Name: Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj protokół hodowli, zamrażania i obrazowania całych organoidów w hydrożelu przy użyciu wielofunkcyjnego urządzenia. Metoda zachowuje integralność struktur 3D i umożliwia niezawodną analizę biomarkerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Dale'owi Mertesowi z Uniwersytetu w Chicago za przygotowanie diagramów, dr Mehmetowi Serifowi Aydinowi za wsparcie techniczne w Instytucie Badawczym Nauk o Zdrowiu i Technologii Uniwersytetu Medipol w Stambule, oraz dr Rana Kazemi z Uniwersytetu Maltepe za redakcję manuskryptu.

1. Hodowla organoidów i sferoidów
<ol>
	<li>Umieść hydrożel na lodzie na noc (w lodówce lub chłodni) do rozmrożenia.</li>
	<li>Umieścić dostępne w handlu urządzenie wielofunkcyjne (MD; patrz tabela materiałów) w inkubatorze na 1 dzień przed eksperymentem (37 °C, 5% CO2) do ogrzania.</li>
	<li>Umieść sterylne końcówki pipet z szeroką końcówką w lodówce w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Kroki 1.1-1.3 należy wykonać w dniu 0, a kroki 1.4-1.11 należy wykonać w dniu 1.</li>
	<li>Umieść hydrożel na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Rozcieńczyć hydrożel w pożywce do hodowli zimnokomórkowych zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić probówkę zawierającą osad komórek HepG2 (uzyskana w handlu linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego; patrz tabela materiałów) na lodzie.</li>
	<li>Umieść 30-35 μl 100% hydrożelu we wnęce wstępnie podgrzanego urządzenia, aby utworzyć kroplę żelu.</li>
	<li>Umieść 10 000 komórek HepG2 w środku górnej części każdej kropli hydrożelu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przykryj kroplę hydrożelu 200 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą.</li>
	<li>Przykryj pokrywę MD we właściwej pozycji, aby umożliwić przepływ gazu, i umieść urządzenie w inkubatorze.</li>
	<li>Nakarm komórki 200 μl DMEM z 10% FBS co drugi dzień.</li>
	<li>Sprawdź wzrost sferoid pod odwróconym mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Tworzenie sferoidów rozpoczyna się po 3dniu. Wideo 1 pokazuje położenie sferoid na różnych poziomach w kopule hydrożelowej. 
	UWAGI: Zdecydowanie zaleca się delikatne zassanie płynu otaczającego hydrożel i powolne dodawanie nowego płynu do otoczenia, aby zapobiec uszkodzeniu kropli hydrożelu.</li>
</ol>
2. Barwienie hematoksyliną i eozyną organoidów/sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Podgrzej utrwalacz (4% paraformaldehydu; PFA), PBS i hematoksyliny (patrz tabela materiałów) do 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę otaczającą kroplę hydrożelu za pomocą pipety, dodać 100-200 μl 4% PFA w celu utrwalenia i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać 4% PFA i dodać 200 μl PBS do mycia 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie odessać PBS i inkubować z 200 μl roztworu hematoksyliny przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać hematoksylinę i dodać 200 μldH2O, przemywać 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C. OdessaćdH2O i inkubować z 200 μl etanolu przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zassać etanol i inkubować z 200 μl eozyny (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odessać eozynę i dodać 200 μl dH2O do płukania przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Zassać dH2O i dodać 100 μl glicerolu w celu pokrycia kropli hydrożelu jako medium mocującego.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zamontuj wnękę za pomocą szkiełka nakrywkowego. Ten krok można pominąć, aby uniknąć ściskania organoidów/sferoidów o znacznych rozmiarach.</li>
	<li>Mocno zamknij pokrywę MD, aby uniknąć wysuszenia do czasu badania. Próbka jest stabilna do badania przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia całych organoidów/sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Otrzymany w handlu roztwór do badań immunohistochemicznych (S-IHC; patrz tabela materiałów) ogrzać do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Inkubować organoidy lub sferoidy w hydrożelu z 3% nadtlenkiem wodoru (H2O2) w 200 μldH2Oprzez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zassać roztwór nadtlenku wodoru i przemyć wdH 2O przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zassać dH2O i inkubować dwukrotnie ze 100 μl S-IHC w temperaturze 37 °C przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Odessać S-IHC i inkubować ze 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w S-IHC przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C (zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania roboczego).</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać 100 μl S-IHC i inkubować z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odessać S-IHC i inkubować ze 100 μl peroksydazy chrzanowej (HRP) znakowanej streptawidyną (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać streptawidynę znakowaną HRP i inkubować ze 100 μl S-IHC 3x przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zassać S-IHC i inkubować ze 100 μl mieszaniny roztworu chromogenu DAB/AEC (patrz tabela materiałów) przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Monitoruj intensywność barwienia pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Myć dH2O 3x po 2 min.</li>
	<li>Opcjonalnie: Inkubować ze 100 μl hematoksyliny (patrz tabela materiałów) w celu barwienia przeciwjądrowego przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać Hematoksylinę i przemyć w dH2O przez 5 min.</li>
	<li>Zassać dH2O i przykryć kroplę hydrożelu 100 μl glicerolu jako medium mocującym.</li>
	<li>Mocno zamknij pokrywę MD do czasu badania mikroskopowego. 
	UWAGI: Etapy pobierania antygenu i blokowania białek są pominięte w tym protokole, ponieważ S-IHC eliminuje te kroki.</li>
</ol>
4. Znakowanie immunofluorescencyjne organoidów/sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Rozgrzać następujące materiały do temperatury 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w S-IF, drugorzędowy roztwór przeciwciała w S-IF, barwienie jądrowe i glicerol (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i utrwalić 200 μl 4% PFA przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C. Odessać utrwalacz i przemyć w S-IF 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj dH2O po stronie otaczającej wnękę, aby zapewnić wilgotność podczas poniższych kroków.</li>
	<li>Odessać S-IF otaczający kroplę hydrożelu i inkubować kroplę hydrożelu ze 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) w S-IF przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć w S-IF 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zassać S-IF i inkubować w 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (patrz tabela materiałów) w S-IF przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć PBS 3x przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Odessać PBS i inkubować w 100 μl barwienia jądrowego DNA zawierającego pożywkę montażową lub glicerol, w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Wypełnij niszę glicerolem, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Opcjonalnie: Przykryj wnękę szkiełkiem nakrywkowym. Ten krok można pominąć, aby uniknąć ściskania organoidów/sferoidów.</li>
	<li>Szczelnie zamknij MD. Próbki w MD mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemności przez co najmniej 6 miesięcy przy minimalnej utracie fluorescencji.</li>
	<li>Użyj następujących ustawień do konfokalnego badania mikroskopowego: ustaw wartość otworkową wszystkich kanałów na 20.1, utrzymuj główną stałą wzmocnienia na poziomie 550 dla 488 nm, 485 dla 550 nm i 450 dla 594 nm, utrzymuj stałą moc lasera dla wszystkich eksperymentów i najniższą wartość procentową na poziomie 2.0. 
