Name: Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę izolacji wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1 poprzez indukcję cyklu litycznego. Technika ta umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie zapasu wirusowego do badań in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy było wspierane przez granty dla ER z Asmar Research Fund, Libańskiej Narodowej Rady Badań Naukowych (L-CNRS) oraz Planu Praktyki Medycznej (MPP) na Amerykańskim Uniwersytecie w Bejrucie.

UWAGA: EBV należy uznać za materiał potencjalnie biologicznie niebezpieczny, w związku z czym należy z nim pracować w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższego. Należy nosić fartuch laboratoryjny oraz rękawiczki. W przypadku ryzyka kontaktu z rozpryskami należy również rozważyć zastosowanie ochrony oczu. Poniższą procedurę należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
1. Liczenie komórek P3HR1
<ol>
	<li>Wirowanie i resuspensja komórek
	<ol>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową z 100 mm płytki hodowlanej (lub kolby T-25) trwającej kultury komórek P3HR1 przy 80% konfluencji do 15 mL probówki stożkowej. Gęstość siewu komórek P3HR-1 wynosi 1 x 106 komórek/mL. Przechowywać w pełnej pożywce RPMI (79% pożywki RPMI, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% antybiotyku Pen-Strep) w temperaturze 37 °C i 5% CO2, pasażować co 3-4 dni.</li>
		<li>Wirować przez 8 min przy 120 x g. Po wirowaniu odrzucić supernatant, zresuspender osad komórkowy w 1 mL pełnej pożywki RPMI i dokładnie wymieszać (roztwór ten będzie określany jako zawiesina A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórkowej do liczenia
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczoną zawiesinę komórkową B, mieszając 2 µL zawiesiny komórkowej A z 8 µL pożywki hodowlanej. Do zawiesiny B dodać 10 µL 0,4% trypanu niebieskiego, aby otrzymać zawiesinę C. Przygotowanie dokładnie wymieszać poprzez delikatne pipetowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie komórek za pomocą hemocytometru
	<ol>
		<li>Położyć szklaną nakładkę na hemocytometr i nanieść 10 µL zawiesiny C. Umieścić hemocytometr pod mikroskopem świetlnym i policzyć liczbę komórek, które nie zostały zabarwione na niebiesko w każdym z czterech kwadrantów komory hemocytometru, używając obiektywu 40x (Rysunek 1).</li>
		<li>Trypan niebieski barwi martwe komórki na niebiesko; nie należy liczyć tych komórek ani komórek dotykających górnej, dolnej, prawej lub lewej krawędzi każdego kwadrantu hemocytometru.</li>
		<li>Obliczyć stężenie komórek na mL, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór na liczenie komórek; Całkowita liczba policzonych komórek × Współczynnik rozcieńczenia / 4×10⁻⁴; schemat równania." src="/files/ftp_upload/64279/64279eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Liczba policzonych kwadrantów wynosi cztery, a 10-4 mL to objętość pól w hemocytometrze. Cztery kwadranty, które należy policzyć, są zaznaczone na zielono na Rysunku 1. Całkowita liczba policzonych komórek we wzorze to suma liczby komórek w kwadrantach 1, 2, 3 i 4. Komórki zaznaczone na niebiesko na Rysunku 1 powinny być liczone, natomiast komórki zaznaczone na czerwono nie powinny być liczone, ponieważ dotykają one górnej, prawej, dolnej lub lewej krawędzi kwadrantu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wzór siatki Sudoku, rozkład przestrzenny, symulacja grafu, układ siatki, schemat analizy punktów danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64279/64279fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Liczenie komórek przy użyciu komory hemocytometru. Za pomocą mikroskopu świetlnego przelicza się cztery kwadranty; kwadranty te są zaznaczone kolorem zielonym. Całkowita liczba policzonych komórek w formule wskazanej w kroku 1.3.3 opisanego tutaj protokołu to suma liczby komórek w kwadrantach 1, 2, 3 i 4. Komórki zaznaczone na niebiesko powinny zostać policzone, natomiast komórki zaznaczone na czerwono nie powinny być liczone, ponieważ stykają się z górną, prawą, dolną lub lewą krawędzią kwadrantu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64279/64279fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Przygotowanie płytki do hodowli
<ol>
	<li>Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej A do stożkowatej probówki o pojemności 15 mL. Wymagana objętość zależy od liczby komórek. Dostosuj objętość tak, aby liczba komórek wynosiła około 2,2 x 106 komórek na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dodaj do probówki 5 mL kompletnej pożywki hodowlanej, a następnie przenieś zawartość probówki na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Dodaj na płytkę hodowlaną 80 µL dimetylosulfoksydu (DMSO). 
