Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Strategia wykluczania neuronów za pomocą sortowania ujemnego FACS generuje wysokiej jakości wskaźniki sekwencjonowania RNA populacji komórek o niskiej liczebności, takich jak nerwowe komórki macierzyste, astrocyty i oligodendrocyty, w celu zbadania ich roli w modulacji neurogenezy dorosłego hipokampa. Dzięki tej metodzie możliwe jest dostosowanie wyboru przeciwciała w bramkowaniu FACS, co sprawia, że protokół ten jest bardzo wszechstronny w rozwiązywaniu różnych problemów biologicznych związanych z zakrętem zębatym. Metoda ta ma na celu przede wszystkim zbadanie niszy hipokampa u dorosłych.

Można go jednak łatwo zaadaptować do badania innych nisz komórek macierzystych. Procedurę zademonstruje Sara Ahmed de Prado, stażystka podoktorska w Instytucie Francisa Cricka. Na początek przenieś mózg wypreparowany z myszy poddanej eutanazji na 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatym PBS.

Następnie umieść szalkę Petriego na lodzie i przetnij mózg na dwie połowy wzdłuż osi strzałkowej. Za pomocą skalpela usuń móżdżek. Przenieś jedną połowę mózgu na nową, 10-centymetrową szalkę Petriego umieszczoną na lodzie, zawierającą lodowaty PBS.

Przeanalizuj zakręt zębaty lub DG za pomocą lornetki i powtórz ten krok, aby uzyskać drugi DG z drugiej połowy mózgu. Przenieś dwa DG do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce i dodaj 1 mililitr zimnego buforu homogenizacyjnego lub HB. Homogenizować tkankę za pomocą 10 pociągnięć luźnym tłuczkiem A, a następnie 15 pociągnięć ciasnym tłuczkiem B. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Przepłucz homogenizator Dounce 1 mililitrem zimnego HB i połącz go z tą samą probówką. Dodaj 3 mililitry HB do 15-mililitrowej probówki i inkubuj przez 5 minut na lodzie. Wymieszaj zawiesinę jąder dwukrotnie, delikatnie odwracając probówkę.

Używając 0,5 mililitra HB, wstępnie zwilż nasadkę sitka o średnicy 70 mikrometrów umieszczoną na 50-mililitrowej probówce, a następnie odcedź zawiesinę jąder przed umyciem sitka komórkowego 0,5 mililitra HB. Następnie wyjmij sitko komórkowe i odwiruj probówkę w wirówce z wiadrem obrotowym o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić granulkę w 4 mililitrach HB za pomocą pipety P1000.

Po 5 minutach inkubacji na lodzie odwirować zawiesinę o stężeniu 500 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 mililitrach pożywki myjącej. Użyj 0.5 mililitra środka myjącego, aby wstępnie zwilżyć nasadkę sitka o średnicy 35 mikrometrów na 50-mililitrowej probówce.

Następnie odcedź zawiesinę jąder, pipetując jednorazowo 0,5 mililitra zawiesiny za pomocą pipety P1000. Po umyciu nakrętki sitka 0,5 mililitra środka myjącego, umieść rurkę na lodzie. Przenieść filtrat do nowej 15-mililitrowej probówki i odwirować go przez 5 minut i 4 stopnie Celsjusza, przy 500 x g.

Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 3 mililitrach środka myjącego. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze pożywki myjącej za pomocą mysiego przeciwciała anty-NeuN, przeciwciała sprzężonego z Alexa Fluor 488 i 1 mikrograma na mililitr DAPI. Inkubować reakcję przez 45 minut na lodzie w ciemności.

W przypadku sortowania jąder aktywowanych fluorescencją lub FANS, przenieś zawiesinę jąder wybarwionych immunologicznie do probówki o pojemności 5 mililitrów i umieść ją na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury cytometrii przepływowej. Wirować próbki przez 3 sekundy, z łagodną intensywnością, przed umieszczeniem probówek w instrumencie FACS. Aby uzyskać dane z zawiesiny barwionych jąder, ustaw bramki na wysokości DAPI i obszarze DAPI, aby wykluczyć szczątki komórek i zagregowane jądra.

Następnie ustaw bramki w obszarze rozproszenia po stronie logarytmu lub SSC i obszarze rozproszenia logarytmicznego do przodu lub FSC, aby oddzielić pojedyncze jądra od pozostałego agregatu barwionego DAPI lub szczątków komórkowych. Następnie wyizoluj populację NeuN-AF488-ujemną, ustawiając bramki dla obszaru anty-NeuN-AF488 i FSC. Po analizie posortuj populację ujemną anty-NeuN-AF488 w 1,5-mililitrowej probówce zbiorczej wypełnionej 50 mikrolitrami pożywki myjącej, stosując strategię bramkowania.

Po zakończeniu sortowania dodaj 1 mililitr PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA do probówki zbiorczej, aby zebrać kropelki ze ścianki probówki i odwirować probówkę przy 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant, pozostawiając 50 mikrolitrów substancji rozpuszczonej do ponownego zawieszenia odwirowanych jąder. W mikroprobówce o pojemności 0,5 mililitra dodaj 5 mikrolitrów zawiesiny jąder do 5 mikrolitrów błękitu trypanowego.

Zmierz stężenie i oceń żywotność zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą automatycznego licznika komórek przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania jąder. Grupowanie bioinformatyczne ujawniło dobrze oddzielone grupy jąder odpowiadające znanym typom komórek w DG, z wentylatorami lub bez nich. W próbce niesortowanej przez FACS większość wysokiej jakości zsekwencjonowanych jąder stanowiła 84,9% neuronów.

Składał się z trzech grup neuronów, co wskazuje na możliwość, że najbardziej reprezentatywnymi populacjami komórek w zakręcie zębatym mogą być neurony ziarniste, inne neurony pobudzające i neurony hamujące. W próbce niesortowanej przez FACS zidentyfikowane klastry nieneuronalne składały się głównie z 11,1% typów komórek glejowych, w tym astrocytów, oligodendrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów, 3,3% komórek odpornościowych i 0,6% komórek Cajal-Retzius. Podczas wykonywania FANS w celu wykluczenia populacji NeuN dodatnich, klastry komórek glejowych stały się widoczne, stanowiąc 81,3% wszystkich jąder.

Dla próbek sekwencjonowanych z prędkością 50 000 odczytów na jądro, wykryto 25 010 genów na jądro dla próbki niesortowanej przez FACS i 1 665,5 genów dla próbki FANS NeuN-ujemnej, co potwierdza wysokiej jakości profilowanie transkryptomiczne pojedynczych jąder, a sortowanie FACS nie uszkadza jąder pod kątem późniejszej sekwencji snRNA. Wysoki odsetek neuronów w próbce niesortowanej przez FACS miał wyższą aktywność transkrypcyjną wynoszącą 2 660 genów na jądro i 6 170 transkryptów na jądro w próbce niesortowanej przez FACS niż typy komórek nieneuronalnych o średniej aktywności transkrypcyjnej 1 090 genów na jądro i 1 785 transkryptów na jądro. Po wygenerowaniu danych za pomocą tego protokołu warto rozważyć te nowe metody ortogonalne, takie jak specjalne objawy lub badania in vivo, aby zweryfikować wszelkie wyniki.