Name: Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemiczną analizy markerów proliferacji w blokach komórkowych zatopionych w parafinie. Technika ta zapewnia prostotę wykonania przy zachowaniu doskonałej morfologii próbek HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze dla K.-M.H. z National Cancer Center, Korea (1510121) i National Research Foundation, Korea (no. NRF-2015R1A2A2A04007432).

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).
1. Przygotowanie próbki (30 min)
<ol>
	<li>Do hodowli komórek HeLa (CCL-2, ATCC) należy użyć 10 ml kompletnej pożywki DMEM (10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% paciorkowca pen) w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Aby przygotować komórki HeLa pozbawione surowicy, inkubuj zlewające się komórki HeLa w DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej przez 48 godzin, jak opisano w poprzednim badaniu11.</li>
	<li>Aby odłączyć komórki, przemyj je 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny EDTA na 100 mm naczynie hodowlane. Następnie inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 5 ml kompletnej pożywki DMEM do naczynia hodowlanego, aby dezaktywować trypsynę, i przenieś oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml. Następnie odwiruj komórki o sile 300 x g przez 10 minut, aby uzyskać osad.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i przemyć osad dwukrotnie 2 ml zimnego PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu dodać 1 ml 95% etanolu do osadu komórkowego i wymieszać osad komórkowy z etanolem przez wirowanie. Utrzymuj utrwalone komórki na lodzie do czasu przygotowania bloku komórkowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bloku komórkowego (1 h 30 min)
<ol>
	<li>W celu przygotowania zamrożonych porcji osocza, należy pobrać osocze EDTA ze zdrowej krwi dawcy i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut. Zebrać osocze sklarowanego osadu i podwielokrotność po 200 - 400 μl do probówek do mikrodymki. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Gdy zamrożone porcje osocza są gotowe, pobrać je i rozmrozić osocze przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować utrwalone komórki o sile 700 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Wymieszaj osad komórkowy z 2 kroplami (około 200 μl) osocza, 2 kroplami tromboplastyny i 2 kroplami 0,025 M chlorku wapnia. Następnie wymieszaj je pipetując.</li>
	<li>Pozwól mieszaninie utworzyć skrzep komórkowy w temperaturze pokojowej przez 10 minut, jak pokazano na Rysunek 2A. Następnie przemyj skrzep komórkowy PBS dwa razy, wlewając i usuwając PBS za pomocą pipety. Reprezentatywny skrzep białych krwinek jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B.</li>
	<li>Zwilż kawałek bibuły filtracyjnej formaliną i owiń skrzep komórkowy wstępnie zwilżoną bibułą filtracyjną. Następnie umieść zakrzepłą mieszaninę za pomocą pincette w kasecie na tkanki, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 2C.</li>
	<li>Umieścić kasetę z tkankami w szklanym słoiku zawierającym 50 ml buforowanej formaliny (10% formaliny w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia formaliny.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek i osadzanie parafiny (w nocy)
<ol>
	<li>Załaduj na noc kasetę z tkankami zawierającą skrzep komórkowy utrwalony w formalinie do procesora tkanek, jak opisano wcześniej11. Przetwarzanie tkanek ma na celu usunięcie wody i kondycjonowanie utrwalonych komórek przed zatopieniem parafiny. W przypadku badań bez przetwarzania tkanek należy przeprowadzić procedurę przetwarzania tkanek zgodnie z ilustracją w Tabeli 1.</li>
	<li>Włącz podgrzewaną stację zatapiania, a 60 minut później sprawdź, czy w metalowej formie znajduje się stopiona parafina (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Weź uformowany skrzep komórkowy z kasety na tkanki i umieść go w stopionej parafinie w metalowej formie.</li>
	<li>Umieść nową kasetę na chusteczki bez pokrywki w metalowej formie zawierającej skrzep komórkowy w środku stopionej parafiny i wlej więcej stopionej parafiny do kasety na tkanki i na metalową formę. Następnie pozwól parafinie zestalić się na zimnej płycie przez 30 - 60 sekund.</li>
	<li>Oddziel kasetę na chusteczki higieniczne od metalowej formy. Następnie blok komórki parafinowej jest gotowy do immunocytochemii. Skrzep komórkowy osadzony w bloku komórkowym zatopionym w parafinie jest oznaczony strzałką w <silna klasa="xfig">Rysunek 2E.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatów do immunocytochemii (1 h)
<ol>
	<li>Sprawdzić obszar skrzepu komórkowego w bloku komórki parafinowej i pokroić blok komórki na plastry o grubości 3 - 4 μm za pomocą mikrotomu. Umieść skrawki parafiny na szkiełkach pokrytych silanem, jak pokazano na Rysunek 2F.</li>
	<li>Umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby sekcje przylegały do szkiełek.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia bloków komórkowych (6 h)
UWAGA: Do barwienia immunocytochemicznego na odcinkach bloku komórkowego można użyć różnych zestawów (zobacz Tabelę Materiałów). Wszystkie takie zestawy mają różną czułość i specyfikę w zależności od ich modyfikacji.