	UWAGA: DMSO jest światłoczuły, dlatego należy go przechowywać w naczyniu odpornym na światło lub osłaniać materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, np. folią aluminiową.</li>
	<li>Dodaj do probówki 350 µL phorbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) o stężeniu 1 mg/mL. Końcowe stężenie PMA powinno wynosić 35 ng/mL, a DMSO 0,08%. 
	OSTRZEŻENIE: PMA jest toksyczny, żrący i rakotwórczy, dlatego należy z nim obchodzić się z najwyższą ostrożnością. PMA jest światłoczuły, dlatego należy go przechowywać w naczyniu odpornym na światło lub osłaniać materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, np. folią aluminiową.</li>
	<li>Dodaj 4,27 mL pożywki hodowlanej, tak aby całkowita objętość wynosiła 10 mL. Wymieszaj zawartość probówki poprzez delikatne przechylanie, a następnie przenieś ją na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm. Pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 5 dni w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Indukcja i izolacja cząsteczek wirusa Epstein-Barra
<ol>
	<li>Po 5 dniach w inkubatorze odwiruj zawartość płytki przy 120 x g przez 8 min, aby odwirować komórki. Zbierz supernatant zawierający wirusy, pozbawiony komórek, a osad komórkowy odrzuć.</li>
	<li>Odwiruj supernatant przy 16,000 x g przez 90 min w temperaturze 4 °C, aby odwirować cząsteczki wirusa. Odrzuć supernatant i resuspenduj osad wirusowy w 5 mL pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Do resuspensji osadu wirusowego zamiast pożywki hodowlanej można użyć soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Rozdziel uzyskaną zawiesinę wirusową do 20 probówek, każda z nich powinna zawierać 250 µL zawiesiny wirusowej. Przechowuj zawiesinę w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja DNA z cząsteczek wirusowych
OSTRZEŻENIE: Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z fenolem, ponieważ jest on toksyczny i żrący i może powodować poważne oparzenia. Fenol jest światłoczuły i utlenia się w kontakcie ze światłem lub powietrzem. Należy przechowywać go w odpornym na światło pojemniku lub alternatywnie owinąć probówkę z fenolem nieprzeźroczystym materiałem, takim jak folia aluminiowa.
<ol>
	<li>Oddzielenie białek od DNA
	<ol>
		<li>Do jednej z probówek o objętości 250 µL dodać 500 µL fenolu nasyconego TrisCl. Dodać 100 µL wody (w celu zwiększenia objętości fazy wodnej) i dokładnie wymieszać w wortexie, aby uzyskać różową emulsję. Odwirować przez 15 min przy 9650 x g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie DNA
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant (przeźroczysta faza wodna) i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodać zimny octan sodu (3 M, pH 5.2) w ilości odpowiadającej 1/10 objętości supernatantu i wymieszać poprzez pipetowanie. Dodać 1 µL glikogenu o stężeniu 20 mg/mL i wymieszać poprzez pipetowanie. 
		UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale dodatek glikogenu zwiększa wydajność wytrącania DNA, a także ułatwia wizualizację osadu DNA.</li>
		<li>Dodać zimny 100% etanol w objętości trzykrotnie większej niż objętość supernatantu. Przechowywać w -80 °C przez noc. 
