Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Organoidy i sferoidy, jako bardzo delikatne, ulegają poważnym uszkodzeniom podczas przenoszenia. Nasz protokół zapewnia, że te struktury do uprawy 3D pozostają nienaruszone podczas różnych procesów, zwiększając w ten sposób dokładność, odtwarzalność, niezawodność i powtarzalność. Badacz może hodować, zamrażać, rozmrażać, przetwarzać, barwić, etykietować i badać całe organoidy i sferoidy pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w jednym wielofunkcyjnym urządzeniu.

Umożliwia stworzenie modelu choroby i śledzenie kolejnych kroków w jednym wielofunkcyjnym urządzeniu. Technologia ta zapewnia większą dokładność podczas badania biomarkerów w celu diagnozowania i prognozowania chorób. Metodę tę można zastosować do dowolnego systemu uprawy 3D, w tym organoidów, sferoidów, pojedynczych komórek lub organizmów żywych.

Aby rozpocząć hodowlę organoidów lub sferoidów, umieść odpowiednio rozmrożony hydrożel na lodzie w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut. Probówkę zawierającą osad raka wątrobowokomórkowego lub komórki HEPG2 należy również przechowywać na lodzie. Następnie umieść 30 do 35 mikrolitrów 100% hydrożelu we wnęce wstępnie podgrzanego urządzenia wielofunkcyjnego, aby utworzyć kroplę żelu, umieść 10 000 komórek HEPG2 w środku górnej części kropli hydrożelu i inkubuj konfigurację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji przykryj kroplę hydrożelu 200 mikrolitrami zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium lub DMEM firmy Dulbecco, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Umieść pokrywę na urządzeniu prawidłowo, umożliwiając przepływ gazu, przed umieszczeniem go w inkubatorze. Co drugi dzień karm komórki 200 mikrolitrami DMEM zawierającymi 10% FBS.

Sprawdź wzrost sferoid pod odwróconym mikroskopem. Przed rozpoczęciem znakowania immunofluorescencyjnego organoidów należy rozgrzać wymagane podłoża i roztwory do 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej otaczającą kroplę hydrożelu przed dodaniem 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu podgrzanego do 37 stopni Celsjusza i utrwalić ją, umieszczając w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 30 minut.

Następnie odessać utrwalacz i przemyć roztwór do znakowania immunofluorescencyjnego lub SIF, wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza trzy razy przez 10 minut każdy. Dodaj wodę destylowaną do obszaru otaczającego niszę, aby zapewnić wilgotność przed przystąpieniem do kolejnych kroków. Odessać SIF otaczając kroplę hydrożelu i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w SIF do hydrożelu przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut.

Następnie odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć roztworem SIF podgrzanym do 37 stopni Celsjusza trzy razy przez 10 minut każdy. Po przepłukaniu odessać pozostały SIF i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu przeciwciał drugorzędowych w SIF do hydrożelu. Inkubuj hydrożel w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 30 do 60 minut.

Po inkubacji odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć kroplę hydrożelu PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza trzy razy w ciemności przez 10 minut każdy. Następnie odessać resztki PBS i inkubować hydrożel ze 100 mikrolitrami barwienia jądrowego DNA zawierającego pożywkę montażową lub glicerol w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Napełnij niszę glicerolem, aby uniknąć wysuszenia, przed szczelnym zamknięciem wielofunkcyjnego urządzenia zawierającego hydrożel.

Aby zbadać organoidy za pomocą mikroskopii konfokalnej, należy ustawić parametry mikroskopu zgodnie z instrukcjami podanymi w manuskrypcie. Aby zamrozić organoidy, odessać pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu do zamrażania i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Zamknij szczelnie pokrywę urządzenia przed umieszczeniem go w piankowym pudełku

Umieść to piankowe pudełko w innym piankowym pudełku i szczelnie zamknij oba piankowe pudełka. Trzymaj pudełko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie pozostaw je na noc w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu przechowywania organoidów przez okres dłuższy niż sześć miesięcy, należy wyjąć z pudełek urządzenie wielofunkcyjne zawierające organoidy i przenieść je do zbiornika z ciekłym azotem.

Aby rozmrozić organoidy, należy wyjąć wielofunkcyjne urządzenie zawierające próbkę z zamrażarki lub zbiornika z ciekłym azotem i umieścić je bezpośrednio w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu delikatnie zaaspiruj mieszaninę pożywki i roztworu zamrażającego przed dodaniem świeżej pożywki i przystąpieniem do obrazowania hydrożelu organoidowego w całości. W obrazowaniu na żywo rosnące organoidy wewnątrz hydrożelu stały się widoczne od trzech do pięciu dni po wprowadzeniu osadu komórkowego, szczególnie na obrzeżach kopuły hydrożelowej.

Pokazano tutaj szereg czasowy obrazów na różnych poziomach hydrożelu zawierającego sferoidy pod mikroskopem z kontrastem odwróconym fazowym. Obrazy z mikroskopii konfokalnej żywych organoidów w całości po barwieniu na żywo błony komórkowej i jądra wykazały podobną gęstość znakowania na obrzeżach i w środku. Co więcej, znakowanie immunofluorescencyjne steroidów z całą górą można z powodzeniem przeprowadzić za pomocą jednego przeciwciała, dwóch przeciwciał, a także trzech przeciwciał, eliminując potrzebę dodatkowych etapów leczenia.

Reprezentatywna analiza wykazała obecność dwóch organoidów dróg oddechowych znakowanych immunofluorescencyjnie w urządzeniu. Obrazy SEM całych sferoid w urządzeniu wielofunkcyjnym oraz 10 obrazów przekrojonych steroidów wykazały dobrze zachowaną architekturę 3D sferoid, organelli cytoplazmatycznych i innych ultrastrukturalnych cech komórkowych, wykazując skuteczność opisanego protokołu. Nieregularność na granicach kopuły hydrożelowej była widoczna po zamrożeniu próbek.

Jednak rozmiar i okrągłość sferoid pozostały podobne. Migrację komórek na powierzchni hodowli obserwowano po rozmrożeniu zamrożonych próbek. Technika jest bardzo prosta.

Jednak badacz powinien być bardzo delikatny podczas zasysania lub dodawania jakichkolwiek płynów otaczających kroplę hydrożelu, aby zapobiec uszkodzeniu próbki. Badacz może przyjrzeć się tej samej próbce w jednym urządzeniu za pomocą zaawansowanego technologicznie mikroskopu i przeprowadzić badanie korelacyjne.