wykorzystać te informacje do oszacowania ilości DNA obecnej w lekkim, optycznym ultracienkim przekroju. Szczegółowo opisano także przygotowanie komórek przylegających do mikroskopii fBALM SMLM oraz sposób przetwarzania danych SMLM w celu uzyskania superrozdzielczych mikroskopowych obrazów DNA genomowego w jądrach komórkowych. Na koniec prot...

Od początków biologii komórki jądro komórkowe – będące siedzibą informacji genetycznej – fascynowało biologów. Po zastosowaniu samodzielnie opracowanych metod barwienia cytologicznego, Emil Heitz w 1928 roku odkrył w 1928 roku inne, intensywnie barwione obszary wewnątrz jądra komórki1. Obszary o silniejszym barwieniu, gęstości nazywał "heterochromatyną", natomiast mniej mocno barwione, mniej gęste obszary nazwał "euchromatyną". Z czasem okazało się, że aktywne geny znajdują się głównie w euchromatynie, podczas gdy gęstsze obszary były bogate w powtarzalne pierwiastki i geny ciche. Terminy heterochromatyna i euchromatyna przetrwały do dziś, choć ich definicja zmieniła się z właściwości strukturalnych na molekularne (patrz niżej). Dziś wiemy, że jądro komórkowe dzieli się na dwie główne fazy. Jedna ciecz (komora interchromatyna), w której znajdują się ciała jądrowe, komora splicingowa i nukleoplazma, oraz druga stała, hydrożelowa domena chromatyna, obejmująca terytoria chromosomów i nukleoli2. Na granicy przestrzeni interchromatyny chromatyna jest mniej gęsta, i to właśnie tam zachodzą głównie procesy genetycznie aktywne, takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa, 3,4,5, natomiast sąsiadujące z warstwą, wokół jąderka i w pobliżu centromerów, chromatyna wykazuje wysoki poziom zagęszczenia i jest ogólnie dość nieaktywna transkrypcyjnie6.
Na poziomie molekularnym chromatyna powstaje z DNA owiniętego wokół nukleosomów (oktamera białek histonowych rdzeniowych). Histony posiadają wewnętrznie nieuporządkowane domeny ogonowe, które można modyfikować po translacji, dodając kilka grup chemicznych (metylo-, acetyl, fosfor-, biotyna), aminokwasów (arginina), a nawet białek (SUMO, Ubiquitin)7. Te modyfikacje mogą być odczytywane i przyciągać inne białka (np. remodelator chromatyny, HP1, białka naprawcze, RNA), a tym samym definiować stan fizjologiczny sekwencji DNA (transkrypcjonalnie permisywny/restrykcyjny), bez bezpośredniej zmiany jej sekwencji (stąd "epi"genetycznej)7. Typ i liczba modyfikacji wokół konkretnej sekwencji mogą się znacznie różnić między typami komórek, są odwracalne i mogą się zmieniać w trakcie rozwoju, starzenia się i choroby 8,9,10. Istnieją modyfikacje ogonów histonowych, które są bardziej widoczne w silnie transkrybowanych obszarach, oraz modyfikacje dominujące w regionach genomu o niewielkiej lub żadnej aktywności transkrypcyjnej.
Na przykład obszary silnie transkrybowane bogate w modyfikacje H3K4 lub których ogonki histonowe są acetylowane, zwykle określane są jako euchromatyna, natomiast obszary bogate w represyjne modyfikacje histonowe (H3K9me3, H3K27me3 lub H4K20me3) określane są jako heterochromatyna, która dzieli się dalej na heterochromatynę konstytutywną (transkrypcyjną nieaktywną we wszystkich komórkach) (np. H4K20me3) oraz heterochromatynę fakultatywną (chromatynę wyciszaną w zależności od typu komórki, np. H3K27me3)6. Chociaż metody biochemiczne i molekularno-biologiczne są bardzo dobre do pomiaru zmian chemicznych na poziomie sekwencji, znacznie trudniej jest ich używać do formułowania stwierdzeń dotyczących właściwości przestrzennych w mezoskali za pomocą tych metod.
Na przykład podjęto próby rekonstrukcji modeli przestrzennych genomu11, wykorzystując informacje o bliskości z eksperymentów Hi-C, które wykrywają i mapują bliskość DNA pomiędzy regionami sekwencji. Jednak bezpośrednie porównanie z wysokorozdzielczymi obrazami z mikroskopii świetlnej i elektronowej pokazuje, że jest to możliwe tylko w ograniczonym stopniu (Rysunek 1). Chociaż metody takie jakHi-C 12 potrafią prawidłowo wykrywać terytoria chromosomów w komórkach międzyfazowych jako odrębne jednostki, modele te są raczej "krótkowzroczne", ponieważ same bliskości sekwencji DNA są ślepe, by odzwierciedlać relacje przestrzenne między dalszymi częściami genomu, a zatem nie są zbyt dobrze przystosowane do prawidłowej rekonstrukcji genomu 3D. Dlatego różnice gęstości nie mogą być właściwie odzwierciedlone przez informacje o częstotliwości kontaktu. Prowadzi to do "spaghettified" reprezentacji genomu w jądrze (patrz Rysunek 1B), które wydają się występować w kuli wełnianych, łatwo dostępnych pętli.