		UWAGA: Procedurę można w tym miejscu przerwać i wznowić w późniejszym czasie. Próbkę można przechowywać w -80 °C przez 1 h lub alternatywnie przez noc. Przechowywanie przez noc zwiększa wydajność wytrącania DNA, dlatego jest zalecane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja wirusowego DNA
	<ol>
		<li>Następnego dnia odwirować przy 9650 x g przez 15 min w 4 °C i odrzucić supernatant, aby otrzymać osad DNA.</li>
		<li>Przemyć osad trzykrotnie 1 mL zimnego 70% etanolu, odwirować przy 9650 x g przez 15 min i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Osad suszyć na powietrzu przez około 10 min. Resuspendować osad w 10-50 µL nukleazowo wolnej wody destylowanej (w zależności od wielkości osadu DNA).</li>
		<li>Próbki przechowywać w -20 °C do późniejszej obróbki lub w 4 °C przez noc, aby zapewnić maksymalne rozpuszczenie DNA, a następnie przechowywać w -20 °C. Alternatywnie można przejść bezpośrednio do kroku 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sprawdzanie stężenia i czystości DNA
<ol>
	<li>Po oczyszczeniu podstawki mikrospektrofotometru za pomocą delikatnej chusteczki do przecierania, nanieś 1 µL preparatu DNA.</li>
	<li>Odczytaj stężenie DNA w próbce. Sprawdź stosunki absorbancji dla <img alt="Wzór na stosunek czystości kwasów nukleinowych, 260nm/280nm, stosowany w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/64279/64279eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"> oraz <img alt="Stosunek spektroskopowy 260nm/230nm; pomiar absorbancji; schemat czystości kwasów nukleinowych." src="/files/ftp_upload/64279/64279eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3">. DNA absorbuje przy 260 nm, białka przy 280 nm, a substancje organiczne, takie jak fenol, absorbują przy 230 nm. Stosunek w zakresie 1,8-2 uznaje się za wystarczający dla techniki real-time PCR.</li>
</ol>
6. Ilościowe oznaczenie za pomocą polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszanin do reakcji PCR
	<ol>
		<li>Do probówek PCR o pojemności 0,2 mL należy nalać 5 µL mieszanki do real-time PCR SYBR green. Do każdej probówki dodać 1 µL startera forward o stężeniu 7,5 pmol/µL oraz 1 µL startera reverse o stężeniu 7,5 pmol/µL. Sekwencja startera forward: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; sekwencja startera reverse: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Genem amplifikowanym w celu oznaczenia liczby kopii genomu EBV jest gen Epstein-Barr virus small RNA 2 (EBER-2).</li>
		<li>Do jednej z probówek dodać 2 µL wody wolnej od nukleaz oraz 1 µL DNA wirusowego z kroku 4. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 10 µL. 
		UWAGA: W zależności od stężenia DNA w próbce może być konieczny etap rozcieńczenia. Należy zapisać czynnik rozcieńczenia F, który zostanie uwzględniony w formule w kroku 6.3.</li>
		<li>Przygotować pozostałe probówki, które będą służyć jako standardy o znanej liczbie kopii genomu EBV (1000, 2000, 5000, 10 000 i 54 000 kopii).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR, rozpoczynając od wstępnego etapu aktywacji w 95 °C przez 5 min, a następnie 40 cykli w 95 °C oraz 58 °C (przyłączanie) przez odpowiednio 15 s i 30 s.</li>
	<li>Wyznaczyć krzywą wzorcową qPCR, nanosząc wartości Ct standardów w funkcji logarytmu liczby kopii genomu EBV w probówce standardowej. Korzystając z równania wykresu krzywej wzorcowej, obliczyć liczbę kopii genomu EBV w probówce PCR zawierającej indukowane DNA wirusowe. Następnie użyć poniższej formuły, aby obliczyć stężenie indukowanego preparatu wirusowego: 
	<img alt="Formuła stężenia cząstek EBV; równanie dla resuspensji DNA, obliczenia laboratoryjne." src="/files/ftp_upload/64279/64279eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"> 
	Gdzie X jest liczbą kopii genomu EBV wyznaczoną z krzywej wzorcowej, a F jest czynnikiem rozcieńczenia zastosowanym podczas przygotowania DNA wykorzystywanego w jednej reakcji PCR.</li>
</ol>
7. Sprawdzanie aktywności biologicznej/zakaźności cząstek wirusa
<ol>
	<li>Przenieś komórki BC-3 z płytki hodowlanej 100 mm przy 80% konfluencji do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Gęstość siewu komórek P3HR-1 wynosi 1 x 106 komórek/mL. Hoduj w pełnym medium RPMI (79% medium RPMI, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% antybiotyku Pen-Strep) w temperaturze 37 °C i 5% CO2, dokonując pasażowania co 3-4 dni.</li>
	<li>Policz komórki BC-3 w ten sam sposób, w jaki liczono komórki P3HR-1 zgodnie z krokiem 1. Do płytki 96-dołkowej dodaj 105 komórek BC-3 do każdego dołka. Wykorzystaj trzy, sześć, dziewięć lub 12 dołków, aby zapewnić istotność wyników i zminimalizować błędy.</li>
	<li>Do każdego dołka dodaj objętość zapasu wirusa, zależną od stężenia preparatu wirusowego określonego w kroku 6.3. MOI może być zmienne, a optymalizacja tego protokołu pozwoli wyznaczyć najlepszy MOI dla infekcji (zalecany zakres MOI to 2-50). Upewnij się, że całkowita objętość mieszaniny w każdym dołku wynosi 250 µL.
