Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

Metoda ta pozwoli nam wyizolować cząsteczki wirusa Epsteina-Barra z linii komórkowej P3HR1 i określić ilościowo zapas wirusa, aby można go było wykorzystać do różnych celów badawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia stosunkowo łatwą, niedrogą, szybką i niezawodną metodę przygotowania zapasu wirusa EB. Niezbędne cząstki wytwarzane tą techniką można wykorzystać w wielu modelach eksperymentalnych in vitro lub in vivo do diagnozowania EB.To rozpocząć, przygotować objętość zawiesiny komórkowej A w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, dostosować objętość tak, aby liczba komórek wynosiła około 2,2 miliona komórek na 100-milimetrową płytkę hodowlaną.

Dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej do probówki. Dodaj 80 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do probówki. Następnie dodaj do probówki 350 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr PMA.

Końcowe stężenie PMA powinno wynosić 35 nanogramów na mililitr, a DMSO powinno wynosić 0,08%Dodaj 4,27 mililitra pożywki hodowlanej, aby całkowita objętość wynosiła 10 mililitrów. Wymieszaj zawartość probówki, przechylając ją, a następnie przenieś zawartość na 100-milimetrową płytkę hodowlaną. Pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla.

Po pięciu dniach spędzonych w inkubatorze odwirować zawartość płytki o stężeniu 120 G przez osiem minut w celu osadzenia komórek. Zebrać bezkomórkowy wirus zawierający supernatant i wyrzucić osad komórkowy. Ponownie odwirować supernatant o sile 16 000 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia cząsteczek wirusa. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad wirusa w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej, poddzielić zawiesinę wirusa do 20 probówek, z których każda zawiera 250 mikrolitrów zawiesiny wirusa, i przechowywać zawiesinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby oddzielić białka od DNA, dodaj 500 mikrolitrów fenolu nasyconego Tris do jednej z probówek zawierających preparat wirusowy. Dodaj 100 mikrolitrów wody i dobrze wymieszaj, aby uzyskać różową emulsję. Wirować przez 15 minut przy 9 650 G, zebrać supernatant i przenieść go do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Dodać równowartość jednej dziesiątej objętości sklarowanego nad osadem zimnego octanu sodu i mieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie dodaj jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr glikogenu i wymieszaj pipetując. Dodaj trzykrotność objętości zimnego 100% etanolu i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.

Aby wyizolować wirusowe DNA, odwiruj w temperaturze 9 650 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant, aby uzyskać osad DNA i przemyć go trzykrotnie jednym mililitrem zimnego 70% etanolu. Ponownie odwirować przy 9,650 G przez 15 minut i wyrzucić supernatant.

Po wysuszeniu granulatu na powietrzu przez około 10 minut, ponownie zawiesić osad w 10 do 50 mikrolitrach wody destylowanej wolnej od nukleaz. Przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego przetwarzania lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić maksymalne rozpuszczenie DNA, a następnie przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu cokołu mikrospektrofotometru delikatną wycieraczką zadaniową należy załadować jeden mikrolitr przygotowanej próbki DNA i zanotować stężenie DNA w próbce.

Sprawdź współczynniki absorbancji zarówno przy 260 do 280 nanometrach, jak i od 260 do 230 nanometrach. DNA będzie absorbować w ciągu 260 nanometrów, białka w ciągu 280 nanometrów, a substancje organiczne, takie jak fenol, będą absorbować w ciągu 230 nanometrów. Stosunek 1,8 do 2 jest uważany za wystarczający do PCR w czasie rzeczywistym.

Aby przygotować mieszaniny reakcyjne PCR, umieść pięć mikrolitrów cyber zielonej mieszanki do PCR w czasie rzeczywistym w 0,2 mililitrowych probówkach PCR. Dodaj jeden mikrolitr 7,5 piko moli na mikrolitr startera do przodu i jeden mikrolitr 7,5 moli piko na mikrolitr odwróconego startera do każdej probówki. Tutaj amplifikowany jest mały gen EBV RNA 2.

Określenie liczby kopii genomu EBV. Następnie dodaj dwa mikrolitry wody wolnej od nukleaz i jeden mikrolitr wirusowego DNA do jednej z probówek. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 10 mikrolitrów.

Przygotuj inne probówki, które będą używane jako wzorce ze znanymi numerami kopii genomu EBV. Uruchom mieszaniny PCR, zaczynając od początkowego etapu aktywacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie 40 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund i w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez 30 sekund.

Wyeksportuj wszystkie arkusze danych jako pliki CSV i oblicz log liczby kopii genomu EBV na standardową probówkę i średnie wartości CQ. Wygeneruj krzywą standardową qPCR, wykreślając wartości CT wzorców w stosunku do logarytmu liczby kopii genomu. Wykorzystując równanie wykresu krzywej standardowej, wyprowadź liczbę kopii genomu EBV w probówce PCR zawierającej indukowane wirusowe DNA.

Na koniec użyj wzoru pokazanego na ekranie, aby obliczyć stężenie indukowanego preparatu wirusowego. Tutaj X to liczba kopii genomu EBV pochodzących z krzywej standardowej, a F to współczynnik rozcieńczenia używany do ustawiania DNA na reakcję PCR. Zliczanie komórek za pomocą komory hemocytometru pokazano tutaj.

Cztery ćwiartki są liczone za pomocą mikroskopu świetlnego. Tutaj komórki oznaczone na niebiesko powinny być policzone, podczas gdy komórki oznaczone na czerwono nie powinny być liczone, ponieważ dotykają górnej, prawej, dolnej lub lewej krawędzi kwadrantu. Przeprowadzono próbę optymalizacyjną w celu określenia stężeń PMA i dimetylosulfotlenku, które dałyby największą liczbę cząstek EBV.

Stężenie DMSO wynoszące 0,8% i stężenie PMA wynoszące 35 nanogramów na mikrolitr były optymalne i skutkowały wysokimi stężeniami EBV. Nasze laboratorium wykorzystało niezbędne cząstki wytwarzane tą techniką do zbadania pro autoimmunologicznych lub zapalnych odpowiedzi na tego wirusa. A także opracowanie nowych środków anty-EBV.