<ol>
	<li>Inkubować skrawki w 50 ml ksylenu przez 4 minuty w celu odparafinowania.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka w 100% etanolu przez 2 minuty w celu odwodnienia, a następnie dwa razy w 95% etanolu i w 80% etanolu przez 2 minuty. Następnie usuń etanol z bieżącej wody na 10 minut.</li>
	<li>W celu pobrania antygenu umieść szkiełka w słoiku zawierającym 40 ml buforu do pobierania Tris-EDTA, pH 9,0 i gotuj w szybkowarze przez 30 minut.</li>
	<li>Umyć szkiełka pod bieżącą wodą i inkubować je w 95% etanolu przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie zaznacz obszar barwienia komórek na szkiełkach pisakiem Pap, aby ułatwić identyfikację.</li>
	<li>Umyć szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej trisem zawierającej 0,2% Tween 20 (TBS-T) i inkubować w bloku nadtlenku wodoru (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć pozostałości aktywności peroksydazy. Następnie umyj szkiełka w TBS-T trzy razy po 2 minuty każde.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczony roztwór przeciwciała, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe w bloku białkowym (patrz tabela materiałów). Na przykład przeciwciało pierwszorzędowe CKAP2 można rozcieńczyć w stosunku 1:100, a przeciwciało Ki-67 w stosunku 1:500. Następnie inkubować szkiełka w 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po umyciu w TBS-T pięć razy przez 2 minuty każde, inkubować szkiełka w głównym wzmacniaczu przeciwciał w zestawie przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Po przemyciu w TBS-T czterokrotnie przez 2 minuty każde, dodać 2 krople polimeru HRP (przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową) i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Po pięciokrotnym umyciu w TBS-T przez 2 minuty każde, dodać 100 μl roztworu diaminobenzydyny (DAB) (patrz tabela materiałów) i inkubować szkiełka przez 3 minuty.</li>
	<li>Po dwukrotnym umyciu w TBS-T dodać 100 μl roztworu Hematoksyliny (mieszanina 100 μL Hematoksyliny i 600 μL wody destylowanej) i inkubować szkiełka przez 1 min.</li>
	<li>Po jednokrotnym umyciu szkiełek w TBS-T odwodnić się, inkubując w 95% etanolu przez 2 minuty, zanurzając raz w 95% etanolu i dwukrotnie zanurzając w 100% etanolu. Następnie inkubuj szkiełka w 40 ml ksylenu w szklanym słoiku przez 5 minut.</li>
	<li>Gdy szkiełka wyschną z ksylenu, zamontuj odpowiednie szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Obserwuj wzory barwienia za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>

<ol><li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419424">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/10/1703">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23299451">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4(2013).</li>
<li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li>
<li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li>
<li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+block+cytology%3A+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li>
<li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value%2C+feasibility%2C+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li>
<li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8390929">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li>
<li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein%2C+CKAP2%2C+with+microtubule-stabilizing+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li>
<li>Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+%28TMAP%29%2Fcytoskeleton+associated+protein+2+%28CKAP2%29+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li>
<li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CKAP2+%28cytoskeleton-associated+protein2%29+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107(2017).</li>
<li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients%3A+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li>
<li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li>
<li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining%3A+The+fluorescent+antibody+method%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Barwienie immunofluorescencyjne na utrwalonych hodowanych komórkach jest obecnie metodą z wyboru do oznaczania poziomu ekspresji białek w komórkach przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznej1. Jednak immunocytochemia na blokach komórkowych zatopionych w parafinie może być doskonałą alternatywą. Szczegółowe procedury przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie oraz immunocytochemii zostały opisane w niniejszym protokole i mamy nadzieję, że ułatwi on zastosowanie immunocytochemii w badaniach komórkowych.