Aby utorować drogę do integracyjnego, bardziej realistycznego obrazu jądra łączącego informacje biochemiczne z danymi biofizycznymi i strukturalnymi, należy opracować metody pozwalające generować dane na różne aspekty organizacji jądrowej. Do niedawna trudno było również określić bezwzględne gęstości DNA w jądrach komórkowych na podstawie danych obrazowych. Powodem tego były ograniczone rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów świetlnych, problemy w mikroskopii elektronowej z precyzyjnym barwieniem DNA oraz niewielkie objętości obserwacyjne w mikroskopii elektronowej.
Rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów fluorescencyjnych jest ograniczona przez dyfrakcję światła. Obraz punktowego źródła światła jest rozproszony ze względu na granicę dyfrakcyjną i można go opisać za pomocą funkcji rozproszenia punktowego (PSF). Według PSF obraz fluoroforu, który można w dobrym przybliżeniu uznać za punktowe źródło światła, zajmuje objętość o określonym rozmiarze wokół źródła (fluoroforu)13. Gdy wiele fluoroforów, znajdujących się znacznie bliżej siebie niż ich obrazy ograniczone dyfrakcją, jest wzbudzanych jednocześnie, rozkłady intensywności na obrazach są nakładane, a lokalizacja pojedynczych fluoroforów nie może zostać rozróżniona. Sekwencyjna, stochastyczna emisja światła z fluoroforów () pozwala na optyczną izolację pojedynczych cząsteczek, a tym samym na znalezienie ich dokładnych lokalizacji poprzez określenie centrum intensywności i grawitacji ich sygnałów.
Może to być wykorzystywane do rekonstrukcji informacji strukturalnych próbek poprzez gromadzenie danych lokalizacyjnych fluoroforów z wielu zarejestrowanych obrazów. Metoda ta jest zazwyczaj określana jako mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM) (więcej informacji wartykule 14). Im więcej fotonów fluorofor emituje podczas swojego "włączenia", tym dokładniej można określić centra grawitacji intensywności. Soczewki astygmatyczne w ścieżce wiązki przekształcają sygnały fluoroforów powyżej lub poniżej optycznej płaszczyzny ogniskowej w elipsy, które mogą służyć do określenia ich położenia wzdłuż osi optycznej. Długie osie elips, pochodzące z sygnałów fluorescencjowych poniżej płaszczyzny ogniskowej, są obracane o 90° w porównaniu do osi elips pochodzących z fluoroforów powyżej ogniskowej. Ponadto stosunek osi tych elipsów pozwala określić położenie cząsteczki wzdłuż osi optycznej względem płaszczyzny ogniskowej w zakresie ±300 nm15.
Jakość obrazów o superrozdzielczości generowanych przez rekonstrukcję stochastycznych zdarzeń mrugania zależy silnie od gęstości etykietowania oraz liczby zdarzeń mrugania. Te ostatnie zależą od fotostabilności fluoroforów oraz liczby zdarzeń mrugania przed ich ostateczną awarią (liczba cykli włączania/wyłączania). Metoda opisana tutaj do uzyskania superrozdzielczych obrazów rozkładu DNA wewnątrzjądrowego nazywana jest fBALM (DNA structure fluctuating-assisted binding-activated localization microscopy). Opiera się na fluoroforach, które przemijają się w kwasy nukleinowe i fluorescencją dopiero po związaniu się zDNA16,17. Ze względu na naładowane reszty szkieletu fosforowo-diesterowego, DNA jest polimerem o silnym ładunku ujemnym. Stabilizacja komplementarnych nici DNA w żywych komórkach wymaga neutralizacji przez białka o dodatnim ładunku (np. histony) i jony. Obniżając pH, stabilność komplementarnego parowania zasad jest zmniejszana, co pozwala barwnikom wstawionym na dyfundację wchodzić i wychodzić16,17.
W zależności od barwnika fluorescencyjnego wtrącającego, ten stan może być osiągnięty w określonym zakresie pH. Fluorescencyjne barwniki, takie jak YoYo-1 i SYTOX Orange, fluorescencją są widoczne tylko wtedy, gdy są związane z DNA, a ponieważ barwniki wstawające (w przeciwieństwie do barwników wiążących drobny rowek DNA, takich jak Hoechst i 4',6-diamidino-2-fenylindole [DAPI]) zwykle wiążą się niezależnie od sekwencji, są dobrze przystosowane do mapowania rozkładu DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej.
Tesselacja Voronoi to metoda matematyczna pozwalająca na podział przestrzeni na różne podziały w zależności od położenia punktów. W przestrzeni 2D rozmiar powstałych kafelków odzwierciedla odwrotność gęstości punktów18. Ponieważ mikroskopia lokalizacyjna rekonstruuje obrazy jako zbiór punktów reprezentujących położenie fluoroforów, tesselacja Voronoi może pomóc w określeniu gęstości sygnałów lokalizacyjnych (Rysunek 2). Dlatego użycie barwnika specyficznego dla DNA jako fluoroforu pozwala na pomiar gęstości DNA.
A priori znajomość zawartości DNA (liczby par zasad) oraz wymiaru przestrzennego jądra pozwala na przekształcenie względnych gęstości DNA w bezwzględne gęstości DNA. Poniższy protokół pokazuje mapowanie bezwzględnych gęstości DNA w komórkach przylegających przy użyciu SMLM w bardzo wysokiej rozdzielczości i pokazuje, że te gęstości podlegają dużym zmianom.

