Name: Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Odkryj mechanizmy toksyn tworzących pory w komórkach Leishmania major. Ta metoda umożliwia badanie cytotoksyczności i szlaków sygnałowych naprawy błon komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratoriów Keyela i Zhanga za ich krytyczną recenzję manuskryptu. Autorzy dziękują College of Arts and Sciences Microscopy za korzystanie z urządzeń.

<ol><li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins%3A+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531(2020).</li>
<li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li>
<li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li>
<li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li>
<li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li>
<li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li>
<li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136(2014).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%29%28%2B%29-dependent+repair+of+pneumolysin+pores%3A+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li>
<li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li>
<li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li>
<li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li>
<li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Signal+Transduction%22%5BJournal%5D)">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968(2011).</li>
<li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li>
<li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential%2C+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biochemistry+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li>
<li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li>
<li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095(2017).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602(2019).</li>
<li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227(2012).</li>
<li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li>
<li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li>
<li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death & Disease. 10 (4), 326(2019).</li>
</ol>

Praca ta była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia grant R21AI156225 dla PAK i KZ (co-I) oraz R01AI139198 dla KZ (co-I). CH pragnie podziękować Wydziałowi Nauk Biologicznych za asystenturę dydaktyczną świadczoną w czasie tego badania.
Agencje finansujące nie odegrały żadnej roli w opracowaniu badania; w gromadzeniu, analizie lub interpretacji danych; w pisaniu rękopisu; ani w decyzji o publikacji wyników. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agencji finansujących. Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą konfliktów interesów.

W niniejszej pracy opisano metody badania mechanizmów molekularnych i funkcji PFT, wykorzystując ludzki patogen Leishmania major jako system modelowy. Opracowano średnioprzepustowy test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru żywotności pojedynczych komórek. Żywotność jest ilościowa na poziomie populacji, ponieważ wartości LC50 można obliczyć na podstawie krzywej dawka-odpowiedź przy użyciu modelowania logistycznego. Jako dowód słuszności zasady, zastosowano test cytometrii przep...