Immunocytochemia ma kilka zalet w porównaniu z barwieniem immunofluorescencyjnym. Barwienie immunofluorescencyjne komórek zwykle wymaga świeżo wyhodowanych komórek, ale bloki komórek parafinowych można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka lat13. Ponadto immunocytochemia na blokach komórkowych może badać wewnątrzkomórkowe wzorce ekspresji, wykorzystując to samo przeciwciało, które jest używane w rutynowej immunohistochemii na tkankach ludzkich4. Co więcej, może badać zmiany w poziomach białek lub modyfikacje potranslacyjne poprzez wstępną inkubację komórek z różnymi lekami lub w różnych warunkach hodowli11.
W przeciwieństwie do zalet barwienia immunocytochemicznego, przygotowanie bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest czasochłonne i kosztowne14. Ponadto większość laboratoriów badawczych nie ma doświadczenia w tej technice, a błędy techniczne w takich okolicznościach są powszechne. Najczęstszymi błędami są słabe zachowanie morfologii komórek oraz słabe lub nieregularne barwienie immunocytochemiczne na skrawkach bloku komórkowego parafiny. Tych i większości innych można uniknąć, tworząc bloki komórkowe w najlepszych warunkach komórkowych i używając wystarczającej ilości roztworu do utworzenia skrzepów komórkowych.
Jako demonstrację obecnego protokołu, przygotowano bloki komórkowe dla komórek HeLa, a następnie przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne dla dwóch markerów proliferacji, CKAP2 i Ki-67, jak wcześniej informowano11. Do celów immunocytochemicznych manipulowano komórkami przez inkubację w pożywce z płodową surowicą bydlęcą i bez niej, i można było zaobserwować efekt głodu surowicy. Te przygotowane bloki komórkowe zatopione w parafinie mogą być stosowane do dużej liczby przeciwciał, ponieważ wiele szkiełek można przygotować z bloku komórkowego przy użyciu tylko sekcji bloku komórkowego o grubości 4 - 5 μm na szkiełko. W związku z tym wzorce ekspresji odpowiadające dwóm różnym warunkom można ocenić za pomocą kilku różnych przeciwciał. Wzorce barwienia immunologicznego dla CKAP2 i Ki-67 w tkankach nowotworowych zostały już opisane 9,10,11,12, a wyniki barwienia immunocytochemicznego można było łatwo ocenić, ponieważ wzorce barwienia były dość podobne do tych z immunohistochemii.
Podsumowując, barwienie immunocytochemiczne na blokach komórek parafinowych może być doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego; Co więcej, można go łatwo i niezawodnie wykorzystać w badaniach podstawowych do profilowania ekspresji w liniach komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznej.

W większości laboratoriów, bloki komórkowe z zatopioną parafiną nie są powszechnie używane. Raczej utrwalone komórki hodowlane, a nie komórki zanurzone w parafinie, są stosowane w badaniach lokalizacji subkomórkowej. W przypadku tych utrwalonych komórek hodowlanych zastosowano fluorescencję zamiast chromogenu. Dlatego barwienie immunofluorescencyjne jest obecnie metodą z wyboru do oznaczania poziomów ekspresji białek w badaniach z wykorzystaniem kultur komórkowych1. Preparaty przygotowane do barwienia immunofluorescencyjnego można jednak obserwować tylko pod mikroskopią immunofluorescencyjną, która może pokazywać obrazy zupełnie inne niż te wskazane pod mikroskopią płaską2. Dodatkowo, zachowanie szkiełek do barwienia immunofluorescencyjnego wymaga ochrony przed jasnym światłem, a sygnały fluorescencyjne stają się słabsze przy wielokrotnej ekspozycji do obrazowania z powodu utraty sygnału fluorescencyjnego3. Wyniki immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie są dość podobne do tych z immunohistochemii na tkankach osadzonych w parafinie4 i można je łatwo przełożyć na informacje kliniczne. Dlatego immunocytochemia może być doskonałą alternatywą. Jednak preparacja bloków komórkowych nie była popularna w podstawowych laboratoriach badawczych. W niniejszym protokole przewidziano zatem przygotowanie bloku komórkowego i barwienie immunocytochemiczne w celu promowania stosowania tej metody w dziedzinie badań nad kulturami komórkowymi.