<table><tbody><tr><td><silna>hodowla komórek</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mikro - Naczynie 35 mm, wysoka siatka – dno szklane 500</td><td>Ibidi</td><td>81168</td><td></td></tr><tr><td>C3H 10T1/2</td><td>IMB (Laboratorium Niehrsa)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12320032</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Technologie życia</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Obiekt Rdzenia Mikroskopii (IMB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HFB</td><td>IMB (Kubben Lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieniezbędne i witaminy na HFB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan sodu</td><td>S8636</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Przygotowanie do próbek</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalazy</td><td>Merck</td><td>2593710</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>ThermoFisher</td><td>241922500</td><td></td></tr><tr><td>Glukozoksydaza</td><td>Merck</td><td>49180</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2286</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw próbek fluorescencyjnych mikrosfer TetraSpeck</td><td>ThermoFisher</td><td>T7284</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td><silne>Oprogramowanie</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioFormaty</td><td>OpenMicroscopy.org</td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr><tr><td>CellProfiler v4.2.1</td><td>CellProfiler.org</td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://cellprofiler.org</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>nih.gov</td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://imagej.net/software/fiji/?Downloads</td></tr><tr><td>LĄD</td><td>nih.gov</td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://github.com/Jan-NM/LAND</td></tr><tr><td>MatLab 2021</td><td>Matematyka</td><td></td><td>oprogramowanie komercyjne – wymaga "Image Processing Toolbox"</td></tr><tr><td>R v.4.. 0.3</td><td>r-project.org</td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://www.r-project.org</td></tr><tr><td>ThunderSTORM v1.3</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie open source https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td></tr><tr><td><silne>mikroskopy: </mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AF 7000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica GSD</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop SMLM</td><td>Laboratorium Cremer</td><td></td><td>na zamówienie zbudowany przez dr. S-Y. Chen</td></tr></tbody></table>

mapowanie bezwzględnej gęstości dna w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki

Mapping Absolute DNA Density in Cell Nuclei using Single-molecule Localization Microscopy

W jądrze komórkowym geny ciche zazwyczaj znajdują się w obszarach o wysokiej gęstości chromatyny zwanych heterochromatyną, podczas gdy aktywne geny można znaleźć głównie na styku chromatyny z przestrzenią interchromatyną zwaną euchromatyną. Obecnie charakterystyka eu- i heterochromatyny opiera się głównie na epigenetycznych modyfikacjach białek histonowych w sekwencji DNA, podczas gdy niewiele wiadomo o bezwzględnych gęstościach DNA w jądrze komórkowym i ich funkcjonalnych implikacjach. Modele jądra oparte wyłącznie na danych biochemicznych i założeniach dotyczących natury chromatyny jako polimeru nadal zasadniczo różnią się od danych obrazowych uzyskanych w mikroskopii wysokiej rozdzielczości. Wskazuje to, że wciąż brakuje ważnych informacji istotnych strukturalnie. Uważamy, że ograniczenia przestrzenne mogą mieć wpływ na regulację genów, dlatego opracowaliśmy metodę umożliwiającą pomiar bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek ssaków poprzez przekształcanie danych lokalizacji superrozdzielczości w dokładne w skali mapy gęstości za pomocą tesselacji Voronoi.

Jądro HeLa pokazane na Rysunku 5 zostało wybrane na podstawie tabeli wygenerowanej przez CellProfiler4.2.1 w sekcji 3, aby mieć zintegrowaną intensywność fluorescencji zbliżoną do pierwszego piku na histogramie pokazanym na Rysunku 5 , który reprezentuje jądra w fazie G1 . Ze względu na niewielki rozmiar i wyraźną strukturę wewnętrzną, prawdopodobnie jest to wczesne jądroG1 , które wciąż jest w trakcie dekondensacji chromatyny po mitozie. B...

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek przylegających przy użyciu tesselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki, znanej objętości, rozmiaru genomu oraz etapu cyklu komórkowego.

Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki

Within the cell nucleus, silent genes are generally located in chromatin areas of high density called heterochromatin, whereas active genes can be mostly ...