	<ol>
		<li>Aby określić wymaganą objętość, należy znać stężenie zapasu wirusa i wybrać odpowiedni MOI. Na przykład, jeśli MOI wynosi 2, liczba dodanych cząstek wirusa powinna być dwukrotnością liczby komórek. Oblicz objętość V wymaganego zapasu wirusa, korzystając ze wzoru: <img alt="Równanie równowagi statycznej V=n/c; wzór matematyczny." src="/files/ftp_upload/64279/64279eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5">, gdzie n to liczba potrzebnych cząstek wirusa, a C to znane stężenie zapasu wirusa</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj zawartość płytki 96-dołkowej przez 5 dni. Po 5 dniach przenieś zawartość każdego dołka do probówki 1,5 mL.</li>
	<li>Wiruj probówki przy 120 x g przez 8 min, aby oddzielić komórki od medium hodowlanego zawierającego wirusa. Poddaj pellety komórkowe oraz nadsączniki ekstrakcji DNA, a następnie ilościowej analizie PCR w czasie rzeczywistym, aby sprawdzić obecność genomów wirusowych w każdej frakcji, oceniając tym samym zakaźność cząstek wirusowych.</li>
</ol>

<ol><li>Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+particles+in+cultured+lymphoblasts+from+Burkitt%27s+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma.</a> Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).</li>
<li>Sample, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+types+1+and+2+differ+in+their+EBNA-3A%2C+EBNA-3B%2C+and+EBNA-3C+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes.</a> Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).</li>
<li>Chang, M. S., Kim, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+in+human+malignancy%3A+a+special+reference+to+Epstein-Barr+virus+associated+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma.</a> Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).</li>
<li>Manet, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManet%2C+E+%22Encyclopedia+of+Cancer%22">Encyclopedia of Cancer</a>. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).</li>
<li>Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+persistence+in+memory+B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">EBV persistence in memory B cells in vivo.</a> Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).</li>
<li>Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+EBV+persistence+in+vivo+a+model+for+B+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis.</a> Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).</li>
<li>Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+gammaherpesviruses+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis.</a> Pathogens. 5 (1), 18(2016).</li>
<li>El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+malignancies%3A+roles+of+viral+oncoproteins+in+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 265(2018).</li>
<li>Vereide, D., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+evolution+of+lymphomas+induced+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus.</a> Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).</li>
<li>Vereide, D. T., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomas+differ+in+their+dependence+on+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus.</a> Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).</li>
<li>Houen, G., Trier, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+systemic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases.</a> Frontiers in Immunology. 11, 587380(2020).</li>
<li>Ortiz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Epstein-Barr+virus+infection+on+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Enfermedades+Digestivas%22%5BJournal%5D)">Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes.</a> Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).</li>
<li>Caplazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of rheumatoid arthritis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).</li>
<li>Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of inflammatory bowel diseases.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).</li>
<li>Warde, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+arthritis%3A+EBV+induces+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683(2011).</li>
<li>Jog, N. R., James, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein+Barr+virus+and+autoimmune+responses+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 623944(2020).</li>
<li>Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+propagation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+recombinants+in+EBV-negative+Akata+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells.</a> Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).</li>
<li>Hsu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+reactivation+in+Raji+cells+by+doxorubicin+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin.</a> Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).</li>
<li>Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+virus+enzymes+by+phorbol+esters+and+n-butyrate+in+Epstein-Barr+virus+genome-carrying+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells.</a> Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).</li>
