Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Metoda ta opisuje nowy model mysi do badania przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Bardziej naśladuje to, co dzieje się u ludzi. Model ten może być ważnym narzędziem do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych przeciwko wtórnemu pneumokokowi zapalenia płuc u podatnych gospodarzy.

Model ten odtwarza podatność na starzenie. W związku z tym można go wykorzystać, aby zrozumieć, jakie aspekty gospodarza stają się wadliwe wraz z wiekiem i umożliwić nam dostosowanie opcji leczenia dla wrażliwych gospodarzy w podeszłym wieku. Hodowla biofilmu pneumokokowego jest wyzwaniem, ponieważ różne szczepy zajmują różną ilość czasu.

Radzę spróbować wyhodować biofilm przed przeprowadzeniem badania na zwierzętach. Gdy komórki H292 będą w 100% zlewne, umyj je trzykrotnie PBS. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 4% paraformaldehydu na studzienkę, aby utrwalić komórki i inkubować przez godzinę na lodzie lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Strake szczep Streptococcus pneumoniae na płytce z krwią i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zaszczepić bakterie z płytki na świeże, chemicznie zdefiniowane podłoże lub CDM plus Oxyraze, zmywając bakterie z płytki, dodając jeden mililitr CDM plus Oxyrase i delikatnie podnosząc kolonie bakteryjne za pomocą boku jednomililitrowej końcówki pipety, uważając, aby nie zeskrobać agaru. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną w CDM z oksyrazą do początkowego OD 600 0,05.

Następnie hoduj bakterie w luźno zamkniętej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia OD 0,2. Następnie przekręć rurkę do hodowli bakterii. Wysiewaj 0,5 mililitra kultury na utrwalone komórki H292 i dodaj kolejne 0,5 mililitra CDM plus pożywkę Oxyrase na dołek.

Dodaj CDM plus Oxyrase do studzienek kontrolnych bez bakterii. Inkubuj płytkę przez 48 godzin w temperaturze 34 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Co 12 godzin, po wstępnym wysiewie, delikatnie zastąp 0,5 mililitra podłoża świeżym CDM i Oxyrase.

Uważaj, aby nie zakłócić tworzenia się biofilmu. Sprawdź spód płytki pod kątem biofilmu i poszukaj rosnącego zmętnienia w miarę upływu czasu z powodu wzrostu biofilmu. Po 48 godzinach usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć biofilm jednym mililitrem PBS.

Następnie ponownie zawiesić biofilm w jednym mililitrze świeżego CDM i energicznie pipetować w górę iw dół, aby podnieść biofilm. Dla każdego szczepu bakteryjnego umieść kulturę ze wszystkich studzienek w 50-mililitrowej probówce. Dobrze wymieszaj, delikatnie przechylając kilkakrotnie szczelnie zakręconą rurkę w górę iw dół.

Następnie dodaj 40% glicerolu i CDM w równych objętościach, aby uzyskać zawiesinę bakteryjną o końcowym stężeniu 20% glicerolu. Porcję jednego mililitra do mikroprobówki wirówkowej, błyskawiczne zamrożenie na suchym lodzie i zaoszczędzenie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić wyhodowane podwielokrotności biofilmu na lodzie i wirować z prędkością 1,700 G przez pięć minut.

Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Następnie umyj granulkę, ponownie zawieszając ją w jednym mililitrze PBS i ponownie odwiruj. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w objętości potrzebnej do osiągnięcia pożądanego stężenia.

Zaszczepić donosowo sześć czarnych samców myszy C57 pięciokrotnie 10 do szóstej jednostki tworzącej kolonię lub CFU, pipetując pięć mikrolitrów rozcieńczonego inokulum do każdego naris. Po zaszczepieniu mocno przytrzymaj mysz, stabilizując głowę do momentu wdychania objętości. Po rozmrożeniu wirusa należy rozcieńczyć go w PBS do pożądanego stężenia.

Umieść lubrykant okulistyczny na oczach myszy przed znieczuleniem. Natychmiast zainfekuj znieczuloną mysz 50 mikrolitrami 20 jednostek tworzących płytkę nazębną lub PFU wirusa grypy A lub IAV dotchawiczo, używając pęsety do wyciągnięcia języka z ust i pipetowania objętości płynu w dół tchawicy. Po wyzdrowieniu należy dodonosowo zaszczepić 10 mikrolitrów 200 PFU IAV metodą inokulacji opisaną wcześniej.

W celu pobrania płuc za pomocą nożyczek preparacyjnych odetnij boki odsłoniętej klatki piersiowej i delikatnie pociągnij żebra w kierunku głowy myszy, aby odsłonić serce. Włóż igłę o rozmiarze 25 dołączoną do 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej PBS do prawej komory i zacznij powoli roztapiać. Szukaj wybielania płuc jako wskaźnika udanej perfuzji.

Spłukiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki płucnej. Podnieś serce kleszczami i wykonaj nacięcie, aby oddzielić płuca i serce. Po oddzieleniu podnieś wszystkie płaty płuc za pomocą kleszczy i spłucz w naczyniu sterylnym PBS, aby usunąć resztki krwi.

Na szalce Petriego zmiel płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj. Usuń połowę mieszanki płucnej, aby określić bakteryjną CFU lub wirusową PFU i umieść ją w 15-mililitrowej probówce z okrągłym dnem wypełnionej 0,5 mililitra PBS w celu homogenizacji. Usuń drugą połowę płuca do cytometrii przepływowej i umieść ją na 24-dołkowej płytce poddanej hodowli nietkankowej, z każdą studzienką wstępnie wypełnioną 0,5 mililitra RP10.

Pozostaw w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia. Aby homogenizować pobraną tkankę, wyczyść sondę homogenizatora, umieszczając ją w 70% etanolu i włączając homogenizator z mocą 60% na 30 sekund. Powtórz ten krok w sterylnej wodzie przez 10 sekund.

Homogenizuj każdą tkankę przez jedną minutę. Do oznaczania liczby bakterii, seryjne rozcieńczenia płytki na płytkach z agarem z krwią. Aby obliczyć całkowitą jtk, użyj 10 mikrolitrów do płytki i zanotuj końcową objętość w mililitrach dla każdej próbki.

Umieść próbki z nosogardzieli na płytkach z agarem z krwią uzupełnionych trzema mikrogramami na mililitr gentamycyny, aby wybrać wzrost S pneumoniae, jednocześnie hamując wzrost innych mikroorganizmów. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W przypadku cytometrii przepływowej dodać 500 mikrolitrów buforu wytrawiającego do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej próbkę płuc.

Inkubować płytkę przez 45 minut do jednej godziny. Następnie za pomocą mikropipety P-1000 przesuń strawione płuca i umieść je na filtrze. Następnie użyj tłoka trzymililitrowej strzykawki, aby rozgnieść próbkę.

Wzrost biofilmu inokulum S.pneumoniae powoduje konsekwentne nosicielstwo pneumokoków ograniczone do nosogardzieli, unikając przy tym systematycznego rozprzestrzeniania się. Obraz choroby u myszy zakażonych S pneumoniae IAV był zależny od szczepu bakteryjnego. Chociaż nie stwierdzono znaczącej różnicy w liczbie bakterii w nosogardzieli wśród żadnego ze szczepów, S pneumoniae, TIGR4 i D39, ale nie EF3030 rozprzestrzeniły się do płuc w ciągu 48 godzin po zakażeniu IAV.

40% myszy zakażonych S pneumoniae TIGR4 wykazywało rozprzestrzenianie się bakterii do płuc, a połowa z nich stała się bakteremią. Myszy zakażone S pneumoniae D39 wykazywały 100% rozprzestrzenianie się do płuc, a połowa z nich doświadczyła bakteriemii. Śledząc całkowite przeżycie, niezależnie od szczepu bakteryjnego, wskaźnik przeżycia współzakażonych myszy był znacznie niższy niż myszy pojedynczo prowokowanych S pneumoniae.

Model ten wykorzystano również do oceny obecności różnych komórek odpornościowych w płucach po zakażeniu IAV. Szczepy bakteryjne D39 i TIGR4 wywołały znaczny wzrost w stosunku do wartości wyjściowej w napływie zapalnych komórek odpornościowych z krążenia, takich jak neutrofile i monocyty, podczas gdy EF3030 nie. Samo zakażenie IAV wywołało znaczny wzrost powyżej wartości wyjściowej w napływie komórek odpornościowych, takich jak komórki NK i limfocyty T gamma delta.

Te odpowiedzi przeciwwirusowe były znacznie osłabione u myszy donosowo zakażonych S pneumoniae przed prowokacją wirusową. U pojedynczo zakażonych myszy miana wirusa nie różniły się między młodymi i starszymi kohortami. Stare myszy wykazywały wcześniej i znacznie poważniejsze objawy choroby i umierały szybciej, w ciągu 24 godzin, podczas gdy młode myszy lepiej przeżywały infekcję.

Rozdzielenie nosicielstwa i choroby na odrębne etapy pozwala nam zbadać zarówno odpowiedź immunologiczną, jak i czynniki bakteryjne i/lub wirusowe ważne w różnych fazach postępu choroby. Mamy nadzieję, że model ten zostanie zaadaptowany przez inne laboratoria do badania innych interakcji wielodrobnoustrojowych i interakcji patogenów gospodarza w różnych fazach progresji choroby i między różnymi gospodarzami.