Obecna metoda pozwala na pomiary bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych w celu badania ograniczeń przestrzennych struktur chromatyny, które w przeciwnym razie charakteryzują się jedynie modyfikacjami histonów po translacji. Tesselacja Voronoi w połączeniu z SMLM pozwala na bezwzględne oszacowanie gęstości DNA w zależności od par zasad na mikrometr kwadratowy. Jedyną potrzebną wiedzą apriori jest całkowita zawartość DNA w mierzonym jądrze komórki.W przyszłych eksperymentach ciekawe będzie zbadanie, czy bezwzględne różnice gęstości korelują z informacjami biologicznymi pochodzącymi z innych metod, takich jak immunofluorescencja modyfikacji epigenetycznych czy dane Hi-C. Zacznij od odtworzenia zeskanowanego obszaru, łącząc wcześniej nagrane pojedyncze obrazy. Otwórz CellProfiler i załaduj pipeline cellcycleanalysis.cpproj.W pierwszym kroku obrazów pipeline przeciągnij i upuść obrazy, w tym obraz referencyjny. Następnie określ miejsce, w którym będą przechowywane obrazy referencyjne. Następnie kliknij ikonę Start Test, a następnie Uruchom.Gdy histogram jąder na analizowanym obrazie zostanie wyświetlony, określ interwały intensywności dla faz G1, S i G2 oraz upewnij się, że są one wprowadzone w kolejnych etapach obiektu filtru w potoku oraz że te kroki są aktywne. Następnie kliknij ponownie przycisk Run, aby kontynuować drugą połowę pipeline. Spójrz na trzy zdjęcia z nakładkami reprezentującymi różne etapy cyklu komórkowego, G1, S lub G2, i wybierz jądra w G1 lub G2 do dalszego obrazowania, aby ilość DNA w parach zasad jąder obrazowych była znana.Przemieszczenie komórek na mikroskopie lokalizacyjnym pojedynczątkowej i zapewnienie prawidłowego mrugania procesu FPALM. Najpierw nagraj stos 3D wybranego jądra, używając tylko 500 klatek na fragment. Pozwala to określić względną ilość DNA w środkowej części ciała, które później jest obrazowane z wieloma ramkami, aby odsłonić jego ultrastrukturę.Rozpocznij akwizję serii zdjęć z czasem naświetlania 50 milisekund, co daje szybkostrzelność około 20 klatek na sekundę. Przeprowadź stos Z przez jądro z odstępami krokowymi 200 nanometrów i tylko 500 klatek na przekrój optyczny światła. Po pozyskaniu stosu wróć do początkowej pozycji z i pobierz główny zestaw danych 50 000 klatek z tym samym czasem ekspozycji wynoszącym 50 milisekund.Otwórz zbiór danych FPALM w ImageJ. Aby zoptymalizować ustawienia wykrywania sygnałów, kliknij ThunderSTORM, a następnie Uruchom analizę. Teraz wybierz ustawienie kamery.Wprowadź poprawny rozmiar pikseli danych obrazu, liczbę A/D, efektywność kwantową używanego aparatu, poziom bazowy i wzmocnienie elektromagnetyczne, a następnie kliknij OK. Wybierz algorytm do określenia współrzędnych lokalizacji, dopasowując sygnały. W sekcji filtrowania obrazów użyj filtra falkowego B-Spline z B-Spline rzędu 3 i skalą B-Spline 2. Następnie ustaw metodę przybliżonej lokalizacji cząsteczek na maksimum lokalne, ustaw próg maksymalnej intensywności szczytowej i łączność na ośmiokątne sąsiedztwo.W sekcji lokalizacji cząsteczek subpikselowych, jako metodę, wybierz zintegrowany Gaussian z PSF, ustaw promień dopasowania px na 3, wybierz metodę dopasowania jako maksymalne prawdopodobieństwo i ustaw początkową sigmę na 1,6. Następnie kliknij OK, aby rozpocząć wykrywanie sygnałów i rekonstrukcję obrazu. Jeśli akwizycja jest podzielona na różne stosy obrazów, połącz tabele lokalizacyjne w ThunderSTORM.Aby to zrobić, kliknij Import w oknie wyskakującym (pop-up). Upewnij się, że opcja Dodaj do bieżącej tabeli jest aktywowana oraz że użyto poprawnej liczby początkowej, aby uniknąć nadpisywania lokalizacji w tabeli. Następnie wybierz ścieżkę do pliku i kliknij OK, aby zaimportować jeden plik po drugim.Aby zapobiec nadmiernemu liczeniu sygnałów w kolejnych klatkach, połącz dane lokalizacyjne z maksymalną odległością 20 nanometrów, 1 maksymalną liczbą klatek niedostępnych i 0 maksymalnych klatek na cząsteczkę, a następnie kliknij Merge. Aby zmierzyć i skorygować dryf poprzez krzyżowe korelacje podsekcji danych, otwórz menu Korekcji dryfu i kliknij strzałki. Dodaj 3 pojemniki i ustaw powiększenie na 5.Następnie kliknij Apply, a pojawi się okno pokazujące dryf x i y. Aby określić ilość sygnału proporcjonalną do zawartości DNA w każdym przekroju wcześniej nagranego stosu 3D z 500 klatkami dla każdego