Name: Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Odkryj metodę bezbarwnego obrazowania 3D organoidów jelitowych przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności i uczenia maszynowego. Technika umożliwia nieinwazyjną analizę odpowiedzi na leki w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei finansowany przez rząd koreański (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), Koreański Instytut Postępu Technologii (KIAT) w ramach programu International Cooperative R&D (P0028463) oraz grant Koreańskiego Funduszu Medycyny Regeneracyjnej (KFRM) finansowany przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT oraz Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej) (21A0101L1-12). Akwizycja danych została przeprowadzona przez M.J.L. i J.H.L., przy czym J.H.L. był odpowiedzialny za przetwarzanie danych, a J.M.C. za analizę danych. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania manuskryptu. Serdecznie dziękujemy ChulMin Oh i Chungha Lee za cenne rozmowy techniczne i pomoc w przygotowaniu figury.

UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, przyrządów i oprogramowania użytego w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Jako alternatywę można stosować równoważne produkty różnych producentów. Schematyczny proces całego protokołu przedstawiono na rysunku 1.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej sIO<ol>
		<li>Przygotuj dostępną w handlu pożywkę hodowlaną zgodnie z instrukcjami producenta. Wysterylizuj pożywkę hodowlaną, filtrując ją przez jednostkę filtrującą 0,22 μm. UWAGA: Jeśli pożywka jest przygotowywana całkowicie w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych, a wszystkie składniki są wstępnie sterylizowane (np. dostarczane w sterylnych butelkach i fiolkach), wówczas filtracja przez filtr 0,22 μm może nie być absolutnie konieczna.</li>
		<li>Podaniec 15 ml przygotowanej pożywki do sterylnych probówek do przechowywania. Podgrzej podaną pożywkę do temperatury pokojowej (15 - 25 °C) przed użyciem w hodowli organoidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrażanie zapasów sIO<ol>
		<li>Zamrożony materiał organoidowy należy szybko rozmrozić w ciągu 2 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrożoną zawiesinę organoidów do probówki do mikrowirówki i wirować przy 150 x g przez 3 minuty w celu osadzenia organoidów.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant, aby wypłukać DMSO, minimalizując potencjalne efekty cytotoksyczne.</li>
		<li>Dodać pożywkę i świeżą macierz zewnątrzkomórkową (ECM) w stosunku 1:4 i delikatnie odpipetować, aby zapewnić równomierne ponowne zawieszenie osadu. Dozować 15 μl na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Utrzymuj ECM na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.</li>
		<li>Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po polimeryzacji ostrożnie dodaj 200 μl świeżej pożywki do każdej studzienki. UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z różnymi komercyjnymi naczyniami do obrazowania i płytkami studzienkowymi. Dostosuj głośność nośnika w zależności od typu studzienki, aby upewnić się, że kopuła ECM jest całkowicie zanurzona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekazywanie sIO UWAGA: Organoidy mają tendencję do przylegania do końcówek pipet. Aby zminimalizować przywieranie, należy wstępnie zwilżyć końcówki pipet pożywką.<ol>
		<li>Odessać zużyte podłoże. Dodać 200 μl roztworu do odzyskiwania komórek do każdego dołka i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby ułatwić degradację ECM i pobieranie organoidów.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę organoidu przez delikatne pipetowanie i przenieść ją do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Aby przejść jako pojedyncze komórki, wykonaj jedną z następujących metod dysocjacji:<ol>
			<li>Metoda enzymatyczna: Dodać 100 μl roztworu do dysocjacji pojedynczych komórek do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% inkubatorze CO2 przez 1-2 min. Dodaj 150 μl pożywki do zneutralizowania. Wykonaj pipetowanie lub delikatne stukanie. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant, pozostawiając tylko osad. UWAGA: Unikaj nadmiernej inkubacji, ponieważ długotrwała ekspozycja może być bardzo szkodliwa dla komórek.</li>
			<li>Dysocjacja mechaniczna: Zawiesić osad w 200 μl pożywki hodowlanej. Używając pipety P200, pipetuj w górę i w dół 20x-30x, aby mechanicznie zdysocjować organoidy na mniejsze fragmenty lub pojedyncze komórki. Wirować przy 150 x g przez 3 minuty, następnie odessać supernatant i zachować osad.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodaj pożywkę i świeży ECM w stosunku 1:4 i delikatnie odpipetować, aby zapewnić równomierne ponowne zawieszenie osadu. Dozować 15 μl na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki.</li>