Toksyny tworzące pory (PFT) to największa rodzina toksyn bakteryjnych1, ale mechanizmy, za pomocą których perforują i niszczą komórki, są słabo poznane. Najlepiej zbadaną rodziną toksyn tworzących pory są cytolizyny zależne od cholesterolu (CDC). CDC są głównie syntetyzowane przez bakterie Gram-dodatnie, w tym czynnik wywołujący martwicze zapalenie powięzi, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes wydziela streptolizynę O (SLO) CDC, która wiąże się ze sterolami w błonie komórkowej komórek gospodarza w postaci monomerów, oligomeryzów i wprowadza pory ~20-30 nm do błony1. Rola, jaką lipidy odgrywają w tym procesie, pozostaje słabo określona.
Jednym z podejść do badania interakcji lipid-CDC jest użycie chemicznie zdefiniowanych liposomów. Podczas gdy zdefiniowane liposomy dostarczają informacji o niezbędnych progach lipidów do podtrzymania wiązania toksyn i tworzenia porów3,4, nie podsumowują one w pełni funkcji komórkowych. Na przykład odtworzone liposomy nie mają asymetrii lipidowej gospodarzy ssaków i modyfikacji lipidów w odpowiedzi na toksyny5. Jedną z alternatyw dla liposomów jest użycie linii komórkowych ssaków. Chociaż te linie komórkowe są bardziej istotne fizjologicznie, istnieje duży stopień redundancji w mechanizmach wykrywania toksyn i oporności2. W związku z tym szlaki naprawcze wykorzystywane do opierania się CDC pozostają słabo określone. Warto zauważyć, że napływ Ca2+ jest głównym aktywatorem naprawy błony1. Za napływem Ca2+ zaangażowanych jest wiele ścieżek, w tym naprawa zależna od ceramidów6,7 i ścieżka naprawy zależna od MEK6. Szlaki te oddziałują z innymi efektorami białkowymi, w tym z endosomalnym kompleksem sortującym wymaganym do transportu (ESCRT)8 i annexins6,9,10. Analiza tych szlaków w komórkach ssaków jest trudna ze względu na redundancję, która utrudnia interpretację danych.
Jednym ze sposobów na zrównoważenie złożoności i prostoty w analizowaniu ścieżek naprawczych jest użycie prostszych organizmów, takich jak patogeny pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Leishmania sp. powoduje leiszmaniozę u ludzi i innych zwierząt. Leiszmanioza waha się od leiszmaniozy skórnej (samoograniczające się zmiany skórne) do śmiertelnej leiszmaniozy trzewnej (hepatosplenomegalia), w zależności od gatunku i innych czynników11. Leishmania major, czynnik wywołujący leiszmaniozę skórną, jest przenoszony na ludzi za pośrednictwem wektora muchy piaskowej i jest używany do zrozumienia funkcji Leishmania i infekcji12. Ponadto Leishmania sp. są digenic12. Występują jako wewnątrzkomórkowe pasożyty makrofagów ssaków określane jako amastigoty oraz jako swobodnie pływające, wiciowate promastigoty w muszkach piaskowych12. L. major promastigotes mogą być hodowane w pożywkach wzbogaconych surowicą, takich jak M199 do wysokiej gęstości13. Promastigoty są również genetycznie podatne; Istnieje wiele nokautów genów, w tym te ukierunkowane na szlaki biosyntezy lipidów<klasa SUP="xref">13. Te nokauty mogą być oceniane pod kątem wzrostu i różnic w zakaźności i rozwoju zmian poprzez zakażenie myszy Balb/c13.
Oprócz względnej łatwości hodowli Leishmania i zakresu nokautów biosyntezy lipidów, pasożyt ma prostszy genom niż ssaki. Najlepiej scharakteryzowanym gatunkiem Leishmania jest L. major, który ma wiele istniejących narzędzi genetycznych, takich jak mutanty z wadliwym metabolizmem lipidów14. Warto zauważyć, że wiele białek naprawczych jest nieobecnych. L. major nie ma dotychczas zidentyfikowanych homologów dla kluczowych białek naprawczych ssaków, takich jak aneksyny. Umożliwia to scharakteryzowanie ewolucyjnie zachowanych ścieżek naprawczych bez złożoności systemów ssaków. Jednak do tej pory nie scharakteryzowano ścieżek naprawczych w Leishmania. W tym samym czasie kluczowe szlaki sygnałowe zaangażowane w naprawę, takie jak ścieżka MEK6, są zachowane w Leishmania sp.15,16, chociaż homologi muszą zostać zweryfikowane. Szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) jest dobrze zbadany u L. mexicana, gdzie przyczynia się do wewnątrzkomórkowego przeżycia i termostabilności w komórkach ssaków oraz kontroluje metacyklogenezę16. W Leishmania sp. scharakteryzowano 10 z 15 MAPKs17. Przewiduje się, że LmMAPK9 i LmMAPK13 będą najbardziej podobne do ERK1/2 ssaków na podstawie tożsamości w konserwatywnej sekwencji warg fosforylacji. Sekwencja warg fosforylacji jest TEY zarówno dla ssaków ERK1/2, jak i LmMAPK9 i LmMAPK13. Jednak osiem z MAPK Leishmania ma motyw fosforylacji TDY15. Co najmniej dwa homologi MEK zostały zidentyfikowane w Leishmania sp., LmxMKK18 i kinazie pokrewnej MEKK (MRK1)19. Sugeruje to, że spostrzeżenia zidentyfikowane w Leishmania mogą przekładać się na systemy ssaków. Tam, gdzie nie przekładają się one na systemy ssaków, stanowią cele terapeutyczne w leczeniu leiszmaniozy.
Aby wykorzystać promastigoty L. major do badania naprawy błon i interakcji z toksynami, potrzebne są techniki o średniej przepustowości. Chociaż obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości umożliwia wizualizację znakowanych białek i błon w czasie rzeczywistym, ma niską przepustowość i może nie mierzyć przeżycia komórek. Średnioprzepustowe testy żywotności obejmują wychwyt barwnika mierzony za pomocą cytometrii przepływowej, pomiar aktywności mitochondriów lub uwalnianie białek komórkowych, takich jak dehydrogenaza mleczanowa (LDH). W komórkach ssaków testy LDH nie mierzą ilościowo śmierci komórki20. Co więcej, testy populacyjne, takie jak uwalnianie LDH lub aktywność mitochondriów, nie pozwalają na solidną analizę jednokomórkową lub wieloparametryczną20. Natomiast testy oparte na cytometrii przepływowej umożliwiają wieloparametryczną analizę pojedynczych komórek20. Jednak testy te nie zostały zastosowane do zrozumienia biologii toksyn lub reakcji na toksyny u promastigotów L. major.
W tym badaniu, SLO jest używane jako narzędzie do zrozumienia perturbacji błony plazmatycznej sfingolipidowego mutanta zerowego L. major w dwóch różnych - pożywka M199 rutynowo używana do hodowli L. major promastigotes i prostszy bufor Tyrode. Opisano test cytometrii przepływowej o średniej przepustowości, który jest stosowany do generowania krzywych dawka-odpowiedź toksyny. Dane z testu cytometrii przepływowej są modelowane do krzywej logistycznej w celu określenia wartości LC50. Dzięki tym informacjom można określić sublityczną dawkę SLO, aby można było zwalidować przeciwciała MAPK za pomocą western blot.