Przygotowanie bloków komórkowych i immunocytochemia nie są unikalnymi metodami, a już zostały zastosowane od diagnozy klinicznej do badań podstawowych4,5. Chociaż opisano różne metody przygotowania bloków komórkowych4,6 metoda tromboplastyny plazmowej jest prosta, opłacalna i łatwa do dostosowania. W związku z tym, w protokole przedstawionym w tym artykule, metoda tromboplastyny-osocza4,5,6,7,8 jest używany do przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie.
W niniejszym badaniu zademonstrowano szczegółowe procedury przygotowania bloków komórek tromboplastynowo-plazmatycznych oraz metodę immunocytochemiczną wykorzystującą dwa markery proliferacji. Jednym z markerów jest białko 2 związane z cytoszkieletem (CKAP2), które zostało niedawno zgłoszone jako marker mitotyczny9,10,11; drugi to Ki-67, który jest najbardziej znanym markerem proliferacji12. Reprezentatywny schemat jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&nbsp; CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Ki-67</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethenol</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Agilent</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>zestaw detekcji LP TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>PBQ141209, LPB141209, LPH141210</td><td>Zestaw do immunocytochemii; zawiera blok białkowy</td></tr><tr><td>TintoRetriever Szybkowar</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corporation</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Tromboplastyna</td><td>Neoplastyna Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Retrival Bufor</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Płodu&nbsp; surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ultra vision blok nadtlenkowy H2O2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>Pap-Pen</td><td>Vector Laboratories</td> Bibuła filtracyjna <td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>PAA Laboratories</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>kaseta do przetwarzania tkanek</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Marienfeld</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>Glass Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Okap laminarny klasy II</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>1300 seria A2</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>Stacja do zatapiania parafiny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel w sekcji tkanek (okrągła)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td>Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd.</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Barwienie immunofluorescencyjne jest obecnie metodą z wyboru do określania poziomów ekspresji białek w systemach hodowli komórkowych, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół barwienia immunocytochemicznego na blokach komórkowych zatopionych w parafinie jest doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego na niezatopionych w parafinie komórkach stałych. W tym protokole przygotowano blok komórek parafinowych z komórek HeLa metodą tromboplastyny-osocza, a także przeprowadzono immunocytochemię w celu oceny dwóch markerów proliferacji, CKAP2 i Ki-67. Jądra i morfologia cytoplazmatyczna komórek HeLa były dobrze zachowane w szkiełkach bloków komórkowych. W tym samym czasie wzorce barwienia CKAP2 i Ki-67 w immunocytochemii były dość podobne do tych w barwieniu immunohistochemicznym w tkankach raka parafinowego. Dzięki zmodyfikowanym warunkom hodowli komórkowej, w tym wstępnej inkubacji komórek HeLa w warunkach wolnych od surowicy, efekt można ocenić przy jednoczesnym zachowaniu informacji architektonicznych. Podsumowując, immunocytochemia bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest doskonałą alternatywą dla barwienia immunofluorescencyjnego.

Na preparacie barwionym hematoksyliną i eozyną z bloku komórkowego zatopionego w parafinie (Rycina 3A,B), większość jąder i cytoplazmy komórek pozostała nienaruszona, co sugeruje, że zachowanie morfologiczne przy zastosowaniu obecnego protokołu jest doskonałe (Rycina 3A). W barwieniu immunocytochemicznym pozytywne barwienie CKAP2 zaobserwowano w skondensowanej chromatynie, wrzecionie mitotycznym i cytoplazmie (Rycina 4), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami10. Barwienie Ki-67 zaobserwowano w jądrach komórkowych, zgodnie z oczekiwaniami (Rycina 4). Tylko komórki z barwieniem CKAP2 w skondensowanej chromatynie (patrz strzałki na Rycynie 4A,B) były komórkami w fazie mitozy. Wiele komórek CKAP2-dodatnich wykazano w wysoce mitotycznych komórkach HeLa przygotowanych po inkubacji w medium kompletnym (Rycina 4A). W porównaniu z nimi, w komórkach HeLa poddanych głodzeniu surowiczym stwierdzono niewiele komórek CKAP2-dodatnich (Rycina 4B). Większość wysoce mitotycznych komórek HeLa była Ki-67-dodatnia (Rycina 4C). W przeciwieństwie do tego, odsetek komórek Ki-67-dodatnich w komórkach HeLa poddanych głodzeniu surowiczym pozostał wysoki i wynosił ~50% (Rycina 4D). Wyniki te są w pełni porównywalne z wynikami z poprzedniego raportu11, co sugeruje, że CKAP2 jest bardziej wiarygodnym markerem proliferacji w komórkach nowotworowych niż Ki-67.
