Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Ogólnym celem tej procedury jest analiza ekspresji markerów proliferacji będących przedmiotem zainteresowania za pomocą analiz immunocytochemicznych i histologicznych grudek tkanek osadzonych w bloku tromboplastyny-plazmy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie dotyczące klinicznej patologii blokowania komórek przez tkanki. Główną zaletą tej alternatywnej metody immunocytochemicznej analizy bloków komórkowych zatopionych w parafinie jest techniczna prostota procedur.

Gdy 100-milimetrowa pożywka z hodowlą komórkową HeLa osiągnie zbieg, zastąp supernatant 10 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych HeLa bez FBS i włóż szalkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 48 godzinach umyj komórki dwoma mililitrami PBS, a następnie inkubuj w dwóch mililitrach 0,25% EDTA plus trypsynę przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję z pięcioma mililitrami kompletnej pożywki i przenieś roztwór komórkowy do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie dwa przemycia w dwóch mililitrach zimnego PBS na pranie. Po drugim praniu zastąp supernatant jednym mililitrem 95% etanolu i wymieszaj granulkę przez wirowanie. Następnie umieść utrwalone komórki na lodzie.

Aby przygotować blok komórek parafinowych, po pobraniu osocza EDTA ze zdrowej krwi dawcy, należy odwirować próbki i przenieść od 200 do 400 mikrolitrów porcji osocza supernatantu do pojedynczych probówek do mikrofuge. Następnie dodaj około 200 mikrolitrów osocza, około 200 mikrolitrów tromboplastyny i około 200 mikrolitrów 025 molowego chlorku wapnia do utrwalonych komórek HeLa. Pozwól mieszaninom uformować skrzepy komórkowe w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, a następnie umyj skrzepy dwa razy jednym mililitrem PBS, całkowicie dekantując skrzepy na pojedyncze kawałki bibuły filtracyjnej zwilżonej formaliną po drugim płukaniu.

Zawiń skrzepy w bibułę filtracyjną i za pomocą zestawu szpilek umieść szmatki w indywidualnych kasetach na chusteczki pośrodku czterech innych kawałków papieru zwilżonego formaliną. Następnie umieść kasety z tkankami w szklanych słoikach zawierających 50 mililitrów buforowanej formaliny do utrwalenia formaliny przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka załaduj kasety do procesora tkanek w celu usunięcia wody przez noc i kondycjonowania komórek.

Co najmniej godzinę przed zakończeniem procedury przetwarzania włącz podgrzewaną stację zatapiania, aby stopić parafinę. Gdy stacja zatapiania i skrzep są gotowe, potwierdź obecność stopionej parafiny w metalowej formie i przenieś uformowany skrzep komórkowy do parafiny. Umieść nową kasetę na chusteczki bez pokrywki w metalowej formie i przykryj kasetę większą ilością stopionej parafiny.

Pozwól parafinie zestalić się na zimnej płycie przez 30 do 60 sekund. Następnie oddziel kasetę na chusteczki higieniczne od metalowej formy. Aby przygotować skrzepy do analizy immunocytochemicznej, zlokalizuj skrzep komórkowy w jednym bloku komórki parafinowej i za pomocą mikrotomu pokrój blok na plastry o grubości od trzech do czterech mikrometrów.

Umieść skrawki parafiny na szkiełkach pokrytych solą fizjologiczną i umieść je w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Gdy skrawki przylegają do szkiełek, należy je odparafinować w 15 mililitrach ksylenu przez cztery minuty, a następnie odwodnić sekcje sekwencyjnymi dwuminutowymi inkubacjami etanolu w dół. Po inkubacji 80% etanolu płukać sekcje pod bieżącą wodą przez 10 minut i gotować szkiełka w słoiku zawierającym 40 mililitrów buforu do pobierania tris-EDTA przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji umyj szkiełka pobrane z antygenu pod bieżącą wodą, a następnie wykonaj 10-minutową inkubację w 95% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyschnięciu na powietrzu użyj pisaka hydrofobowego, aby otoczyć obszar barwienia komórek na każdym szkiełku. Umyj szkiełka w TBS-T, a następnie inkubuj w bloku nadtlenku wodoru przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki aktywności peroksydazy.

Umyj szkiełka trzy razy w TBS-T przez dwie minuty każde mycie, a następnie oznacz skrawki 100 mikrolitrami mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych z interesującego Cię zestawu barwników immunocytochemicznych przez jedną godzinę, a następnie pięć dwuminutowych płukań TBS-T. Po ostatnim praniu inkubować szkiełka w pierwotnym wzmacniaczu przeciwciał z zestawu przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki czterokrotnie w TBS-T, dodając około 200 mikrolitrów przeciwciała wtórnego znakowanego peroksydazą chrzanową po ostatnim płukaniu przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.

Przemyć wzmocnione sekcje pięć razy w świeżym TBS-T, a następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu diaminobenzydyny na sekcję przez trzy minuty. Umyj szkiełka dwa razy w TBS-T i oznacz skrawki 100 mikrolitrami roztworu hematoksyliny przez jedną minutę. Następnie umyj szkiełka jeszcze raz w TBS-T i inkubuj szkiełka w 95% etanolu przez dwie minuty, a następnie jedno zanurzenie w świeżym 95% etanolu i dwa zanurzenia w 100% etanolu.

Inkubować odwodnione sekcje etanolu w 40 mililitrach ksylenu w szklanym słoiku przez pięć minut i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu. Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku podstawowym i obserwuj próbki pod mikroskopem świetlnym. Barwienie hematoksyliną i eozyną tkanki zatopionej w parafinie, jak właśnie wykazano, ujawnia głównie jądra taktu i cytoplazmę, co sugeruje doskonałe zachowanie morfologiczne próbek komórkowych tą metodą.

Źle przygotowane bloki komórkowe wykazują jednak słabą morfologię i nieregularne znakowanie, nawet jeśli próbki są prawidłowo wybarwione. Białko dwa związane z cytoszkieletem jest zwykle obserwowane w skondensowanej chromatynie, wrzecionie mitotycznym i cytoplazmie. Tylko komórki z białkiem związanym z cytoszkieletem dwa barwiące się w skondensowanej chromatynie są komórkami mitotycznymi, podczas gdy niewiele białek związanych z cytoszkieletem dwóch dodatnich komórek znajduje się w populacji hodowli komórek HeLa pozbawionej surowicy.

Większość wysoce mitotycznych komórek HeLa jest również Ki-67 dodatnia, a barwienie Ki-67 jest widoczne w jądrach komórkowych. Tylko około połowa wygłodzonych komórek HeLa w surowicy wyraża ten marker proliferacji. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o rozcieńczeniu komórek do odpowiedniej gęstości, aby uzyskać dobry skrzep. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inną metodę, taką jak analiza cytometryczna przepływowa stałych komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące fazy cyklu komórkowego podczas synchronizacji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do przyszłości w dziedzinie patologii wątroby, aby badać profilowanie ekspresji w linii komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu informacji morfologicznych w hodowanych komórkach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać immunocytochemię i przygotowywać bloki tromboplastyny osocza z hodowanych komórek. Nie zapominaj, że praca z niebezpiecznymi odczynnikami, takimi jak ksylen, może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.