	UWAGI: Przeciwciała pierwszorzędowe: ATPaza anty-Na-K (1:100), anty-arginaza (1:50), antyalbumina (1:50), anty-beta-galaktozydaza (1:25), przeciwciało antymitochondrialne (1:100), przeciwciało anty-Golgiego (1:50), antycytokeratyna 5 (1:100), przeciwciało Ov6 (1:100). Przeciwciała drugorzędowe: kozia anty-królicza IgG (H + L)-488, kozia anty-królicza IgG (H + L)-550, kozia anty-mysia IgG (H + L)-488, kozia anty-mysia IgG (H + L)-550, kozia anty-kurczak IgY(H+L)-647. Rozcieńczenie dla wszystkich przeciwciał drugorzędowych wynosi 1:100. Dodatkowo stosuje się również FITC-falloidynę (1:100), przeciwciało sprzężone (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Znakowanie błony plazmatycznej i jądra żywych organoidów i sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do etykietowania zawierający aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa fluor (5,0 μg/ml) i Hoechst (2 μM) w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), zgodnie z zaleceniami producenta (patrz tabela materiałów) i ogrzać do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 100 μl roztworu do znakowania, aby przykryć kroplę hydrożelu. Inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór do etykietowania i umyć dwukrotnie w PBS 2x przez 10 minut każdy w temperaturze 37 °C. Opcjonalnie: Utrwalić 200 μl 4% formaldehydu przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przykryj kroplę hydrożelu glicerolem jako medium montażowym. Opcjonalnie: Zamontuj wnękę za pomocą szkła osłonowego.</li>
	<li>Zamknij szczelnie pokrywę MD i przechowuj ją w lodówce w ciemności do czasu fluorescencji/konfokalnego badania mikroskopowego. Jest stabilny przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
</ol>
6. Zamrażanie i rozmrażanie całych organoidów/sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Zamroź organoidy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Otrzymany w handlu roztwór do zamrażania (FS; patrz tabela materiałów) rozgrzać do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie zassać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą kopułę hydrożelową.</li>
		<li>Delikatnie dodaj 200 μl FS. Inkubować próbkę z FS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zamknij szczelnie pokrywę urządzenia i umieść je w piankowym pudełku. Umieść to pudełko piankowe w innym pudełku piankowym, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 3. Zamknij szczelnie oba pudełka z pianki. Dwa pojemniki piankowe umieszczone jeden w drugim zapewniają gradient temperatury próbki w zakresie od 1 do 2°C/min w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Umieść pudełko w temperaturze -20 °C na 2 godziny. Przenieś pudełko do zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostaw na noc.</li>
		<li>Wyjmij próbkę z pudełek. Próbka w MD może być przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.</li>
		<li>Przenieś MD zawierający próbkę do zbiornika ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić organoidy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wyjąć MD z próbką ze zbiornika zamrażarki/azotu i umieścić ją bezpośrednio w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 200 μl ciepłej pożywki hodowlanej do wnęki (stosunek FS do pożywki do pożywki do hodowli komórkowej wynosi 1:1) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać więcej ciepłej pożywki do wnęki (stosunek FS do pożywki do pożywki do hodowli komórkowej wynosi 1:2) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Delikatnie zassać pożywkę i mieszaninę FS. Przejdź do skaningowej mikroskopii elektronowej (krok 7) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (krok 8), obrazowania organoidów/sferoidów z całą mocą w hydrożelu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Skaningowa mikroskopia elektronowa organoidów/sferoidów z całego montażu
<ol>
	<li>Rozgrzej roztwór utrwalający i postutrwalający Karnovsky'ego (patrz Tabela materiałów) do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą hydrożel w MD. Umieścić próbkę w MD na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut.</li>
	<li>Bardzo delikatnie odessać upłynniony hydrożel otaczający organoidy/sferoidy. Ograniczona ilość matrigelu może pozostać w niszy, aby uniknąć uszkodzenia i utraty próbki.</li>
	<li>Utrwalić utrwalaczem Karnovsky'ego (2% PFA, 2,5% aldehydu glutarowego w 0,15 M buforze kakodylanu i 2 mM CaCl2; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Delikatnie odessać utrwalacz i przemyć wodą destylowaną (dH2O) 3x przez 15 minut każdy.</li>
	<li>Delikatnie zassaćdH2O i utrwalić roztworem po utrwaleniu (1% wodny tlenek osmu [OsO4]; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Delikatnie odessać postutrwalacz i przemyć wodą destylowaną (dH2O) 3x przez 15 min każdy.</li>
	<li>Odwodnić w stopniowanej serii etanolu (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mieszaniny etanolu/acetonu (1:1; 1:2) i acetonu bezwzględnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut każde.</li>
	<li>Wysuszyć za pomocą suszarki do punktów krytycznych.</li>
	<li>Pokryj próbkę w urządzeniu złotem/palladem o długości fali 6 nm za pomocą napylarki (patrz Tabela materiałów) przez 90 s.</li>
	<li>Obserwacje pod skaningowym mikroskopem elektronowym z wbudowanym w soczewkę wtórnym detektorem elektronów przy napięciu 2-3 kV w trybie próżni (5 x 10-6 mA). Rób zdjęcia z odległości roboczej 8,1-8,2 mm i przy powiększeniach 675x, 1050x i 1570x. 
	UWAGI: Wszystkie kroki są wykonywane w MD. Na każdym etapie należy użyć 200-250 μl roztworu.</li>
</ol>
8. Transmisyjna mikroskopia elektronowa organoidów/sferoidów w hydrożelu
<ol>
	<li>Rozgrzać utrwalacz Karnovsky'ego do temperatury 37 °C. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą hydrożel w MD.</li>
	<li>Utrwalić próbkę utrwalaczem Karnovsky'ego w RT przez 1 godzinę. Przemywać dH2O 3x przez 15 min każdy.</li>
	<li>Post-fix z 2% wodnym roztworem OsO4 i 2,5% żelazocyjankiem potasu w temperaturze pokojowej przez 45 min. Przemywać dH2O 3x po 10 min.</li>
	<li>Inkubować w 0,5% tiokarbohydrazydzie (TCH; patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przemywać dH2O 3x przez 10 min każdy.</li>
	<li>Inkubować w 2% wodnym roztworze OsO4 w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przemywać dH2O 3x przez 10 min każdy.</li>
	<li>Inkubować w 2% roztworze octanu uranylu (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 1 h. 
	UWAGA: Na tym etapie sferoidy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Inkubować w roztworze asparaginianu ołowiu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 60 °C przez 45 minut. Przemywać dH2O 3x przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Odwodnić w stopniowanej serii etanolu (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) i acetonu bezwzględnego w temperaturze pokojowej przez 15 minut każdy.</li>
	<li>Traktować mieszaniną (1:1; 1:2) acetonu/żywicy Epon i czystej żywicy Epon (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny każde.</li>
	<li>Polimeryzować żywicę w temperaturze 60 °C przez noc (minimum 16 godzin). Po polimeryzacji usuń blok żywicy z MD, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 4.</li>
	<li>Przymocuj blok żywicy do większego za pomocą kleju do żywicy. Przytnij blok i dotrzyj do lokalizacji organoidów lub sferoidów.</li>
	<li>Uzyskaj półcienkie (1 000 nm) i ultracienkie (60 nm) przekroje za pomocą ultramikrotomu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść ultracienkie sekcje na miedzianych siatkach o siatce 100 i obserwuj pod skaningowym mikroskopem elektronowym z detektorem STEM przy przyspieszającym napięciu 30 kV. Rób zdjęcia z odległości roboczej 44 mm i powiększeniami 2580x, 5020x i 6060x. 
	UWAGI: Na każdym etapie należy stosować 200-250 μl roztworu. Kroki 8.1-8.10 są wykonywane w MD.</li>
</ol>