W słabo przygotowanych blokach komórkowych jądra są oddzielone od cytoplazmy, co w konsekwencji prowadzi do słabego zachowania morfologii. Takie niekorzystne wyniki mogą być spowodowane zbyt długą inkubacją utrwalonych komórek w lodówce (powyżej jednej nocy). Innym istotnym problemem jest słabe barwienie komórek w metodzie immunocytochemicznej, mimo doskonałej morfologii. Problem ten pojawia się częściej, gdy skrzep komórkowy jest mały. Zazwyczaj intensywność barwienia jest nierównomierna, co pokazano na Rysunku 3B; jednak w przypadku większego skrzepu komórkowego ryzyko nierównomiernego barwienia jest znacznie mniejsze. Dlatego w niniejszym protokole zwiększyliśmy objętości osocza, tromboplastyny i chlorku wapnia, aby utworzyć duży skrzep komórkowy.
<img alt="Schemat procesu przekształcania osadu komórkowego w blok parafinowy; plazma, dodanie trombiny, przygotowanie preparatu HE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przygotowania bloku komórkowego. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces zatapiania tkanki; krok po kroku w probówce do wirowania, formie i na szkiełku; do analizy histologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Ilustracja przygotowania bloku komórkowego w parafinie. (A) Skrzep komórkowy z tromboplastyny i osocza w probówce. (B) Skrzep komórkowy TP po przemyciu w PBS. (C) Skrzep komórkowy na zwilżonym papierze filtracyjnym. (D) Stacja do zatapiania tkanek z roztopionym woskiem. Metalowa forma (strzałka) utrzymuje roztopiony wosk do czasu jego stężenia. (E) Skrzep komórkowy zatopiony w parafinie (strzałka) lub blok komórkowy w parafinie. (F) Cienki przekrój parafinowy w środkowej części powleczonego szkiełka. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne, obraz mikroskopowy; przekroje tkanek barwione do analizy komórkowej, 100μm vs 200μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie bloku komórkowego i potwierdzenie jakości za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemii. (A) Obraz komórek HeLa barwionych hematoksyliną i eozyną w przekroju bloku komórkowego zatopionego w parafinie. (B) Nieregularne barwienie Ki-67 w immunocytochemii na źle przygotowanym przekroju bloku komórkowego zatopionego w parafinie. Paski skali wynoszą (A) 100 i (B) 200 μm. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia komórek HeLa; markery CKAP2, Ki-67; schemat stanów mitotycznych i serum-głodzonych; analiza cyklu komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Barwienie immunocytochemiczne bloku komórkowego zatopionego w parafinie dla komórek HeLa. (A) Barwienie CKAP2 w warunkach wysokiej aktywności mitotycznej. (B) Barwienie CKAP2 w warunkach głodzenia surowiczego. (C) Barwienie Ki-67 w warunkach wysokiej aktywności mitotycznej. (D) Barwienie Ki-67 w warunkach głodzenia surowiczego. Przedstawiono paski skali 100 μm. Groty strzałek wskazują komórki CKAP2-dodatnie. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Procedura</td>
			<td>Kroki</td>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Czas/Temperatura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Odwodnienie</td>
			<td>1</td>
			<td>70% alkohol</td>
			<td>15 min/temp. pokojowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>80% alkohol</td>
			<td>15 min/temp. pokojowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>95% alkohol</td>
			<td>15 min/temp. pokoj.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>100% alkohol</td>
			<td>15 min/temp. pokojowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Przejaśnianie</td>
			<td>1</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>60 min/4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>10 min/temp. pokoj.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>10 min/temp. pokojowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Ksylen</td>
			<td>10 min/temp. pokoj.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*RT, temperatura pokojowa</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Procedura przetwarzania tkanek.