		<li>Umieścić płytkę do góry dnem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM.</li>
		<li>Po polimeryzacji dodaj 200 μl świeżej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i wypełnij puste studzienki zewnętrzne PBS, aby zapobiec parowaniu. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2-3 dni i co tydzień przepuszczać organoidy. Dostosuj interwał pasażu zgodnie z żądanym rozmiarem organoidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie farmakologiczne<ol>
		<li>Przygotować 10 mM roztwór podstawowy cisplatyny, rozpuszczając 3,00 mg cisplatyny w proszku (MW ≈ 300,05 g/mol) w 1 ml DMSO. Krótko odwiruj i chroń roztwór przed światłem za pomocą bursztynowych probówek lub owijając je folią aluminiową.</li>
		<li>Aby przygotować pożywkę zabiegową, należy rozcieńczyć 10 mM cisplatyny w stosunku 1:1 000 w kompletnej pożywce hodowlanej sIO, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM cisplatyny i 0,1% DMSO.</li>
		<li>Do kontroli nośnika należy przygotować 0,1% DMSO w pożywce hodowlanej, aby dopasować końcowe stężenie DMSO bez cisplatyny.</li>
		<li>Usunąć zużytą pożywkę z kultur sIO i delikatnie zastąpić ją pożywką zawierającą 10 μM cisplatynę lub pożywką kontrolną tylko DMSO.</li>
		<li>Po poddaniu działaniu substancji należy przenieść próbki do inkubatora systemu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie holotomograficzne o niskiej koherentności za pomocą oprogramowania operacyjnego
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki do obrazowania<ol>
		<li>Dozować 15 μl kopuły organoid-ECM na naczynie obrazowania #1.5 z dnem szkiełka nakrywkowego, postępując zgodnie z procedurą opisaną w krokach 1.3.1-1.3.4. Umieść każdą kopułę w naczyniu jak najbliżej środka, aby uzyskać optymalne obrazowanie.</li>
		<li>Przed polimeryzacją inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby organoidy mogły osiąść na dnie.</li>
		<li>Umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę w celu polimeryzacji ECM. Następnie delikatnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby całkowicie zanurzyć organoidy. UWAGA: Dostosuj objętość podłoża, aby upewnić się, że organoidy są całkowicie zanurzone zgodnie z rozmiarem naczynia do obrazowania z dnem nakrywkowym.</li>
		<li>Po 5 dniach od przejścia należy przemyć próbkę 2x-3x PBS bezpośrednio przed obrazowaniem, aby usunąć zanieczyszczenia i zredukować artefakty optyczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja obrazowania<ol>
		<li>Włącz kontroler środowiskowy, aby utrzymać żywotność próbki. Sterownik komory automatycznie dostosowuje temperaturę do 37 °C, a stężenie CO2 do 5%.</li>
		<li>Naciśnij przycisk drzwi z przodu instrumentu, aby otworzyć drzwi. Dodaj wodę, aby dobrze utworzyć cienką warstwę wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Umieść naczynie obrazowania w odpowiednim uchwycie naczynia, włóż je do komory obrazowania i zabezpiecz za pomocą kołka, aby zapobiec przemieszczaniu się. Upewnij się, że naczynie jest mocno przymocowane do uchwytu naczynia bez przechylania.</li>
		<li>Zamknij drzwiczki instrumentu za pomocą przycisku drzwi , aby zablokować zakłócenia światła zewnętrznego.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie TomoStudio X i zaloguj się. Kliknij przycisk Start , aby otworzyć okno główne.</li>
		<li>Kliknij Dodaj projekt w lewym górnym rogu i przypisz parametry eksperymentalne (np. nazwę projektu, typ medium, typ próbki itp.). Panel próbki zostanie utworzony automatycznie. Upewnij się, że przypisano odpowiedni typ podłoża do użycia odpowiedniego RI w eksperymencie.</li>
		<li>Kliknij na Żądane studzienki w panelu i kliknij Utwórz u góry, aby zarejestrować studzienki jako próbki.</li>
		<li>Kliknij Ustawienia ROI w prawym górnym rogu, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) w daniu. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk Uruchom eksperyment w prawym dolnym rogu, aby otworzyć okno pobierania obrazu.</li>
		<li>Kliknij przycisk Załaduj statek w prawym górnym rogu. Pojawi się obraz w jasnym polu. Dostosuj pozycję Z za pomocą przycisków +Z i -Z , aby ustawić ostrość.</li>
		<li>Na karcie Single imaging (Pojedyncze obrazowanie) dostosuj rozmiar ROI. Uchwyć organoidy w polu widzenia 160 μm x 160 μm i uzyskaj osiowe stosy o głębokości do 140 μm. W przypadku większych organoidów uzyskaj wiele tomogramów RI i zszyj obrazy, zaznaczając pole wyboru Obrazowanie kafelkowe na dole.</li>
		<li>Przejdź do zakładki Obrazowanie poklatkowe, aby skonfigurować obrazowanie długoterminowe. Ustaw czas trwania i czas interwału zgodnie z potrzebami. W tym eksperymencie obrazowanie poklatkowe wykonywano w odstępach 10-minutowych przez okres 24 godzin, a analizę prowadzono w odstępach 2-godzinnych przez ten sam czas.</li>