<table><tbody><tr><td>1,2 ml probówki do mikromiareczkowania (Marsh)</td><td>Fisher</td><td>02-681-376</td><td>Test cytotoksyczności</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Rozcieńczenia toksyn</td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa&nbsp;</td><td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td><td>89039-666</td><td>Do przechowywania komórek i pożywek</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399</td><td>Do przetwarzania komórek</td></tr><tr><td>3% H2O2&nbsp;</td><td>Walmart&nbsp; (Fayetteville, AR)</td><td>Nie dotyczy</td><td>dla ECL</td></tr><tr><td>5x M199</td><td>Cell-gro</td><td>11150067</td><td>Podstawowa pożywka wzrostowa dla L. major promastigoty</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Baker</td><td></td><td>Do hodowli komórek w sterylnych warunkach</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605-100</td><td>Frakcja V dopuszczalna czystość</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510-100</td><td>Stężenie zapasów 100 mM</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Do granulowania komórek z hodowli</td></tr><tr><td>Cy5 Pakiet barwników monoreaktywnych</td><td>Cytiva (Marlborough, MA)</td><td>PA25031</td><td>Etykieta fluoroforowa dla toksyn</td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha kąpiel</td><td>Benchmark</td><td>BSH1002</td><td>Do denaturacji próbek białek</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-100G</td><td>Stężenie zapasów 0,5 M</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft (Redmond, VA)</td><td></td><td>Analiza danych oprogramowanie</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy (4-laserowy Attune NxT)Cytometr</td> <td>Fisher</td><td></td><td>do akwizycji danych</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD (Ashland, OR)</td><td></td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>Utrwalacz do liczenia komórek</td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>BP673-1</td><td>Środek selekcyjny do komórek</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td>Rozcieńczony 1:4 do czyszczenia cytometru</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher</td><td>0267151B</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Ludzkie krwinki czerwone</td><td>Zen-bio (Durham, NC)</td><td>SER-10MLRBC</td><td>Aby potwierdzić aktywność toksyny Wiadro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>na lód</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 55i</td><td>Do wizualizacji komórek</td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Fisher</td><td>88018</td><td>Do sondowania białka za pośrednictwem przeciwciał</td></tr><tr><td>Pipetory i końcówki</td><td>Avantor VWR</td><td></td><td>Do dozowania odczynników</td></tr><tr><td>Zasilanie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Do uruchamiania SDS-PAGE i transferów</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Biotium</td><td>40016</td><td>Stężenie zapasowe 2 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td>Do oznaczania masy cząsteczkowej białek</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Running Aparatura (Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-3302</td><td>Do rozdzielania białek na podstawie ich wielkości</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca</td><td>R& D</td><td>DY992</td><td>Do uszczelniania płytek z komórkami</td></tr><tr><td>Streptolizyna O C530A wstawka</td><td></td><td></td> plazmidowa <td>Sklonowana do wektora pBAD-gIII (Odniesienie: 7)</td></tr><tr><td>Streptolizyna Toksyna O C530A</td><td>Laboratoryjnie oczyszczona</td><td></td><td>Aktywność specyficzna&nbsp; 4,34 x 105 HU/mg</td></tr><tr><td>Wahliwy wirnik kubełkowy</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>75003607</td><td>Do odwirowania komórek Płytka</td></tr><tr><td>V z dnem</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651206</td><td>Do oznaczania cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Benchmark</td><td>BV1000</td><td>Do mieszania komórek</td></tr><tr><td>System obrazowania Western blot (Chemi-doc)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Do wizualizacji białek za pomocą Western Blot</td></tr><tr><td>Aparat do przenoszenia Western Blot (Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3930</td><td>Transfer białka do nitrocelulozy</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-700</td><td>Stosowana w przenoszeniu białek do nitrocelulozy</td></tr><tr><td>przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>Kot# 9102S</td><td>Królik (rozcieńczenie 1:1000)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-lipofosfoglikan (LPG)</td><td>CreativeBioLabs&nbsp;</td>Mysz <td>Cat# WIC79.3</td><td>(1: 1000)</td></tr><tr>Technologie sygnalizacji komórkowej <td>przeciwciała anty-MEK</td><td>&nbsp;</td><td>Kot# 9122L</td><td>Królik (1:1000)</td></tr><tr><td>Anty-mysi IgG, koniugat HRP</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Kot#715-035-151</td><td>Osioł (1:10000)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosphoERK</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>Kot# 9101S</td><td>Królik (1:1000)</td></tr><tr>Technologie sygnalizacji komórkowej <td>przeciwciała anty-pMEK</td><td>&nbsp;</td><td>Kot# 9121S</td><td>Królik (1:1000)</td></tr><tr><td>Anty-królicze IgG, koniugat HRP</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Kot#711-035-152</td><td>Osioł (1:10000)</td></tr><tr><td>Przeciwciało antytubulinowe</td><td>Sigma</td><td>Cat# T5168</td><td>Mysz (1: 2000)</td></tr><tr><td>Leishmania major Genotypy&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Odniesienie: 13</td></tr><tr><td>Addback episomalny (spt2-/+SPT2)</td><td></td><td></td><td>&Delta; spt2::HYG/&Delta; spt2: PAC/+pXG-SPT2</td></tr><tr><td>Podjednostka 2 palmitoilotransferazy serynowej nokaut (spt2-)</td><td></td><td></td><td>&Delta; spt2::HYG/&Delta; spt2::P AC&nbsp;</td></tr><tr><td>Typ dziki (WT)</td><td></td><td></td><td>LV39 klon 5 (Rho/SU/59/P)</td></tr></tbody></table>

rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą leishmania major

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

Zrozumienie funkcji i mechanizmu toksyn tworzących pory (PFT) jest trudne, ponieważ komórki są odporne na uszkodzenia błony spowodowane przez PFT. Podczas gdy podejścia biofizyczne pomagają zrozumieć tworzenie się porów, często opierają się na podejściach redukcjonistycznych, w których brakuje pełnego zestawu lipidów i białek błonowych. Hodowane komórki ludzkie stanowią alternatywny system, ale ich złożoność i redundancja mechanizmów naprawczych utrudniają identyfikację konkretnych mechanizmów. Natomiast ludzki patogen pierwotniaka odpowiedzialny za leiszmaniozę skórną, Leishmania major, zapewnia optymalną równowagę między złożonością a znaczeniem fizjologicznym. L. major jest genetycznie podatny i może być hodowany do dużej gęstości in vitro, a każdy wpływ zaburzeń na infekcję można zmierzyć w ustalonych modelach mysich. Ponadto L. major syntetyzuje lipidy odmienne od ich ssaczych odpowiedników, co może zmieniać dynamikę błony. Te zmiany w dynamice błony można badać za pomocą PFT z najlepiej scharakteryzowanej rodziny toksyn, cytolizyn zależnych od cholesterolu (CDC). CDC wiążą się z ergosterolem w błonie Leishmania i mogą zabijać promastigoty L. major, co wskazuje, że L. major jest odpowiednim systemem modelowym do określania komórkowych i molekularnych mechanizmów funkcji PFT. W pracy opisano metody badania funkcji PFT u promastigotów L. major, w tym hodowlę pasożytów, narzędzia genetyczne do oceny podatności lipidów, testy wiązania błony i testy śmierci komórki. Testy te umożliwią szybkie wykorzystanie L. major jako potężnego systemu modelowego do zrozumienia funkcji PFT w szeregu ewolucyjnie zróżnicowanych organizmów i podobieństw w organizacji lipidów.