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza ekspresji markerów proliferacji będących przedmiotem zainteresowania za pomocą analiz immunocytochemicznych i histologicznych grudek tkanek osadzonych w bloku tromboplastyny-plazmy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie dotyczące klinicznej patologii blokowania komórek przez tkanki. Główną zaletą tej alternatywnej metody immunocytochemicznej analizy bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest techniczna prostota procedur.Gdy 100-milimetrowa pożywka z hodowlą komórkową HeLa osiągnie zbieg, zastąp supernatant 10 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych HeLa bez FBS i włóż szalkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 48 godzinach umyj komórki dwoma mililitrami PBS, a następnie inkubuj w dwóch mililitrach 0,25% EDTA plus trypsynę przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję z pięcioma mililitrami kompletnej pożywki i przenieś roztwór komórkowy do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie dwa przemycia w dwóch mililitrach zimnego PBS na pranie. Po drugim praniu zastąp supernatant jednym mililitrem 95% etanolu i wymieszaj granulkę przez wirowanie. Następnie umieść utrwalone komórki na lodzie.Aby przygotować blok komórek parafinowych, po pobraniu osocza EDTA ze zdrowej krwi dawcy, należy odwirować próbki i przenieść od 200 do 400 mikrolitrów porcji osocza supernatantu do pojedynczych probówek do mikrofuge. Następnie dodaj około 200 mikrolitrów osocza, około 200 mikrolitrów tromboplastyny i około 200 mikrolitrów 025 molowego chlorku wapnia do utrwalonych komórek HeLa. Pozwól mieszaninom uformować skrzepy komórkowe w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, a następnie umyj skrzepy dwa razy jednym mililitrem PBS, całkowicie dekantując skrzepy na pojedyncze kawałki bibuły filtracyjnej zwilżonej formaliną po drugim płukaniu.Zawiń skrzepy w bibułę filtracyjną i za pomocą zestawu szpilek umieść szmatki w indywidualnych kasetach na chusteczki pośrodku czterech innych kawałków papieru zwilżonego formaliną. Następnie umieść kasety z tkankami w szklanych słoikach zawierających 50 mililitrów buforowanej formaliny do utrwalenia formaliny przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka załaduj kasety do procesora tkanek w celu usunięcia wody przez noc i kondycjonowania komórek.Co najmniej godzinę przed zakończeniem procedury przetwarzania włącz podgrzewaną stację zatapiania, aby stopić parafinę. Gdy stacja zatapiania i skrzep są gotowe, potwierdź obecność stopionej parafiny w metalowej formie i przenieś uformowany skrzep komórkowy do parafiny. Umieść nową kasetę na chusteczki bez pokrywki w metalowej formie i przykryj kasetę większą ilością stopionej parafiny.Pozwól parafinie zestalić się na zimnej płycie przez 30 do 60 sekund. Następnie oddziel kasetę na chusteczki higieniczne od metalowej formy. Aby przygotować skrzepy do analizy immunocytochemicznej, zlokalizuj skrzep komórkowy w jednym bloku komórki parafinowej i za pomocą mikrotomu pokrój blok na plastry o grubości od trzech do czterech mikrometrów.Umieść skrawki parafiny na szkiełkach pokrytych solą fizjologiczną i umieść je w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Gdy skrawki przylegają do szkiełek, należy je odparafinować w 15 mililitrach ksylenu przez cztery minuty, a następnie odwodnić sekcje sekwencyjnymi dwuminutowymi inkubacjami etanolu w dół. Po inkubacji 80% etanolu płukać sekcje pod bieżącą wodą przez 10 minut i gotować szkiełka w słoiku zawierającym 40 mililitrów buforu do pobierania tris-EDTA przez 30 minut.Pod koniec inkubacji umyj szkiełka pobrane z antygenu pod bieżącą wodą, a następnie wykonaj 10-minutową inkubację w 95% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyschnięciu na powietrzu użyj pisaka hydrofobowego, aby otoczyć obszar barwienia komórek na każdym szkiełku. Umyj szkiełka w TBS-T, a następnie inkubuj w bloku nadtlenku wodoru przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki aktywności peroksydazy.Umyj szkiełka trzy razy w TBS-T przez dwie minuty każde mycie, a następnie oznacz skrawki 100 mikrolitrami mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych z interesującego Cię zestawu barwników immunocytochemicznych przez jedną godzinę, a następnie