		<li>Kliknij ikonę Skanuj , aby przechwycić bieżącą lokalizację zwrotu z inwestycji. Ręcznie wyśrodkuj kopułkę ECM za pomocą obrazowania w jasnym polu. Kliknij przycisk BF , aby dostosować intensywność i wartości ekspozycji dla obrazowania w jasnym polu.</li>
		<li>Wybierz ROI , przesuwając pole ROI, które pojawi się w panelu Podgląd. Po znalezieniu żądanego zwrotu z inwestycji kliknij przycisk Dodaj punkt na dole. Pojawi się lista punktów obrazowania.</li>
		<li>Kliknij przycisk Pobierz , aby rozpocząć obrazowanie. Zostaną pozyskane surowe dane obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu UWAGA: Ten proces generuje wspólny plik Tomocube (TCF) z surowych danych obrazu. Surowe dane obrazu muszą zostać przetworzone na plik TCF, który zawiera wiele typów obrazów, takich jak tomogram RI i projekcja maksymalnej intensywności. Tomogram RI reprezentuje rozkład RI 3D próbki, a projekcja maksymalnej intensywności pokazuje najwyższą wartość RI dla każdej pozycji bocznej w płaszczyźnie XY.<ol>
		<li>Przeciągnij i upuść surowe pliki obrazów na serwer przetwarzania HTX. Kliknij przycisk Przetwarzaj , aby wygenerować plik TCF z pliku obrazu RAW.</li>
		<li>Aby wyświetlić tomogramy RI wygenerowane w pliku TCF, użyj programu TomoAnalysis Viewer, MATLAB lub Python. Aby wyświetlić plik TCF w programie MATLAB, użyj funkcji takich jak h5info i h5read. Podobnie w języku Python użyj pakietu h5py do odczytywania plików H5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Segmentacja obrazów oparta na uczeniu maszynowym<ol>
		<li>Eksportuj plik obrazu TCF do formatu HDF5 (Supplementary Coding File 1), aby upewnić się, że dane są w formacie wielowymiarowym zgodnym z ilastik.</li>
		<li>Otwórz ilastik i przejdź do Plik > Nowy projekt. Wybierz opcję Klasyfikacja pikseli w sekcji Przepływy pracy segmentacji. Zapisz plik projektu w wyznaczonym katalogu.</li>
		<li>Załaduj plik HDF5, przechodząc do 1. Zakładka Dane wejściowe. Kliknij przycisk Add New File (Dodaj nowy plik), wybierz odpowiedni zestaw danych H5 i upewnij się, że zostały przypisane właściwe kanały obrazów.</li>
		<li>Przejdź do punktu 2. Zakładka Wybór funkcji, aby wybrać odpowiednie cechy (Kolor/Intensywność, Krawędź, Tekstura) w celu optymalizacji segmentacji. UWAGA: Wybór funkcji może się różnić w zależności od zestawu danych i charakterystyki obrazu. Na potrzeby bieżącej analizy wybrane cechy obejmowały: Kolor/Intensywność (σ = 1,60), Krawędź (σ = 3,50) i Tekstura (σ = 1,60). W zależności od złożoności obrazu może być wymagana optymalizacja oparta na podejściu heurystycznym. Alternatywnie, funkcja Zasugeruj funkcje > Uruchom wybór funkcji w ilastik może być użyta do zidentyfikowania optymalnego zestawu parametrów.</li>
		<li>W 3. Zakładka Trening, oznacz regiony organoidowe i nieorganoidalne, stosując pociągnięcia pędzlem o różnych kolorach. Aby zwiększyć wierność segmentacji, ostrożnie opisz regiony wokół granic.</li>
		<li>Kliknij opcję Aktualizacja na żywo , aby wyświetlić podgląd wyników segmentacji i w razie potrzeby wprowadzić poprawki.</li>
		<li>Przejdź do 4. Eksport prognoz. W polu Wybór źródła wybierz opcję Prosta segmentacja , aby wyeksportować przewidywania oznaczone etykietami. Kliknij przycisk Eksportuj wszystko, upewniając się, że format wyjściowy jest ustawiony na .h5 lub .tiff, w zależności od wymagań dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowa analiza cech UWAGA: Ten krok protokołu jest wykonywany w programie MATLAB, a każda procedura jest szczegółowo opisana w Dodatkowym pliku kodowania 2.<ol>
		<li>Łącząc tomogram RI z obrazem maski, utwórz zamaskowany obraz RI, który zawiera tylko region organoidu.</li>
		<li>Korzystając z zamaskowanego obrazu RI, oblicz parametry ilościowe, takie jak objętość organoidów, gęstość białka i zawartość białka.<ol>
			<li>Objętość: Oblicz całkowitą objętość organoidu, mnożąc liczbę pikseli w masce podzielonej na segmenty przez rozdzielczość pikseli dla X, Y i Z. Oblicz liczbę pikseli, zliczając wszystkie wartości wokseli w tablicy masek oznaczonych organoidami, używając wbudowanej funkcji MATLAB Suma. UWAGA: Rozdzielczość pikseli jest określana przez system obrazowania i można ją znaleźć w grupie Atrybuty danych > 3D w strukturze HDF5.</li>
			<li>Gęstość białka: Oblicz gęstość białka, odejmując wartość średniego RI od średniej organoidu RI i dzieląc ją przez przyrost współczynnika załamania białka.<ol>
				<li>Średni RI: Przed analizą zmierz RI otaczającego podłoża za pomocą refraktometru.</li>
				<li>Średnia wartość RI organoidu: Określ średnią wartość RI organoidu, uśredniając wartości RI wokseli znajdujących się w masce organoidu.</li>