<li>Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+transforming+EBV+from+non-producer+cells+after+superinfection+with+non-transforming+P3HR-1+EBV%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV.</a> International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).</li>
<li>Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+prototype+of+Epstein-Barr+virus+%28B95-8%29+is+also+a+lytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus.</a> International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).</li>
<li>Sairenji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+release+from+P3HR-1+and+B95-8+cell+lines+by+monoclonal+antibodies+to+EBV+membrane+antigen+gp350%2F220%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220.</a> Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).</li>
<li>Savage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+population+of+cotton-top+tamarins+%28Saguinus+oedipus%29+and+their+habitat+in+Colombia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia.</a> PLoS one. 11 (12), 0168324(2016).</li>
<li>Kallin, B., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+carried+by+raji+cells%3A+a+mutant+in+early+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions.</a> Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).</li>
<li>Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+transforming+EBV+from+non-producer+cells+after+superinfection+with+non-transforming+P3HR-1+EBV%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV.</a> International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).</li>
<li>Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Epstein-Barr+virus%2C+human+herpesvirus+6+%28HHV-6%29%2C+and+HHV-8+antiviral+drug+susceptibilities+by+use+of+real-time-PCR-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).</li>
<li>Buelow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+four+real-time+PCR+methods+for+the+quantitative+detection+of+Epstein-Barr+virus+from+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).</li>
<li>Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+nuclear+protein+2+%28EBNA2%29+binds+to+a+component+of+the+human+SNF-SWI+complex%2C+hSNF5%2FIni1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1.</a> Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA2-deleted+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+isolate%2C+P3HR1%2C+causes+Hodgkin-like+lymphomas+and+diffuse+large+B+cell+lymphomas+with+type+II+and+Wp-restricted+latency+types+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice.</a> PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Produkcja cząsteczek EBV jest niezbędna do zrozumienia biologii tego wirusa, a także związanych z nim chorób. Tutaj opisaliśmy produkcję tych cząstek z linii komórkowej P3HR-1. Ta linia komórkowa nie jest jedyną linią produkującą EBV; w rzeczywistości cząsteczki EBV zostały również wyizolowane z komórek B95-8 21,22, a także z linii komórkowej Raji18,19. Cykl lityczny EBV został indukowany w tych komórkach...

Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest pierwszym ludzkim wirusem nowotworowym, który został wyizolowany1. EBV, formalnie określany jako ludzki herpeswirus 4 (HHV-4)2, jest częścią podrodziny wirusa opryszczki gamma z rodziny wirusów opryszczki i jest prototypem rodzaju Lymphocryptovirus. Prawie 90-95% dorosłej populacji świata jest zarażona wirusem3. W większości przypadków początkowe zakażenie następuje w ciągu pierwszych 3 lat życia i przebiega bezobjawowo, jednak jeśli infekcja nastąpi później w okresie dojrzewania, może spowodować chorobę określaną jako mononukleoza zakaźna4. EBV jest w stanie zainfekować spoczynkowe limfocyty B, indukując je do proliferacyjnych limfoblastów B, w których wirus ustanawia i utrzymuje stan utajonego zakażenia5. EBV może się reaktywować w dowolnym momencie, prowadząc w ten sposób do nawracających infekcji6.
W ciągu ostatnich 50 lat, związek między niektórymi wirusami a rozwojem nowotworów złośliwych u ludzi stawał się coraz bardziej widoczny, a dziś szacuje się, że od 15% do 20% wszystkich nowotworów u ludzi jest związanych z infekcjami wirusowymi7. Wirusy opryszczki, w tym EBV, są jednymi z najlepiej przebadanych przykładów tego typu wirusów nowotworowych8. W rzeczywistości EBV może powodować wiele rodzajów nowotworów złośliwych u ludzi, takich jak chłoniak Burkitta (BL), chłoniak Hodgkina (HL), chłoniak rozlany z dużych komórek B i choroby limfoproliferacyjne u gospodarzy z obniżoną odpornością9,10. Wykazano również, że EBV jest związany z rozwojem ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych. Niektóre przykłady tych zaburzeń autoimmunologicznych to reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), zapalenie wielomięśniowe i skórno-mięśniowe (PM-DM), toczeń rumieniowaty układowy (SLE), mieszana choroba tkanki łącznej (MCTD) i zespół Sjögrena (SS)11. EBV jest również związany z rozwojem nieswoistego zapalenia jelit (IBD)12.