pięć dwuminutowych płukań TBS-T. Po ostatnim praniu inkubować szkiełka w pierwotnym wzmacniaczu przeciwciał z zestawu przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki czterokrotnie w TBS-T, dodając około 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego znakowanego peroksydazą chrzanową po ostatnim płukaniu przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.Przemyć wzmocnione sekcje pięć razy w świeżym TBS-T, a następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu diaminobenzydyny na sekcję przez trzy minuty. Umyj szkiełka dwa razy w TBS-T i oznacz skrawki 100 mikrolitrami roztworu hematoksyliny przez jedną minutę. Następnie umyj szkiełka jeszcze raz w TBS-T i inkubuj szkiełka w 95% etanolu przez dwie minuty, a następnie jedno zanurzenie w świeżym 95% etanolu i dwa zanurzenia w 100% etanolu.Inkubować odwodnione sekcje etanolu w 40 mililitrach ksylenu w szklanym słoiku przez pięć minut i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu. Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i obserwuj próbki pod mikroskopem świetlnym. Barwienie hematoksyliną i eozyną tkanki zatopionej w parafinie, jak właśnie wykazano, ujawnia głównie jądra taktu i cytoplazmę, co sugeruje doskonałe zachowanie morfologiczne próbek komórkowych tą metodą.Źle przygotowane bloki komórkowe wykazują jednak słabą morfologię i nieregularne znakowanie, nawet jeśli próbki są prawidłowo wybarwione. Białko dwa związane z cytoszkieletem jest zwykle obserwowane w skondensowanej chromatynie, wrzecionie mitotycznym i cytoplazmie. Tylko komórki z białkiem związanym z cytoszkieletem dwa barwiące się w skondensowanej chromatynie są komórkami mitotycznymi, podczas gdy niewiele białek związanych z cytoszkieletem dwóch dodatnich komórek znajduje się w populacji hodowli komórek HeLa pozbawionej surowicy.Większość wysoce mitotycznych komórek HeLa jest również Ki-67 dodatnia, a barwienie Ki-67 jest widoczne w jądrach komórkowych. Tylko około połowa wygłodzonych komórek HeLa w surowicy wyraża ten marker proliferacji. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o rozcieńczeniu komórek do odpowiedniej gęstości, aby uzyskać dobry skrzep. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inną metodę, taką jak analiza cytometryczna przepływowa stałych komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące fazy cyklu komórkowego podczas synchronizacji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do przyszłości w dziedzinie patologii wątroby, aby badać profilowanie ekspresji w linii komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznych w hodowanych komórkach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać immunocytochemię i przygotowywać bloki tromboplastyny osocza z hodowanych komórek. Nie zapominaj, że praca z niebezpiecznymi odczynnikami, takimi jak ksylen, może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

Ten film demonstruje metodę monitorowania zakażonego białka komórkowego 0, ICP0 w zakażeniu wirusem opryszczki pospolitej-1. Po syntezie de novo ICP0 przemieszcza się do jądra, a następnie przemieszcza się do cytoplazmy podczas progresji infekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia i analizuje subkomórkową lokalizację białka, oferując wgląd w jego transport w różnych fazach infekcji.

Technika immunofluorescencji lokalizacji białek wirusowych w zakażonych komórkach

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół generowania kontrolnych osadów komórkowych z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie dla immunohistochemii.

Standaryzowane przetwarzanie kontroli immunohistochemicznych osadów komórkowych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Wieloparametrowa immunohistochemia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny liczby, względnego rozmieszczenia i lokalizacji populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie tej techniki do analizy subpopulacji komórek T w raku jamy ustnej i gardła.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Poznaj metodę immunocytochemiczną analizy markerów proliferacji w blokach komórkowych zatopionych w parafinie. Technika ta zapewnia prostotę wykonania przy zachowaniu doskonałej morfologii próbek HeLa.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Przeglądaj więcej filmów