				<li>Przyrost indeksu załamania światła białka (α): Użyj wcześniej zgłoszonej stałej empirycznej uzyskanej z badań przyrostu indeksu załamania światła.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Zawartość białka: Obliczyć całkowitą zawartość białka, mnożąc objętość oznaczoną w kroku 3.2.2.1 przez gęstość białka otrzymaną w kroku 3.2.2.2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Arjmand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancement+of+organoid+technology+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Eng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Advancement of organoid technology in regenerative medicine.</a> Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+grafting+of+organoids+of+stem%2Fprogenitors+into+solid+organs+can+correct+genetic-based+disease+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states.</a> Biomaterials. 288, 121647(2022).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence-enabled+quantitative+phase+imaging+methods+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences.</a> Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).</li>
<li>Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+application+and+perspectives+of+organoid+imaging+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Present application and perspectives of organoid imaging technology.</a> Bioengineering. 9 (3), 121(2022).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).</li>
<li>Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+protocol+for+formalin-fixed+paraffin-embedded+organoids+and+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids.</a> Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).</li>
<li>Badder, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+colorectal+cancer+organoids+identifies+responses+to+Tankyrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors.</a> PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).</li>
<li>Lacin, M. E., Yildirim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+multiphoton+microscopy+in+imaging+cerebral+and+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids.</a> Front Neurosci. 18, 1360482(2024).</li>
<li>Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+trends+and+perspectives+in+cerebral+organoids+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fronti+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis.</a> Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).</li>
<li>Smits, L. M., Schwamborn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+organoids%3A+a+new+tool+to+investigate+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+in+ex+vivo+light+sheet+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy.</a> Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).</li>
<li>Masson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in-depth+imaging+of+optically+cleared+thick+samples+using+an+adaptive+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM.</a> Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Renner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+automated+high-throughput+workflow+for+3D-based+chemical+screening+in+human+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids.</a> elife. 9, e52904(2020).</li>
<li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads%3A+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).</li>
<li>Susaki, E., Takasato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+Extending+the+Utility+of+Three-Dimensional+Organoids+by+Tissue+Clearing+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).</li>
<li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).</li>
<li>Kim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Meth+Primers%22%5BJournal%5D)">Holotomography.</a> Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).</li>
<li>Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+determination+of+semi-transparent+objects+from+holographic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Comm%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data.</a> Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+holotomography+and+deep+learning+for+rapid+detection+of+NPM1+mutations+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML.</a> Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+evaluation+of+characteristic+properties+of+asthma-derived+eosinophils+using+optical+diffraction+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+BiophysRes+Comm%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography.</a> Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+demixing+transition+of+low-density+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated demixing transition of low-density condensates.</a> Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).</li>
<li>Kim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+species+identification+of+pathogenic+bacteria+from+a+minute+quantity+exploiting+three-dimensional+quantitative+phase+imaging+and+artificial+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network.</a> Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).</li>