Wiele z tych chorób można badać lub modelować za pomocą hodowli komórkowych, myszy lub innych organizmów zainfekowanych EBV. Dlatego cząsteczki EBV są potrzebne do infekowania komórek lub organizmów, zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo13,14,15,16, stąd potrzeba opracowania techniki, która pozwoli na izolację cząstek wirusa przy niskich kosztach. Opisany tutaj protokół zawiera wytyczne dotyczące łatwego sposobu niezawodnego izolowania cząstek EBV ze stosunkowo dostępnej linii komórkowej i ilościowego oznaczania cząstek za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, który jest opłacalny i łatwo dostępny dla większości laboratoriów. Jest to porównanie z kilkoma innymi metodami, które zostały opisane w celu izolowania EBV z różnych linii komórkowych17,18,19,20.
P3HR-1 to linia komórkowa BL, która rośnie w zawiesinie i jest utajenie zakażona szczepem EBV typu 2. Ta linia komórkowa jest producentem EBV i może być indukowana do produkcji cząstek wirusa. Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody, która pozwala na izolację cząstek EBV z linii komórkowej P3HR-1, a następnie ilościowe określenie materiału wirusowego, które można później wykorzystać zarówno w modelach eksperymentalnych EBV in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Cienkościenne probówki PCR 0,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0620</td><td>Przed użyciem należy je sterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>0,2-10 i mikro; L Końcówki filtrów mikroobjętościowych</td><td>Corning</td><td>4807</td><td>Przed użyciem należy je sterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>0,5-10 i mikro; L Pipeta</td><td>BrandTech</td><td>704770</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Filtrowane końcówki do pipet</td><td>QSP</td><td>TF-112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Płytki do krojenia</td><td>Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>10-100 &micro; L Pipeta</td><td>BrandTech</td><td>704774</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Końcówki do pipet z filtrem</td><td>QSP</td><td>TF-108-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Termocykler C-1000 w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>184-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Amresco</td><td>0231</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od DNaz / RNaz</td><td>Zymo Research</td><td>W1001-1</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady EBER</td><td>Macrogen</td><td>N/A</td><td>Podkłady na zamówienie</td></tr><tr><td>Kontrola DNA EBV (standardy)</td><td>Vircell</td><td>MBC065</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (klasa odczynnika laboratoryjnego)</td><td>Fischer Chemical</td><td>E/0600DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Fresco 21 Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>10651805</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glikogenu</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>BOECO</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Costar (Corning)</td><td>3621</td><td>Przed użyciem należy poddać autoklawowaniu</td></tr><tr><td>P3HR-1 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-62</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna Rozwiązanie</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>VWR</td><td>20599.297</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Napełniacz do pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Pożywka</td><td>hodowlana Sigma</td><td>R7388</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Riedel-de Ha&euml; n (Honeywell)</td><td>25022</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotomer</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym</td><td>Thermo Scientific</td><td>4121</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i kwantyfikacja wirusa epsteina-barr z linii komórkowej p3hr1

Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line

Wirus Epsteina-Barr (EBV), formalnie oznaczony jako ludzki herpeswirus 4 (HHV-4), jest pierwszym wyizolowanym ludzkim wirusem nowotworowym. Prawie 90-95% dorosłej populacji świata jest zakażonych wirusem EBV. Dzięki niedawnym postępom w biologii molekularnej i immunologii, zastosowanie modeli eksperymentalnych zarówno in vitro, jak i in vivo dostarczyło głębokich i znaczących informacji na temat patogenezy EBV w wielu chorobach, a także na temat nowotworzenia związanego z EBV. Celem tego zwizualizowanego artykułu eksperymentalnego jest przedstawienie przeglądu izolacji cząstek wirusa EBV z komórek linii komórkowej P3HR1, a następnie ilościowe określenie preparatu wirusowego. Komórki P3HR1, pierwotnie wyizolowane z ludzkiego chłoniaka Burkitta, mogą wytwarzać wirusa P3HR1, który jest szczepem EBV typu 2. Cykl lityczny EBV może być indukowany w tych komórkach P3HR1 przez traktowanie 12-mirystynianianem 13-octanu forbolu (PMA), w wyniku czego powstają cząsteczki wirusa EBV.