Ranan Gulhan Aktas jest właścicielem wniosków patentowych MD, S-IHC, S-IF i FS. Olgu Enis Tok był zaangażowany w rozwój tych produktów. Olgu Enis Tok i Gamze Demirel są członkami zespołu badawczo-rozwojowego firmy o nazwie Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut i Ozgecan Kayalar nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować.

MD, uzupełniając opisane tutaj preparaty i protokoły, ułatwia szybki i spontaniczny wzrost 3D organoidów i sferoidów w bardziej kontrolowanym środowisku i kontynuuje eksperyment w tych samych warunkach. Próbka pozostaje w tym samym środowisku podczas całego procesu, a prawie 100% architektur rosnących 3D pozostaje nienaruszonych w pojemniku. Poprawia to jednorodność podczas sekwencyjnych eksperymentów i pozwala na wydłużenie okresu hodowli. Ponadto liczba etapów podczas przetwarzania organoidów i sferoidów jest drastyczn...

Przyszłość badań i terapii komórkowych leży w hodowlach komórkowych 3D1,2,3. Modele organoidowe i sferoidalne wypełniają lukę między eksperymentami in vitro a modelami zwierzęcymi, tworząc lepsze modele, które naśladują rozwój ludzkiego ciała, fizjologię i choroby4,5,6,7,8,9. Jednak odtwarzalność i powtarzalność tych modeli pozostaje wyzwaniem. Co więcej, obsługa, zbiór, przenoszenie i odwirowywanie tych struktur przy użyciu obecnych technologii powoduje utratę lub uszkodzenie organoidów i sferoidów w wielu warunkach, co znacząco wpływa na wyniki.

Pomimo wielu protokołów barwienia histologicznego, barwienia immunohistochemicznego, znakowania immunofluorescencyjnego i krioprezerwacji, nie ma uniwersalnego podejścia związanego ze standaryzacją warunków eksperymentalnych, obchodzeniem się i przetwarzaniem tych delikatnych struktur bez ich utraty lub uszkodzenia. Obecne protokoły są również niewiarygodnie długie, trwają naprzemiennie od kilku dni do kilku tygodni i obejmują złożone procedury z różnymi odczynnikami10,11,12,13,14. Ponadto zbieranie, pipetowanie, odwirowywanie i przenoszenie struktur rosnących 3D między naczyniami do hodowli komórkowych a kriowialiami powoduje zmiany w położeniu struktur i siłach mechanicznych, a ostatecznie wpływa na różnicowanie i dojrzewanie organoidów i sferoidów. Doniesiono, że topologia tkanek, umiejscowienie komórek i siły mechaniczne znacząco wpływają na różnicowanie i dojrzewanie komórek6,15,16,17.