<li>Hugonnet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+label-free+volumetric+holographic+histopathology+of+thick-tissue+slides+with+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Photon%22%5BJournal%5D)">Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution.</a> Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).</li>
<li>Lee, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+high-resolution+imaging+of+live+unlabeled+small+intestinal+organoids+via+low-coherence+holotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography.</a> Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis.</a> Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Sbrana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+three-dimensional+imaging+and+quantitative+analysis+of+living+fibroblasts+and+myofibroblasts+by+holotomographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy.</a> Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).</li>
<li>Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+distribution+of+protein+refractive+index+increments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">On the distribution of protein refractive index increments.</a> Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).</li>
<li>Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+the+cornerstones+of+intestinal+and+organismal+health%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer.</a> EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).</li>
<li>Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+contributions+to+intestinal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell contributions to intestinal immunity.</a> Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).</li>
<li>Atanga, R., Singh, V., In, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+enteroendocrine+cells%3A+present+and+future+druggable+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).</li>
<li>Dicarlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+exposure+suppresses+the+inflammatory+pathway+in+intestinal+organoids+from+winnie+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice.</a> Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).</li>
<li>Miura, S., Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+and+human+organoid-forming+intestinal+progenitor+cells+by+direct+lineage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+dry+mass%2C+thickness%2C+solid+and+water+concentration+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells.</a> Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).</li>
<li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).</li>
<li>Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+three-dimensional+fluorescence+and+optical+diffraction+tomography+of+live+cells+using+structured+illumination+generated+by+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device.</a> Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+three-dimensional+quantitative+phase+imaging+and+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+cell+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology.</a> Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dual-contrast+three-dimensional+imaging+in+live+cells+via+optical+diffraction+tomography+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Photonics+Res%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence.</a> Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchl%C3%BC%C3%9Fler%2C+R+%22bioRvix%22">bioRvix</a>. , (2020).</li>
<li>Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+multimodal+3D-resolved+quantitative+phase+and+fluorescence+sub-diffraction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Optics+Exp%22%5BJournal%5D)">Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy.</a> Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).</li>
<li>Jo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+microtomography+of+endogenous+subcellular+dynamics+using+generalizable+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning.</a> Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).</li>
<li>Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+aberration+correction+for+enhanced+thick+tissue+imaging+exploiting+aberration+matrix+and+tilt-tilt+correlation+from+the+optical+memory+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect.</a> Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).</li>
<li>Yasuhiko, O., Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-silico+clearing+approach+for+deep+refractive+index+tomography+by+partial+reconstruction+and+wave-backpropagation%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation.</a> Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).</li>
</ol>

M.J.L., J.H.L., S.M.L. i Y.K.P. mają udziały finansowe w Tomocube Inc., firmie zajmującej się komercjalizacją holotomografii i ilościowego obrazowania fazowego.