Używając tego protokołu do izolacji cząsteczek EBV, komórki P3HR1 są hodowane przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w kompletnym pożywce RPMI-1640 zawierającej 35 ng/ml PMA. Następnie pożywkę hodowlaną odwirowuje się z prędkością 120 x g przez 8 minut w celu osadzenia komórek. Supernatant zawierający wirusa jest następnie zbierany i wirowany z prędkością 16 000 x g przez 90 minut w celu osadzenia cząstek EBV. Osad wirusowy jest następnie ponownie zawieszany w kompletnym pożywce RPMI-1640. Następnie przeprowadza się ekstrakcję DNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny stężenia cząstek EBV w preparacie.

Celem tej procedury jest wyizolowanie cząsteczek EBV w zawiesinie o znanym mianie wirusa, która może być następnie wykorzystana do modelowania infekcji EBV. Dlatego też niezwykle ważne jest zastosowanie optymalnych stężeń poszczególnych odczynników, aby uzyskać najwyższą wydajność EBV w ramach procedury.
Przeprowadzono próbę optymalizacyjną w celu wyznaczenia stężeń PMA oraz DMSO, które zapewnią najwyższą liczbę cząsteczek EBV (Rycina 2). Optymalne okazały się stę...

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

The Epstein-Barr virus (EBV), formally designated as Human herpesvirus 4 (HHV-4), is the first isolated human tumor virus. Nearly 90-95% of the ...

Metoda ta pozwoli nam wyizolować cząsteczki wirusa Epsteina-Barra z linii komórkowej P3HR1 i określić ilościowo zapas wirusa, aby można go było wykorzystać do różnych celów badawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia stosunkowo łatwą, niedrogą, szybką i niezawodną metodę przygotowania zapasu wirusa EB. Niezbędne cząstki wytwarzane tą techniką można wykorzystać w wielu modelach eksperymentalnych in vitro lub in vivo do diagnozowania EB.To rozpocząć, przygotować objętość zawiesiny komórkowej A w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, dostosować objętość tak, aby liczba komórek wynosiła około 2,2 miliona komórek na 100-milimetrową płytkę hodowlaną.Dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej do probówki. Dodaj 80 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do probówki. Następnie dodaj do probówki 350 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr PMA.Końcowe stężenie PMA powinno wynosić 35 nanogramów na mililitr, a DMSO powinno wynosić 0,08%Dodaj 4,27 mililitra pożywki hodowlanej, aby całkowita objętość wynosiła 10 mililitrów. Wymieszaj zawartość probówki, przechylając ją, a następnie przenieś zawartość na 100-milimetrową płytkę hodowlaną. Pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla.Po pięciu dniach spędzonych w inkubatorze odwirować zawartość płytki o stężeniu 120 G przez osiem minut w celu osadzenia komórek. Zebrać bezkomórkowy wirus zawierający supernatant i wyrzucić osad komórkowy. Ponownie odwirować supernatant o sile 16 000 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia cząsteczek wirusa. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad wirusa w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej, poddzielić zawiesinę wirusa do 20 probówek, z których każda zawiera 250 mikrolitrów zawiesiny wirusa, i przechowywać zawiesinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby oddzielić białka od DNA, dodaj 500 mikrolitrów fenolu nasyconego Tris do jednej z probówek zawierających preparat wirusowy. Dodaj 100 mikrolitrów wody i dobrze wymieszaj, aby uzyskać różową emulsję. Wirować przez 15 minut przy 9 650 G, zebrać supernatant i przenieść go do nowej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Dodać równowartość jednej dziesiątej objętości sklarowanego nad osadem zimnego octanu sodu i mieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie dodaj jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr glikogenu i wymieszaj pipetując. Dodaj trzykrotność objętości zimnego 100% etanolu i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.Aby wyizolować wirusowe DNA, odwiruj w temperaturze 9 650 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant, aby uzyskać osad DNA i przemyć go trzykrotnie jednym