Zwiększona wrażliwość promastigot na SLO w buforze Tyroide'a w porównaniu do M199 
Wrażliwość promastigot L. major na SLO porównano w różnych buforach do analizy. Promastigoty typu dzikiego, spt2- oraz spt2-/+SPT2 poddano działaniu SLO w bezserwatkowym M199 lub buforze Tyroide'a uzupełnionym o 2 mM CaCl2 przez 30 min przed analizą za pomocą cytometru przepływowego. Jako odpowiednie do analizy pasożyty zidentyfikowano pojedyncze komórki na pod...

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

Mechanizm odporności na toksyny tworzące pory jest słabo poznany. Nasz protokół umożliwia funkcjonowanie i mechanizm tworzenia porów toksyn za pomocą Leishmania major, genetycznie wykonalnego i fizjologicznie istotnego systemu. Główną zaletą testu cytotoksyczności jest porównanie żywotności wielu fenotypów komórek na poziomie pojedynczej komórki w teście średnioprzepustowym w przypadku narażenia na toksyny w czasie rzeczywistym.Leki zaburzające błonę śluzową, takie jak amfoterycyna B, są terapiami pierwszego rzutu w leczeniu Leishmania. Test ten umożliwia identyfikację czynników, które nasilają działanie amfoterycyny B i/lub nowych środków uszkadzających błony. Test ten zapewnia wgląd w takie obszary, jak reakcja naprawcza i szlaki sygnałowe związane z reakcjami naprawczymi.Ten test można zastosować do pierwotniaków, takich jak Trypanosoma i Naegleria fowleri. Ludzie mają trudności ze zrozumieniem serii seryjnych rozcieńczeń toksyn. Tak więc najlepszą radą, jaką mogę dać, jest narysowanie schematu serii rozcieńczeń szeregowych przed rozpoczęciem eksperymentu.Na początek zarezerwuj 0,5 mililitra przetworzonych promastigotów w osobnej tubie jako niebarwioną kontrolę. Dodaj dwa miligramy na mililitr jodku propidyny lub PI do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr do pozostałych promastigotów. Wiruj przez trzy sekundy.Dodaj przetworzone promastigoty do każdego dołka z dnem w kształcie litery V, 96-dołkowej płytki lub probówek Marsh i umieść stojak na płytki lub probówki na lodzie pod kątem około 45 stopni od patrzenia. Dodać 100 mikrolitrów buforu testowego z jodkiem propidyny do każdej kontroli bez toksyny. Sprawdź, czy kontrolka została poprawnie dodana, wizualnie identyfikując probówki o łącznej objętości 200 mikrolitrów, które wydają się ciemniejsze.Dodać objętość toksyny do najwyższego rozcieńczenia. Następnie seryjnie rozcieńczyć toksynę. Pipetować w górę i w dół co najmniej osiem razy, aby zapewnić mieszanie.Zaczynając od najniższego stężenia toksyny, szybko dodaj 100 mikrolitrów toksyny do odpowiedniego rzędu i kontynuuj, aż cała toksyna zostanie dodana do komórek. Uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut zapakować i przetransportować płytkę do cytometru przepływowego.W celu uzyskania danych należy rozpocząć od skonfigurowania cytometru przepływowego i oprogramowania do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta i zasadami obowiązującymi w obiekcie. Korzystając z niebarwionej próbki promastygoty L.major, ustaw bramki dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz początkowe parametry fluorescencyjne w oparciu o wybrane barwniki. Używając pojedynczo barwionych kontroli, ustaw bramki dla barwnika żywotności i wszelkich fluorescencyjnie znakowanych toksyn.Monitoruj rozproszenie do przodu w funkcji czasu dla mikrozatorów i uzyskaj ponad 10 000 zdarzeń bramkowanych dla