fragmentu, wybierz Wtyczki, następnie ThunderSTORM, następnie Import/Eksport i importuj tabelę wyników dla pierwszego fragmentu stosu. Aby uniknąć nadmiernego liczenia sygnałów z innych planów obrazu stosu 3D, należy usunąć sygnały spoza 200-nanometrowego odstępu krokowego w z między fragmentami.Naciśnij histogram Plot i w otwartym dialogu Dystrybucja wybierz z i naciśnij OK. Określ pozycję piku i użyj pola filtra do wyboru sygnałów o optycznym kroku 200 nanometrów. Kliknij na Wizualizację i wybierz opcję Histogramów, a następnie OK. Zapisz powstały obraz w folderze w formacie TIFF. Otwórz wszystkie fragmenty i połącz je za pomocą Obrazu, następnie Stosów, a następnie Obrazów do stosu.Po zaznaczeniu całego obszaru obrazu przejdź do Analizuj, kliknij Narzędzia i wybierz Menedżera ROI. Kliknij Dodaj (Dodaj), następnie Analizuj, następnie Zestaw pomiarów i wybierz Zintegrowana gęstość. Teraz wybierz opcję Więcej, wybierz Wielokrotne miary, zaznaczy Mierz wszystkie stosy oraz Jeden wiersz na kawałek.Kliknij OK, a pojawią się wyniki. Suma intensywności wszystkich przekrojów jest proporcjonalna do zawartości DNA w całym jądrze, tak jak intensywności poszczególnych przekrojów są proporcjonalne do ich ułamku w całym genomie. Po otwarciu tabeli wyników płaszczyzny centralnej, która zawiera sygnały 50 000 klatek, przefiltruj ją do grubości 100 nanometrów.Stwórz histogram powstałych sygnałów, jak pokazano wcześniej, i zmierz całkowitą gęstość sekcji środkowej. Przekonwertuj dużą tabelę lokalizacji ThunderSTORM zawierającą informacje ultrastrukturalne z sekcji centralnej z formatu csv do formatu ORTE, uruchamiając skrypt MATLAB TS2orte. m, który przekształca tabelę lokalizacyjną w macierz MATLAB i zapisuje ją w formacie MAT.Wejdź do folderu LAND-voronoi, a w podfolderze coreAlgorithm otwórz zestaw plików voronoicluster. m oraz dostosowują zawartość DNA, ułamek obserwowanego centralnego przekroju całego ułamku jądra DNA oraz lokalizacje oraz współczynnik konwersji zgodnie z typem komórki i etapem cyklu komórkowego do obliczeń gęstości bezwzględnej. Edytuję skrypt, który rozpoczyna analizę voronoi.m.Dostosuj ścieżkę pliku do danych lokalizacji orte oraz folderu wyjściowego dla plików wyników. Określ współrzędne definiujące obszar, w którym należy wykonać tesselację. Zdefiniuj wiele obszarów do obliczeń w tym samym zbiorze danych wejściowych.Po uruchomieniu skryptu poszukaj obrazu pokazującego bezwzględne gęstości DNA wraz z innymi plikami zawierającymi wykresy pokazujące histogram rozkładu powierzchni oraz gęstości. m zawierającym gęstości każdej pojedynczej obliczonej komórki Voronoi w folderze wyjściowym. Pomiar FPALM, obejmujący 50 000 klatek, dał wykrycie lokalizacji w obrębie 100-nanometrowej grubości w obszarze środkowym o grubości 2,68 razy 100 razy 100 razy 100 000.Dokładność lokalizacji zrekonstruowanego obrazu wyniosła 10 nanometrów. Duża liczba lokalizacji umożliwiła połączenie obrazowania superrozdzielczości z pokazem absolutnej gęstości DNA. Było oczywiste, że zmierzone gęstości DNA nie były równomiernie rozłożone w całym jądrze i obejmowały szeroki zakres dynamiczny.Większe powiększenia obszarów w jądrze pokazujące większe komórki Voronoi wskazywały na niską gęstość DNA, podczas gdy mniejsze komórki wskazywały na wysoką gęstość DNA. Gęstość DNA mierzona w G1C3H10T półjądrze wykazała bezwzględny rozkład gęstości DNA w jądrze innego typu i gatunku. Chociaż podstawowa struktura przypominała wczesne jądro G1 HeLa, posiadała także skupiska paracentrycznej heterochromatyny.Nie zaobserwowano dramatycznych zmian architektonicznych w jądrze G2, mimo nieznacznie zwiększonego rozmiaru jądra. Jądro HeLa poddane TSA wykazywało znaczące różnice pod względem topografii jądrowej i gęstości DNA. Z wyjątkiem obwodowej heterochromatyny, która wykazywała wyspy o wyższej gęstości DNA, reszta chromatyny wyglądała znacznie bardziej jednorodnie i zdekondensowana.

mapping-absolute-dna-density-cell-nuclei-using-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Poznaj metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych przy użyciu teselacji Voronoia i mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki. Technika ta pozwala badać przestrzenne ograniczenia struktur chromatyny.

Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki

Przeglądaj więcej filmów