mililitrem zimnego 70% etanolu. Ponownie odwirować przy 9,650 G przez 15 minut i wyrzucić supernatant.Po wysuszeniu granulatu na powietrzu przez około 10 minut, ponownie zawiesić osad w 10 do 50 mikrolitrach wody destylowanej wolnej od nukleaz. Przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego przetwarzania lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić maksymalne rozpuszczenie DNA, a następnie przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu cokołu mikrospektrofotometru delikatną wycieraczką zadaniową należy załadować jeden mikrolitr przygotowanej próbki DNA i zanotować stężenie DNA w próbce.Sprawdź współczynniki absorbancji zarówno przy 260 do 280 nanometrach, jak i od 260 do 230 nanometrach. DNA będzie absorbować w ciągu 260 nanometrów, białka w ciągu 280 nanometrów, a substancje organiczne, takie jak fenol, będą absorbować w ciągu 230 nanometrów. Stosunek 1,8 do 2 jest uważany za wystarczający do PCR w czasie rzeczywistym.Aby przygotować mieszaniny reakcyjne PCR, umieść pięć mikrolitrów cyber zielonej mieszanki do PCR w czasie rzeczywistym w 0,2 mililitrowych probówkach PCR. Dodaj jeden mikrolitr 7,5 piko moli na mikrolitr startera do przodu i jeden mikrolitr 7,5 moli piko na mikrolitr odwróconego startera do każdej probówki. Tutaj amplifikowany jest mały gen EBV RNA 2.Określenie liczby kopii genomu EBV. Następnie dodaj dwa mikrolitry wody wolnej od nukleaz i jeden mikrolitr wirusowego DNA do jednej z probówek. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 10 mikrolitrów.Przygotuj inne probówki, które będą używane jako wzorce ze znanymi numerami kopii genomu EBV. Uruchom mieszaniny PCR, zaczynając od początkowego etapu aktywacji w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie 40 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund i w temperaturze 58 stopni Celsjusza przez 30 sekund.Wyeksportuj wszystkie arkusze danych jako pliki CSV i oblicz log liczby kopii genomu EBV na standardową probówkę i średnie wartości CQ. Wygeneruj krzywą standardową qPCR, wykreślając wartości CT wzorców w stosunku do logarytmu liczby kopii genomu. Wykorzystując równanie wykresu krzywej standardowej, wyprowadź liczbę kopii genomu EBV w probówce PCR zawierającej indukowane wirusowe DNA.Na koniec użyj wzoru pokazanego na ekranie, aby obliczyć stężenie indukowanego preparatu wirusowego. Tutaj X to liczba kopii genomu EBV pochodzących z krzywej standardowej, a F to współczynnik rozcieńczenia używany do ustawiania DNA na reakcję PCR. Zliczanie komórek za pomocą komory hemocytometru pokazano tutaj.Cztery ćwiartki są liczone za pomocą mikroskopu świetlnego. Tutaj komórki oznaczone na niebiesko powinny być policzone, podczas gdy komórki oznaczone na czerwono nie powinny być liczone, ponieważ dotykają górnej, prawej, dolnej lub lewej krawędzi kwadrantu. Przeprowadzono próbę optymalizacyjną w celu określenia stężeń PMA i dimetylosulfotlenku, które dałyby największą liczbę cząstek EBV.Stężenie DMSO wynoszące 0,8% i stężenie PMA wynoszące 35 nanogramów na mikrolitr były optymalne i skutkowały wysokimi stężeniami EBV. Nasze laboratorium wykorzystało niezbędne cząstki wytwarzane tą techniką do zbadania pro autoimmunologicznych lub zapalnych odpowiedzi na tego wirusa. A także opracowanie nowych środków anty-EBV.

isolation-quantification-epstein-barr-virus-from-p3hr1-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Opisana tutaj jest skuteczna metoda wytwarzania zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) o wysokim mianie w celu skutecznego infekowania komórek wątroby. Dzięki przedstawionej metodzie można zbierać zarówno bezotoczkowe, jak i otoczkowe cząstki wirusa i wykorzystywać je do inokulacji różnych linii komórkowych.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Poznaj metodę izolacji wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1 poprzez indukcję cyklu litycznego. Technika ta umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie zapasu wirusowego do badań in vitro i in vivo.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

Przeglądaj więcej filmów