Holotomografia stanowi potężne podejście do bezznacznikowego obrazowania żywych organoidów w wysokiej rozdzielczości, pokonując wiele wyzwań związanych z konwencjonalnymi technikami obrazowania. W tym protokole opisujemy kompleksową metodologię stosowania niskokoherentnego HT do badań sIO, umożliwiając ilościową wizualizację w czasie rzeczywistym morfologii organoidów, dynamiki wzrostu i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne. Integracja segmentacji opartej na uczeniu maszynowym i analizy ilościowej jeszcze bardziej zwię...

Organoidy to trójwymiarowe (3D) zminiaturyzowane wersje narządów wyhodowanych z komórek macierzystych, zdolne do rekapitulacji kluczowych cech strukturalnych i funkcjonalnych prawdziwych narządów in vitro1. Naukowcy opracowali systemy organoidowe dla szerokiej gamy tkanek - w tym jelita, mózgu, płuc, wątroby i nerek - z których każdy wykazuje samoorganizującą się architekturę i różnorodność typów komórek, przypominając swoje odpowiedniki in vivo . Odzwierciedlając natywną architekturę narządów i złożoność wielokomórkową, organoidy służą jako potężne systemy modelowe do badania rozwoju człowieka, regeneracji tkanek i mechanizmów chorobowych1. Stały się one kluczowymi narzędziami do modelowania chorób i odkrywania leków, umożliwiając naukowcom badanie ścieżek chorobowych i testowanie nowych terapii na specyficznych dla pacjenta tkankach 3D w laboratorium2. Warto zauważyć, że organoidy są również obiecujące w medycynie regeneracyjnej3: tkanki pochodzące z organoidów mogą być wszczepiane in vivo w celu naprawy uszkodzeń, jak wykazano w przypadku organoidów jelitowych i wątrobowych, co podkreśla ich potencjał w przywracaniu funkcji narządów4. Ta wszechstronność sprawia, że organoidy są niezbędne we współczesnych badaniach biomedycznych i medycynie spersonalizowanej.
Biorąc pod uwagę ich wielokomórkowy skład i złożoność strukturalną 3D, uchwycenie i analiza dynamiki organoidów ma kluczowe znaczenie. Jednak konwencjonalne techniki obrazowania napotykają znaczne ograniczenia w rozwiązywaniu struktur i dynamiki organoidów, często tworząc migawki 2D, które nie reprezentują ich pełnego stanu fizjologicznego5.
Mikroskopia jasnego pola jest szeroko stosowaną, nieinwazyjną metodą wychwytywania organoidów. Wygodnie monitoruje wzrost i morfologię, ale zapewnia ograniczony kontrast w niebarwionych próbkach 3D. Dodatkowo brakuje w nim przekroju optycznego, co skutkuje słabą rozdzielczością struktur wewnętrznych. Organoidy wydają się w dużej mierze przezroczyste, co utrudnia wykrycie drobnych cech pod powierzchnią6. Kontrast fazowy poprawia widoczność, przekształcając przesunięcia fazowe na różnice intensywności, odsłaniając ogólną architekturę (np. centralne światło) bez barwienia. Pomimo swojej użyteczności do obserwacji w czasie rzeczywistym, kontrast fazowy cierpi z powodu artefaktów halo, niskiej rozdzielczości i ograniczonej głębokości penetracji, co czyni go mniej skutecznym w przypadku grubszych organoidów7.