Dlatego pożądane jest ulepszenie obecnych konwencjonalnych technologii generowania organoidów i sferoidów o stabilnej jakości. Metoda/urządzenie, które pominie wirowanie i inne etapy opisane powyżej i zapewni materiał w jednym bezpiecznym środowisku od początku do końca wielu procesów, byłaby korzystna dla osiągnięcia najbardziej spójnych i wiarygodnych danych. Dodatkowo zmniejszy to ograniczenia czasowe, robocze i kosztowe.
Opisane tutaj urządzenie wielofunkcyjne (MD) zapewnia jedno bezpieczne środowisko dla wielu procesów organoidów i sferoidów (Rysunek uzupełniający 1). To urządzenie i uzupełniające go protokoły eliminują etapy zbioru, pipetowania, przenoszenia i wirowania. Organoidy i sferoidy pozostają w swoim środowisku in vitro podczas procesów sekwencyjnych. Środowisko to składa się głównie z naturalnych lub syntetycznych składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak dostępne w handlu hydrożele. Innymi słowy, opisane tutaj metody pozwalają na przetworzenie, zbadanie i zamrożenie całej próbki organoidów/sferoidów jeszcze w kropli hydrożelu.
Biokompatybilne urządzenie jest odporne na temperatury od 60 °C do -160 °C, co umożliwia przywrócenie organoidów/steroidów w zbiorniku z ciekłym azotem w temperaturze -160 °C lub przygotowanie bloków żywicy do mikroskopii elektronowej w temperaturze 60 °C. Wnęka w urządzeniu została zaprojektowana w celu zdefiniowania ograniczonej przestrzeni dla struktur rosnących w 3D i stymulowania tworzenia sferoidów lub organoidów w oparciu o poprzednie badania18,19,20,21,22,23. Ta część urządzenia jest przezroczysta i zawiera specyficzne tworzywo sztuczne, które zapewnia wysoką jakość optyczną (współczynnik załamania światła: 1,43; wartość Abbego: 58; grubość: 7,8 mil [0,0078 cala lub 198 μm]). Zarówno nisza, jak i otaczająca ją "boczna" część powodują autofluorescencję. Przezroczysta wnęka pośrodku ma powierzchnię 80 mm2, natomiast część boczna ma 600 mm2. Głębokość pojemnika wynosi 15 mm, a grubość 1,5 mm. Cechy te, oprócz wielkości i konstrukcji urządzenia, umożliwiają prowadzenie obserwacji pod różnymi typami mikroskopów high-tech oraz przygotowanie próbek do badań mikroskopem elektronowym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). System zamykania urządzenia zapewnia dwie pozycje, jedną uszczelnioną w zamrażarce, a drugą umożliwiającą przepływ gazu w inkubatorze. Testy proliferacji i cytotoksyczności CCK8 wykazują podobny wpływ na komórki w porównaniu z tradycyjnymi szalkami do hodowli komórkowych (rysunek uzupełniający 2). Test wykluczenia błękitu trypanowego wykazuje wysoką żywotność komórek (94%) podczas hodowli komórkowej w MD (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).
Procesy, które mogą być wykonane dla jednej próbki w jednym urządzeniu, obejmują (1) hodowlę, (2) barwienie histologiczne, (3) barwienie immunologiczne, w tym znakowanie immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne, (4) zamrażanie, (5) rozmrażanie, (6) badanie pod mikroskopami optycznymi, takimi jak mikroskopy jasnego pola, ciemnego pola, fluorescencji, konfokalne i superrozdzielcze, (7) powlekanie i badanie bezpośrednio pod skaningowym mikroskopem elektronowym, lub (8) przygotowanie do transmisji mikroskopia elektronowa (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Istnieją różne metodologie barwienia histologicznego, znakowania immunohistochemicznego lub fluorescencyjnego znakowania organoidów i sferoidów10,11,12,13,14,24,25. Pozyskiwanie ich z hydrożelu jest pierwszym i głównym krokiem obecnej technologii. Po tym kroku niektóre metody umożliwiają znakowanie immunologiczne w całości. Zebrane organoidy są zatopione w parafinie, pocięte na sekcje i znakowane pod kątem barwienia i barwienia immunologicznego w innych. Sekcje mogą jednak nie przedstawiać całej próbki i dostarczać jedynie ograniczonych danych związanych z architekturą 3D konstrukcji. Co więcej, uszkodzenie tych struktur 3D i utrata antygenowości są dobrze znanymi skutkami ubocznymi tych technologii.
Uzupełniające nowe protokoły badań mikroskopowych w tym artykule pozwalają na analizę całych próbek nadal w hydrożelu. Opisane tutaj protokoły obejmują dwa nowo opracowane preparaty: roztwór do immunohistochemii (S-IHC) i roztwór do znakowania immunofluorescencyjnego (S-IF). Metody wykorzystujące te rozwiązania pozwalają naukowcom uzyskać dokładniejsze dane, ponieważ nie ma szkodliwych skutków tradycyjnych przepływów pracy, takich jak wirowanie, pipetowanie i przenoszenie delikatnych struktur. Opisany tutaj protokół eliminuje również konieczność etapów zbierania, blokowania, oczyszczania i pobierania antygenu oraz skraca całą procedurę do 6-8 godzin. Co więcej, metodologia ta pozwala na jednoczesne dodanie od jednego do trzech przeciwciał do tego samego S-IF. W związku z tym możliwe jest uzyskanie wyników tego samego dnia, nawet po wielokrotnych eksperymentach z etykietowaniem, co jest kolejną zaletą opisanego tutaj protokołu; Tradycyjne protokoły znakowania immunofluorescencyjnego w całości zwykle trwają od 3 dni do kilku tygodni10,11,12,13,14.
