Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Mechanizm odporności na toksyny tworzące pory jest słabo poznany. Nasz protokół umożliwia funkcjonowanie i mechanizm tworzenia porów toksyn za pomocą Leishmania major, genetycznie wykonalnego i fizjologicznie istotnego systemu. Główną zaletą testu cytotoksyczności jest porównanie żywotności wielu fenotypów komórek na poziomie pojedynczej komórki w teście średnioprzepustowym w przypadku narażenia na toksyny w czasie rzeczywistym.

Leki zaburzające błonę śluzową, takie jak amfoterycyna B, są terapiami pierwszego rzutu w leczeniu Leishmania. Test ten umożliwia identyfikację czynników, które nasilają działanie amfoterycyny B i/lub nowych środków uszkadzających błony. Test ten zapewnia wgląd w takie obszary, jak reakcja naprawcza i szlaki sygnałowe związane z reakcjami naprawczymi.

Ten test można zastosować do pierwotniaków, takich jak Trypanosoma i Naegleria fowleri. Ludzie mają trudności ze zrozumieniem serii seryjnych rozcieńczeń toksyn. Tak więc najlepszą radą, jaką mogę dać, jest narysowanie schematu serii rozcieńczeń szeregowych przed rozpoczęciem eksperymentu.

Na początek zarezerwuj 0,5 mililitra przetworzonych promastigotów w osobnej tubie jako niebarwioną kontrolę. Dodaj dwa miligramy na mililitr jodku propidyny lub PI do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr do pozostałych promastigotów. Wiruj przez trzy sekundy.

Dodaj przetworzone promastigoty do każdego dołka z dnem w kształcie litery V, 96-dołkowej płytki lub probówek Marsh i umieść stojak na płytki lub probówki na lodzie pod kątem około 45 stopni od patrzenia. Dodać 100 mikrolitrów buforu testowego z jodkiem propidyny do każdej kontroli bez toksyny. Sprawdź, czy kontrolka została poprawnie dodana, wizualnie identyfikując probówki o łącznej objętości 200 mikrolitrów, które wydają się ciemniejsze.

Dodać objętość toksyny do najwyższego rozcieńczenia. Następnie seryjnie rozcieńczyć toksynę. Pipetować w górę i w dół co najmniej osiem razy, aby zapewnić mieszanie.

Zaczynając od najniższego stężenia toksyny, szybko dodaj 100 mikrolitrów toksyny do odpowiedniego rzędu i kontynuuj, aż cała toksyna zostanie dodana do komórek. Uszczelnij płytę taśmą uszczelniającą. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut zapakować i przetransportować płytkę do cytometru przepływowego.

W celu uzyskania danych należy rozpocząć od skonfigurowania cytometru przepływowego i oprogramowania do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta i zasadami obowiązującymi w obiekcie. Korzystając z niebarwionej próbki promastygoty L.major, ustaw bramki dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz początkowe parametry fluorescencyjne w oparciu o wybrane barwniki. Używając pojedynczo barwionych kontroli, ustaw bramki dla barwnika żywotności i wszelkich fluorescencyjnie znakowanych toksyn.

Monitoruj rozproszenie do przodu w funkcji czasu dla mikrozatorów i uzyskaj ponad 10 000 zdarzeń bramkowanych dla każdej próbki na cytometrze. Do analizy danych bramkuje się całkowite jednokomórkowe promastigoty L.major, bramkując rozproszenie do przodu i z boku oraz czas w razie potrzeby. Użyj wysokości lub powierzchni zgodnie z zaleceniami dla cytometru przepływowego.

Zidentyfikuj martwe komórki i zablokuj je jako wysokie PI. Uporządkuj krzywą dawka-odpowiedź w programie Excel do analizy. Określ średni procentowy wysoki poziom PI dla każdego warunku między dwoma kontrpróbami technicznymi.

Uwzględnij stężenie toksyny i średni procentowy procent lizy specyficznej, wraz ze szczegółami eksperymentalnymi i/lub obliczeniami surowego procentu PI. Oznacz cztery kolejne kolumny jako Modelowane, Resztki, Parametry i Wartości parametrów. Sprawdzić, czy pierwsze kolumny odpowiadają parametrom doświadczalnym, stężeniu toksyny i procentowej lizie swoistej.

Zainicjuj parametry L, k i c, wprowadzając wartości w kolumnie Wartości parametrów. W kolumnie Modelowane utwórz model logistyczny. W kolumnie Reszty oblicz kwadrat różnicy między modelowaną liczbą a rzeczywistą lizą właściwą.

W kolumnie Wartości parametrów obok pozycji SUMA zsumuj wszystkie wartości w kolumnie Reszty. W kolumnie Wartości parametrów, obok pozycji PO50, zainicjuj równanie, aby obliczyć PO50 na podstawie określonych wartości. Otwórz dodatek Solver na karcie Dane.

Wybierz ustawiony cel, który ma być komórką zawierającą sumę obliczonych reszt. Ustaw wartość Min. Zmień komórki zmiennych dla wartości parametrów L, k i c.

W przypadku ujemnych wartości k zmodyfikuj równania, rozkładając ujemny jeden z k, aby zmienić k na dodatnie. Użyj metody rozwiązywania nieliniowego GRG i kliknij przycisk Rozwiąż. Sprawdź krzywą i upewnij się, że LC50 jest obliczana automatycznie.

Sprawdź dopasowanie, przedstawiając graficznie zarówno procentową specyficzną lizę, jak i modelowanie w stosunku do stężenia toksyny. Promastigoty SPT2 z niedoborem sfingolipidów były wrażliwe na SLO zarówno w surowicy M199, jak i w buforze Tyrode'a. Promastigoty typu dzikiego i SPT2 z dodatkiem były odporne na SLO w M199 bez surowicy, ale miały mniej niż 20% specyficzną lizę w buforze Tyrode.

Promastigoty nokautujące SPT2 były około ośmiokrotnie bardziej czułe na SLO w buforze Tyrode'a niż w M199. Dane te pokazują, że czułość toksyny może się różnić w zależności od zastosowanego buforu. Pasmo 120 kilodaltonów zaobserwowano dla fosfo-MEK w promastigotykach L.major.

Dla całkowitego MEK zaobserwowano pasma na poziomie około 120 kilodaltonów i 55 kilodaltonów, które są zgodne z rozmiarami odpowiednio MRK1 i LmxMKK. Phospho-ERK wykrył podobne prążki, podczas gdy barwienie przeciwciałami ERK nie było odporne w tym teście. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest zapewnienie właściwego obchodzenia się z toksyną.

Leishmania może być wykorzystana jako genetycznie podatny model do badania naprawy błony plazmatycznej, dostarczając nowych informacji na temat mechaniki naprawy błony podczas interakcji bakterii Leishmania w jelicie środkowym muchy piaskowej.