każdej próbki na cytometrze. Do analizy danych bramkuje się całkowite jednokomórkowe promastigoty L.major, bramkując rozproszenie do przodu i z boku oraz czas w razie potrzeby. Użyj wysokości lub powierzchni zgodnie z zaleceniami dla cytometru przepływowego.Zidentyfikuj martwe komórki i zablokuj je jako wysokie PI. Uporządkuj krzywą dawka-odpowiedź w programie Excel do analizy. Określ średni procentowy wysoki poziom PI dla każdego warunku między dwoma kontrpróbami technicznymi.Uwzględnij stężenie toksyny i średni procentowy procent lizy specyficznej, wraz ze szczegółami eksperymentalnymi i/lub obliczeniami surowego procentu PI. Oznacz cztery kolejne kolumny jako Modelowane, Resztki, Parametry i Wartości parametrów. Sprawdzić, czy pierwsze kolumny odpowiadają parametrom doświadczalnym, stężeniu toksyny i procentowej lizie swoistej.Zainicjuj parametry L, k i c, wprowadzając wartości w kolumnie Wartości parametrów. W kolumnie Modelowane utwórz model logistyczny. W kolumnie Reszty oblicz kwadrat różnicy między modelowaną liczbą a rzeczywistą lizą właściwą.W kolumnie Wartości parametrów obok pozycji SUMA zsumuj wszystkie wartości w kolumnie Reszty. W kolumnie Wartości parametrów, obok pozycji PO50, zainicjuj równanie, aby obliczyć PO50 na podstawie określonych wartości. Otwórz dodatek Solver na karcie Dane.Wybierz ustawiony cel, który ma być komórką zawierającą sumę obliczonych reszt. Ustaw wartość Min. Zmień komórki zmiennych dla wartości parametrów L, k i c.W przypadku ujemnych wartości k zmodyfikuj równania, rozkładając ujemny jeden z k, aby zmienić k na dodatnie. Użyj metody rozwiązywania nieliniowego GRG i kliknij przycisk Rozwiąż. Sprawdź krzywą i upewnij się, że LC50 jest obliczana automatycznie.Sprawdź dopasowanie, przedstawiając graficznie zarówno procentową specyficzną lizę, jak i modelowanie w stosunku do stężenia toksyny. Promastigoty SPT2 z niedoborem sfingolipidów były wrażliwe na SLO zarówno w surowicy M199, jak i w buforze Tyrode'a. Promastigoty typu dzikiego i SPT2 z dodatkiem były odporne na SLO w M199 bez surowicy, ale miały mniej niż 20% specyficzną lizę w buforze Tyrode.Promastigoty nokautujące SPT2 były około ośmiokrotnie bardziej czułe na SLO w buforze Tyrode'a niż w M199. Dane te pokazują, że czułość toksyny może się różnić w zależności od zastosowanego buforu. Pasmo 120 kilodaltonów zaobserwowano dla fosfo-MEK w promastigotykach L.major.Dla całkowitego MEK zaobserwowano pasma na poziomie około 120 kilodaltonów i 55 kilodaltonów, które są zgodne z rozmiarami odpowiednio MRK1 i LmxMKK. Phospho-ERK wykrył podobne prążki, podczas gdy barwienie przeciwciałami ERK nie było odporne w tym teście. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest zapewnienie właściwego obchodzenia się z toksyną.Leishmania może być wykorzystana jako genetycznie podatny model do badania naprawy błony plazmatycznej, dostarczając nowych informacji na temat mechaniki naprawy błony podczas interakcji bakterii Leishmania w jelicie środkowym muchy piaskowej.

deciphering-molecular-mechanism-function-pore-forming-toxins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Odkryj mechanizmy toksyn tworzących pory w komórkach Leishmania major. Ta metoda umożliwia badanie cytotoksyczności i szlaków sygnałowych naprawy błon komórkowych w czasie rzeczywistym.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Przeglądaj więcej filmów