Osadzanie parafiny, kolejny szkodliwy krok, który zmniejsza antygenowość, jest również pomijane. Struktura 3D pozostaje w swoim środowisku in vitro od początku do końca badania mikroskopowego. Ponieważ struktura 3D pozostaje w swoich warunkach wzrostu, dane dotyczące ekspresji i lokalizacji białek lepiej naśladują warunki in vivo. Oczekuje się dokładniejszych wyników, ponieważ metodologia eliminuje etapy wpływające na ekspresję antygenu w próbce. Tabele 1 i 2 pokazują, w jaki sposób te nowe protokoły eliminują etapy, oszczędzają czas i pracę w laboratorium oraz zmniejszają koszty i ilość odpadów w porównaniu z tradycyjnymi przepływami pracy.
Oprócz kluczowych kroków opisanych powyżej, kolejnym problemem jest dostarczenie pożywki do krioprezerwacji i metody zachowania struktury 3D próbki o wyższych wskaźnikach żywotności komórek26,27,28,29,30,31. Kriokonserwacja jest niezbędna do stworzenia stabilnego systemu modelowego i umożliwienia biobankowania organoidów i sferoidów32,33. Biobankowanie całej oryginalnej struktury 3D pozwoli na wierniejsze odwzorowanie naturalnego stanu zdrowia lub choroby. Kluczowymi kwestiami są wygoda i niezawodność kriokonserwacji oraz rozmrażania organoidów/sferoidów. Odzysk organoidów po rozmrożeniu jest bardzo niski w większości obecnych technologii, często poniżej 50%. Jednak ostatnie badania wykazały obiecujące wyniki z lepszymi wskaźnikami przeżycia26,27,28,29. Lee i wsp. wykazali, że 78% komórek sferoidalnych przeżyło po krioprezerwacji, gdy użyli roztworu University of Wisconsin zawierającego 15% DMSO28. Współczynnik przeżywalności komórek wzrósł do 83% w badaniu Arai et al.29. Jednak wyniki po kriokonserwacji są znacznie naruszone, ponieważ struktury 3D nie mogą zachować tych samych właściwości i jakości. Ponadto odczynniki niezawierające surowicy są wymagane do dobrej praktyki produkcyjnej w warunkach farmaceutycznych i diagnostycznych. Tradycyjne przepływy pracy wykorzystują pożywkę zawierającą płodową surowicę bydlęcą (FBS) i dimetylosulfotlenek (DMSO) do metody powolnego zamrażania, z których obie wiążą się z upośledzeniami. FBS jest produktem pochodzenia zwierzęcego i może mieć różne wersje partii. DMSO jest bardzo skutecznym środkiem krioprotektantycznym, ale długotrwałe narażenie, zwłaszcza podczas rozmrażania, może powodować efekty cytotoksyczne30,31.
Ten artykuł opisuje również metodologię zamrażania/rozmrażania całych organoidów lub sferoidów jeszcze w hydrożelu. W badaniu zastosowano dwie formuły zamrażania organoidów i sferoidów: (1) 10% DMSO zawierające tradycyjny roztwór do zamrażania (FS) oraz (2) pożywkę do kriokonserwacji wolną od surowicy i DMSO. Ta pożywka do krioprezerwacji zawiera składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, które różnią się od obecnych formuł. Macierz zewnątrzkomórkowa składa się z dwóch głównych klas makrocząsteczek, proteoglikanów i białek włóknistych, które są niezbędne do fizycznego rusztowania składników komórkowych, ale także inicjują procesy wymagane do morfogenezy, różnicowania i homeostazy tkanek34,35,36,37,38,39,40. Kolageny zapewniają wytrzymałość na rozciąganie, regulują adhezję komórek, wspomagają chemotaksję i migrację oraz kierują rozwojem tkanek37. Ponadto włókna elastyny zapewniają odrzut tkankom, które są poddawane wielokrotnemu rozciąganiu38. Trzecie białko włókniste, fibronektyna, kieruje organizacją śródmiąższowej macierzy zewnątrzkomórkowej i odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w przyłączaniu komórek i pełni funkcję zewnątrzkomórkowego mechanoregulatora39. Du i wsp. wykazali krioprotekcyjne działanie hydrolizatu kolagenu kurzego na naturalny system modelowy aktomiozyny41. Ich wyniki sugerują, że hydrolizat kolagenu może hamować wzrost kryształków lodu, zmniejszać marnozalizację i utlenianie białek, podobnie jak w przypadku komercyjnych krioprotektantów, oraz zapewniać lepszą strukturę żelu po cyklach zamrażania i rozmrażania. Dlatego dodanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej do pożywki do kriokonserwacji zapewnia bezpieczniejsze i bardziej ochronne środowisko dla próbki oraz wspomaga gojenie się żywych struktur po zamrożeniu i rozmrożeniu.
Dodatkowo, niniejsze badanie opisuje prosty protokół oznaczania błon cytoplazmatycznych i jąder żywych organoidów i sferoidów, gdy są one jeszcze w hydrożelu.