Szeregowe cięcie, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienie immunologiczne oparte na przeciwciałach jest szeroko stosowane do analizy mikrostruktury organoidów i składu komórkowego8. Ulepszone techniki przetwarzania tkanek, takie jak zatapianie parafiny utrwalonej w formalinie (FFPE) i kriosekcja, poprawiają zachowanie morfologii, a FFPE zapewnia doskonałe wyniki9. Osadzanie organoidów w hydrożelach, takich jak agaroza, i wirowanie wyrównują wiele próbek w jednej sekcji, poprawiając wydajność analizy. Wybarwione H&E skrawki organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta odzwierciedlają oryginalną histologię guza, podczas gdy barwienie immunofluorescencyjne podkreśla markery, takie jak CK8, do identyfikacji komórek10. Jednak techniki te nie mogą monitorować żywych organoidów i mogą wprowadzać artefakty, takie jak marszczenie się tkanek lub deformacja podczas sekcji.
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do obrazowania organoidów, dając przekroje optyczne o wysokiej rozdzielczości (submikrometrowe), które umożliwiają szczegółową wizualizację architektury organoidów i składu komórkowego11,12. Jednak obrazowanie konfokalne organoidów 3D jest zwykle ograniczone do warstw powierzchniowych (do głębokości 100 μm) i może być czasochłonne i fototoksyczne ze względu na punktowe oświetlenie laserowe13. Mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM) pokonuje niektóre z tych ograniczeń, oświetlając tylko płaszczyznę obrazowania, uzyskując szybkie obrazowanie wolumetryczne całych organoidów przy minimalnym fotowybielaniu i fototoksyczności14,15; Jednak technika ta często wymaga oczyszczania tkanek w celu optymalnego obrazowania grubych próbek. Ponadto głębokość obrazowania LSFM jest ograniczona przez niedopasowania rozpraszania światła i współczynnika załamania światła (RI), które można złagodzić za pomocą optyki adaptatywnej, obrazowania wielowidokowego i zoptymalizowanych długości fal wzbudzenia16. Montaż próbek wprowadza również deformacje strukturalne, podczas gdy duże zestawy danych 3D stanowią wyzwanie obliczeniowe w zakresie przechowywania i analizy. Ostatnie osiągnięcia, w tym ulepszone techniki znakowania genetycznego, nowatorskie odczynniki czyszczące, optyka adaptatywna i analiza obrazu oparta na sztucznej inteligencji, rozwiązują te ograniczenia, sprawiając, że LSFM staje się coraz bardziej wykonalny w badaniach nad organoidami7.
Pomimo tych postępów, techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D stwarzają kilka wyzwań dla długoterminowego monitorowania żywych organoidów. Po pierwsze, stosowanie znakowania fluorescencyjnego wprowadza efekty fototoksyczne i zaburza procesy biologiczne, co stanowi wyzwanie dla długotrwałych badań obrazowychna żywo 17. Po drugie, znakowanie oparte na przeciwciałach cierpi z powodu ograniczonej penetracji ze względu na bariery dyfuzyjne w gęstych strukturach organoidowych, co wymaga zaawansowanych metod przenikania i oczyszczania tkanek, które wymagają więcej niż 10 dni inkubacji w przypadku użycia przeciwciał pierwszego i drugorzędowego18. Po trzecie, transfekcja i stabilna ekspresja białek fluorescencyjnych w organoidach pozostają nieefektywne, ponieważ konwencjonalne podejścia do dostarczania genów mają problemy ze środowiskami 3D19. Po czwarte, techniki oczyszczania optycznego, niezbędne do głębokiego obrazowania, często prowadzą do utraty sygnału fluorescencji i zniekształcenia tkanek, co wymaga zoptymalizowanych protokołów oczyszczania, które równoważą przezroczystość i zachowanie fluorescencji20.
Aby zaradzić tym ograniczeniom, wprowadzono holotomografię (HT) jako technikę obrazowania nieznakowanych żywych organoidów z wysoką rozdzielczością w czasie. HT, znana również jako ilościowe obrazowanie fazowe 3D, HT jest bezznacznikową modalnością o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia ilościową wizualizację organoidów w czasie rzeczywistym przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnego stanu fizjologicznego. Zasada działania HT jest analogiczna do rentgenowskiej tomografii komputerowej; przechwytując wiele obrazów pola optycznego 2D w różnych warunkach oświetleniowych, rozkład 3D RI nieznakowanej próbki jest rekonstruowany za pomocą równania fali odwrotnej rozwiązującegorównanie 21,22,23. HT jest szeroko stosowany w różnych dziedzinach biologii, w tym w hematologii24,25, kondensacji fazowej w biologii komórki26, mikrobiologii27 i histopatologii28. Ostatnio jego zdolność do obrazowania 3D w wysokiej rozdzielczości bez znaczników jest coraz częściej wykorzystywana do badań nad organoidami 21,22,23,29, oferując nieinwazyjne podejście do badania ich dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej.