<table><tbody><tr><td>Etanol bezwzględny (EtOH)</td><td>Merck</td><td>8187602500</td><td>Rozcieńczyć w dH2O, aby uzyskać roztwór 30%, 50%, 70%, 80%, 90% i 96% i przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>8222512500</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Alexa fluor kiełków pszenicy aglutynina i Hoechst&nbsp; w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>I34406</td><td>Image-IT LIVE Zestaw do etykietowania membrany plazmatycznej i jądrowej, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Alfa-1-Fetoproteina (AFP) Skoncentrowane i wstępnie rozcieńczone przeciwciało poliklonalne</td><td>Biocare Medical</td><td>CP 028 A</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyalbuminowe</td><td>Abcam</td><td>EPR20195</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C, Rozcieńczenie: 1:50</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-beta galaktozydazy, Kurczak poliklonalny</td><td>Abcam</td><td>134435</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C, Rozcieńczenie: 1:25</td></tr><tr><td>Anty-cytokeratyna 5</td><td>Abcam</td><td>53121</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C, Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Arginaza-1 Skoncentrowane i wstępnie rozcieńczone królicze przeciwciało monoklonalne</td><td>Biocare Medical</td><td>ACI 3058 A, B</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C, Rozcieńczenie: 1:50</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Rozpuścić w utrwalaczu Karnovsky'ego, aby uzyskać 2 mM CaCl2; przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek 8 (WST-8 / CCK8)</td><td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>601051</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 50 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Klasa II Szafa Bezpieczeństwa Mikrobiologicznego Bio II Advance Plus</td><td>Telstar</td><td>EN12469</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Panasonic</td><td>KM-CC17RU2</td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>G100-Cu</td><td>Ultracienkie sekcje umieszczane na siatkach; 100 linii/cal siatki kwadratowej</td></tr><tr><td>Suszarka punktu krytycznego</td><td>Leica</td><td>EM CPD300</td><td>Do suszenia próbek biologicznych do zastosowań SEM w absolutnej mieszaninie roztworu chromogenu acetonu</td></tr><tr><td>DAB/AEC &nbsp;</td><td>Sklep Sigma Aldrich</td><td>AEC101</td><td>pod adresem +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45&deg;, 40-US</td><td>Służy do ultracienkich przekrojów do TEM</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek do biologii molekularnej</td><td>Biofroxx</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety Pasteura</td><td>Nest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>Przechowywać pod numerem +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Eozyna Y Roztwór Alkoholowy</td><td>jasny slajd</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epon&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>45359-1EA-F</td><td>Zestaw do osadzania żywic epoksydowych, przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca z dodatkiem wzmacniającym</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3304</td><td>Przechowywać pod numerem +4 &; C</td></tr><tr><td>Roztwór do zamrażania (FS)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-F</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Nóż do szkła</td><td>Leica</td><td>EM KMR3</td><td>Do produkcji noży szklanych o grubości 8 mm</td></tr><tr><td>Paski do noży szklanych (rozmiar 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td><td>Leica</td><td>7890-08</td><td>Używaj do ultra- lub półcienkich przekrojów do wodnego roztworu</td></tr><tr><td>aldehydu glutarowego TEM, klasa EM, 25%&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16210</td><td>Rozcieńczyć w dH2O, aby uzyskać 2,5% roztwór i przechowywać w temperaturze +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Roztwór glicerolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 C, Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-kurze IgY (H + L) Wtórne, Alexa, 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32933</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Goat Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Drugorzędowe, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35502</td><td>Przechowywać w +4 &deg; C,&nbsp; Rozcieńczenie: 1:50</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L), DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84540</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C,&nbsp; Rozcieńczenie: 1:50</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) drugorzędowe, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35552</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C,&nbsp; Rozcieńczenie: 1:50</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) drugorzędowe, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84541</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Hematoksylina Harris&nbsp;</td><td>Jasny slajd</td><td>2.BS01-104-1000</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HepG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Przechowywać w zbiorniku azotu</td></tr><tr><td>Ludzki / szczurzy OV-6 Przeciwciało monoklonalne mysz IgG1 Klon # OV-6</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2020</td><td>przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>Matrigel, Matryca z membraną podstawną o wysokim stężeniu (HC), bez LDEV, 10 mL, Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel, matryca z membraną podstawną, bez LDEV, 10 mL, Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1413201</td><td>Geltrex, Hydrożel o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV Hydrogel</td></tr><tr><td>Biotechne</td><td>, R& D Systems</td><td>BME001-01</td><td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Utrwalacz</td><td></td><td></td> Karnovsky'ego<td>%2 PFA, %2,5 Aldehyd glutarowy w 0,15 M buforze kakodylowym, 2 mM CaCl2; przygotować na świeżo; stosować do TEM i Próbki SEM</td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma</td><td>11189-100G</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>asparaginianu ołowiu</td><td>Rozpuścić 40 mg kwasu asparaginowego w 10 ml ddH2O i dodać 66 mg azotanu ołowiu. Roztwór stabilizuje się w temperaturze 60 & stopni; C i dostosuj pH do 5; przygotuj świeży</td></tr><tr><td>azotan ołowiu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17900</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td> Czytnik mikropłytek <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wielofunkcyjne urządzenie Biotek Synergy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MD)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-M</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie jądrowo-DNA</td><td>Invitrogen</td><td>H3569</td><td>Hoechst 33258, Pentahydrat (bis-benzimid) - 10 mg/ml roztwór w wodzie, przechowywać w temperaturze +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Barwienie jądrowo-DNA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62248</td><td>DAPI solution, Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu (OsO4), 4%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19190</td><td>Rozcieńczyć w dH2O, aby uzyskać 2% roztwór; przechowywać w temperaturze +4 &deg; C i w hermetycznym pojemniku; chronić lekkie</td></tr><tr><td>przeciwciało Ov6</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB2020</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu (PFA), 4%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1.04005.1000</td><td>Rozpuścić 4% PFA w dH2O i zagotować, ostudzić i podwielokrotnieć; przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), tabletki</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> po utrwalaniu<td>%2 OsO4, %2,5 Żelazocyjanek potasu w dH2O; przygotować świeży</td></tr><tr><td>wodny roztwór żelazocyjanku potasu, 5%&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>26603-01</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Primovert - Mikroskop odwróconego jasnego pola - ZEISS</td><td>Zeiss Nr</td><td>pozycji: 491206-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z okrągłym dnem, 2 ml</td><td>Nest</td><td>620611</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa z przystawką STEM</td><td>Zeiss</td><td>GeminiSEM 500</td><td>Do skaningowych mikrofotografii elektronowych używamy detektora Inlens Secondary Electron (SE) o napięciu 2-3 kV oraz detektora aSTEM o napięciu 30 kV do transmisyjnych mikrofotografii elektronowych.</td></tr><tr><td>Antypoliwalentny zestaw laboratoryjny SensiTek HRP</td><td>ScyTek Laboratories</td><td>SHP125</td><td>Sklep pod kątem +4 stopni; C</td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu, 0,4 M, pH 7,2</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>11655</td><td>Rozcieńczyć w dH2O, aby uzyskać 0,2 M i przechowywać w temperaturze +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało ATPazy sodowo-potasowej alfa 1 [M7-PB-E9]</td> <td>GeneTex</td><td>GTX22871</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>Roztwór do znakowania immunofluorescencyjnego (S-IF)</td><td>Cellorama Cellorama</td><td>CellO-IF</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & st.; C</td></tr><tr><td>Roztwór do immunohistochemii (S-IHC)</td><td>Cellorama Cellorama</td><td>CellO-P</td><td>Przechowywać w temperaturze +4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Urządzenie do przycinania próbek</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td>Do przygotowania bloku próbki epon do ultramikrotomu</td></tr><tr><td>Powlekarka do napylania</td><td>Leica</td><td>EM ACE200</td><td>Pokryj próbki SEM złotem / palladem 6 nm przez 90 s</td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd (TCH)</td> <td>Sigma</td><td>223220-5G</td><td>Rozcieńcz w dH2O, aby uzyskać 0,5% roztwór i przefiltrować 0,22 i mikro; m filtr membranowy; przechowywać w RT; przygotuj świeży</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra żelowy super klej</td><td>Pattex</td><td>PSG2C</td><td>Do kleju spolimeryzowany blok epon z próbką do uchwytu blok epon</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Do przygotowania wysokiej jakości ultra- lub półcienkich przekrojów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)</td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 10 i mikro; L</td><td>Nest</td><td>171215-1101</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 1000 i mikro; L</td><td>Isolab</td><td>L-002</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki do pipet, 200 i mikro; L&nbsp;</td><td>Nest</td><td>110919HA01</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22400</td><td>Rozcieńczyć w dH2O, aby uzyskać 2% roztwór i przefiltrować 0,22 i mikro; m filtr membranowy; przechowywać szczelnie zamknięty magazyn kontenerowy w RT</td></tr></tbody></table>

hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Organoidy i sferoidy, trójwymiarowe struktury hodowlane w laboratoriach hodowli komórkowych, stają się coraz bardziej uznawane za lepsze modele w porównaniu do dwuwymiarowych modeli hodowlanych, ponieważ lepiej naśladują ludzkie ciało i mają przewagę nad badaniami na zwierzętach. Jednak badania te często napotykają problemy z odtwarzalnością i spójnością. Podczas długich procesów eksperymentalnych - z przenoszeniem organoidów i sferoidów między różnymi naczyniami do hodowli komórkowych, pipetowaniem i wirowaniem - te podatne i delikatne struktury do hodowli 3D są często uszkadzane lub tracone. Ostatecznie ma to znaczący wpływ na wyniki, ponieważ struktury 3D nie mogą zachować tych samych cech i jakości. Opisane tutaj metody minimalizują te stresujące etapy i zapewniają bezpieczne i spójne środowisko dla organoidów i sferoidów w całej sekwencji przetwarzania, gdy nadal znajdują się one w hydrożelu w urządzeniu wielofunkcyjnym. Naukowcy mogą hodować, zamrażać, rozmrażać, przetwarzać, barwić, etykietować, a następnie badać strukturę organoidów lub sferoidów za pomocą różnych zaawansowanych technologicznie instrumentów, od mikroskopów konfokalnych po elektronowe, za pomocą jednego wielofunkcyjnego urządzenia. Technologia ta poprawia odtwarzalność, wiarygodność i trafność badań, przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego i ochronnego środowiska dla struktur rosnących w 3D podczas przetwarzania. Ponadto wyeliminowanie stresujących czynności minimalizuje błędy w obsłudze, skraca czas potrzebny na ich wykonanie i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia.

Niniejszy artykuł przedstawia urządzenie wielozadaniowe (MD) oraz uzupełniające metodologie do hodowli, mrożenia, rozmrażania, barwienia histologicznego, barwienia immunohistochemicznego, znakowania immunofluorescencyjnego, powlekania i przetwarzania całych organoidów lub sferoidów wewnątrz hydrożelu, w jednym, unikalnie zaprojektowanym środowisku. Obecne badanie zostało zaprojektowane w celu przygotowania sferoidów raka wątroby HepG2 w 35 kroplach hydrożelu w 35 urządzeniach MD. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powt...

Niniejsze badanie opisuje metodologie hodowli, zamrażania, rozmrażania, przetwarzania, barwienia, etykietowania i badania całych sferoid i organoidów pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w wielofunkcyjnym urządzeniu.

Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoidy i sferoidy, jako bardzo delikatne, ulegają poważnym uszkodzeniom podczas przenoszenia. Nasz protokół zapewnia, że te struktury do uprawy 3D pozostają nienaruszone podczas różnych procesów, zwiększając w ten sposób dokładność, odtwarzalność, niezawodność i powtarzalność. Badacz może hodować, zamrażać, rozmrażać, przetwarzać, barwić, etykietować i badać całe organoidy i sferoidy pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w jednym wielofunkcyjnym urządzeniu.Umożliwia stworzenie modelu choroby i śledzenie kolejnych kroków w jednym wielofunkcyjnym urządzeniu. Technologia ta zapewnia większą dokładność podczas badania biomarkerów w celu diagnozowania i prognozowania chorób. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu uprawy 3D, w tym organoidów, sferoidów, pojedynczych komórek lub organizmów żywych.Aby rozpocząć hodowlę organoidów lub sferoidów, umieść odpowiednio rozmrożony hydrożel na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut. Probówkę zawierającą osad raka wątrobowokomórkowego lub komórki HEPG2 należy również przechowywać na lodzie. Następnie umieść 30 do 35 mikrolitrów 100% hydrożelu we wnęce wstępnie podgrzanego urządzenia wielofunkcyjnego, aby utworzyć kroplę żelu, umieść 10 000 komórek HEPG2 w środku górnej części kropli hydrożelu i inkubuj konfigurację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po inkubacji przykryj kroplę hydrożelu 200 mikrolitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Umieść pokrywę na urządzeniu prawidłowo, umożliwiając przepływ gazu, przed umieszczeniem go w inkubatorze. Co drugi dzień karm komórki 200 mikrolitrami DMEM zawierającymi 10% FBS.Sprawdź wzrost sferoid pod odwróconym mikroskopem. Przed rozpoczęciem znakowania immunofluorescencyjnego organoidów należy rozgrzać wymagane podłoża i roztwory do 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą kroplę hydrożelu przed dodaniem 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu podgrzanego do 37 stopni Celsjusza i utrwalić ją, umieszczając w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 30 minut.Następnie odessać utrwalacz i przemyć roztwór do znakowania immunofluorescencyjnego lub SIF, wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza trzy razy przez 10 minut każdy. Dodaj wodę destylowaną do obszaru otaczającego niszę, aby zapewnić wilgotność przed przystąpieniem do kolejnych kroków. Odessać SIF otaczając kroplę hydrożelu i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w SIF do hydrożelu przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut.Następnie odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć roztworem SIF podgrzanym do 37 stopni Celsjusza trzy razy przez 10 minut każdy. Po przepłukaniu odessać pozostały SIF i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu przeciwciał drugorzędowych w SIF do hydrożelu. Inkubuj hydrożel w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 do 60 minut.Po inkubacji odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć kroplę hydrożelu PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza trzy razy w ciemności przez 10 minut każdy. Następnie odessać resztki PBS i inkubować hydrożel ze 100 mikrolitrami barwienia jądrowego DNA zawierającego pożywkę montażową lub glicerol w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Napełnij niszę glicerolem, aby uniknąć wysuszenia, przed szczelnym zamknięciem wielofunkcyjnego urządzenia zawierającego hydrożel.Aby zbadać organoidy za pomocą mikroskopii konfokalnej, należy ustawić parametry mikroskopu zgodnie z instrukcjami podanymi w manuskrypcie. Aby zamrozić organoidy, odessać pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu do zamrażania i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Zamknij szczelnie pokrywę urządzenia przed umieszczeniem go w piankowym pudełku.Umieść to piankowe pudełko w innym piankowym pudełku i szczelnie zamknij oba piankowe pudełka. Trzymaj pudełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie pozostaw je na noc w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu przechowywania organoidów przez okres dłuższy niż sześć miesięcy, należy wyjąć z pudełek urządzenie wielofunkcyjne zawierające organoidy i przenieść je do zbiornika z ciekłym azotem.Aby rozmrozić organoidy, należy wyjąć wielofunkcyjne urządzenie zawierające próbkę z zamrażarki lub zbiornika z ciekłym azotem i umieścić je bezpośrednio w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu delikatnie zaaspiruj mieszaninę pożywki i roztworu zamrażającego przed dodaniem świeżej pożywki i przystąpieniem do obrazowania hydrożelu organoidowego w całości. W obrazowaniu na żywo rosnące organoidy wewnątrz hydrożelu stały się widoczne od trzech do pięciu dni po wprowadzeniu osadu komórkowego, szczególnie na obrzeżach kopuły hydrożelowej.Pokazano tutaj szereg czasowy obrazów na różnych poziomach hydrożelu zawierającego sferoidy pod mikroskopem z kontrastem odwróconym fazowym. Obrazy z mikroskopii konfokalnej żywych organoidów w całości po barwieniu na żywo błony komórkowej i jądra wykazały podobną gęstość znakowania na obrzeżach i w środku. Co więcej, znakowanie immunofluorescencyjne steroidów z całą górą można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą jednego przeciwciała, dwóch przeciwciał, a także trzech przeciwciał, eliminując potrzebę dodatkowych etapów leczenia.Reprezentatywna analiza wykazała obecność dwóch organoidów dróg oddechowych znakowanych immunofluorescencyjnie w urządzeniu. Obrazy SEM całych sferoid w urządzeniu wielofunkcyjnym oraz 10 obrazów przekrojonych steroidów wykazały dobrze zachowaną architekturę 3D sferoid, organelli cytoplazmatycznych i innych ultrastrukturalnych cech komórkowych, wykazując skuteczność opisanego protokołu. Nieregularność na granicach kopuły hydrożelowej była widoczna po zamrożeniu próbek.Jednak rozmiar i okrągłość sferoid pozostały podobne. Migrację komórek na powierzchni hodowli obserwowano po rozmrożeniu zamrożonych próbek. Technika jest bardzo prosta.Jednak badacz powinien być bardzo delikatny podczas zasysania lub dodawania jakichkolwiek płynów otaczających kroplę hydrożelu, aby zapobiec uszkodzeniu próbki. Badacz może przyjrzeć się tej samej próbce w jednym urządzeniu za pomocą zaawansowanego technologicznie mikroskopu i przeprowadzić badanie korelacyjne.

culturing-freezing-processing-imaging-entire-organoids-spheroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

W tym miejscu opisano szczegółowe metody generowania, utrzymywania i charakteryzowania ludzkich organoidów jelita cienkiego i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metody te mają na celu poprawę odtwarzalności, rozszerzenie skalowalności i skrócenie czasu pracy wymaganego do posiewu i pasażowania organoidów.

Wytwarzanie, utrzymanie i charakterystyka ludzkich organoidów jelitowych i okrężnicy pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Poznaj protokół hodowli, zamrażania i obrazowania całych organoidów w hydrożelu przy użyciu wielofunkcyjnego urządzenia. Metoda zachowuje integralność struktur 3D i umożliwia niezawodną analizę biomarkerów.

Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Przeglądaj więcej filmów