W tym badaniu przedstawiono szczegółowy protokół stosowania HT o niskiej koherencji w długoterminowym, bezznacznikowym monitorowaniu organoidów jelita cienkiego myszy (sIO). Metoda ta umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wzrostu organoidów i reakcji na leki w ciągu 24 godzin, zapewniając jednocześnie ilościowe pomiary objętości organoidów, gęstości i zawartości białka, ułatwiając rygorystyczną, opartą na danych analizę zachowania organoidów. Aby zbadać zmiany morfologiczne w organoidach, potraktowaliśmy próbki cisplatyną, chemioterapeutykiem na bazie platyny, o którym wiadomo, że indukuje apoptozę poprzez tworzenie wiązań krzyżowych DNA i hamowanie replikacji komórkowej30. Podczas gdy obrazowanie 3D RI rejestruje szczegóły strukturalne, systematyczna analiza jest niezbędna do ilościowego określenia dynamiki organoidów. Aby to osiągnąć, integrujemy ilastik, zestaw narzędzi do segmentacji oparty na uczeniu maszynowym31 w celu odróżnienia regionów organoidów od tła. Protokół ten przedstawia pełny przepływ pracy, w tym przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję HT 3D, segmentację opartą na uczeniu maszynowym i analizę ilościową na podstawie tomogramów RI. Oferując skalowalne, powtarzalne i nieinwazyjne ramy obrazowania, podejście to ustanawia nowy standard badań organoidowych o szerokim zastosowaniu w modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków.

<table><tbody><tr><td>Płytka 48-dołkowa&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Danie hodowlane</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odzyskiwania komórek&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Degradacja Matrigelu&nbsp;</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>supelco powiedział:</td><td>PHR1624</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał D2650</td><td>Pojazd</td></tr><tr><td>Rurka Eppendorfa</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C-S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Serwer przetwarzania HTX</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>Serwer przetwarzania danych</td></tr><tr><td>HT-X1 (odbiornik HT-X1)</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie operacyjne</td></tr><tr><td>Ilastik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zestaw narzędzi do segmentacji oparty na uczeniu maszynowym</td></tr><tr><td>Uchwyt naczynia do obrazowania&nbsp;</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>Uchwyt na czaszę obrazowania</td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (mysz)</td><td>Technologie STEMCELL</td><td>#06005</td><td>Dostępna na rynku gotowa pożywka hodowlana&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab (Matlab)</td><td>MathWorks (Prace matematyczne)</td><td>Matlab 2024a (wersja matowa)</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>ECM dla organoidów 3D</td></tr><tr><td>Milipore&nbsp; Steritop&nbsp; Filtr górny do butelki próżniowej</td><td>Merck</td><td>S2GPT05RE</td><td>0,22 &m; M Jednostka filtrująca do sterylizacji pożywki</td></tr><tr><td>Organoidy jelitowe myszy</td><td>Technologie STEMCELL</td><td>#70931</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>ATAGO (Agencja ATAGO)</td><td>Czynnik chłodniczy R-5000</td><td>Kalkulator indeksu refrakcji</td></tr><tr><td>TomoDish powiedział:</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>901002-02</td><td>#1.5 Naczynie obrazowe z dnem nakrywkowym</td></tr><tr><td>TomoStudio X</td><td>Tomocube Inc., Korea</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>TrypLE powiedział:</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12604</td><td>Dysocjacja pojedynczych komórek</td></tr></tbody></table>

bezznacznikowe obrazowanie 3d w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Label-free, High-Resolution 3D Imaging and Machine Learning Analysis of Intestinal Organoids via Low-Coherence Holotomography

Dokładne, bezznacznikowe obrazowanie organoidów jelitowych ma kluczowe znaczenie dla badania ich morfologii, dynamiki wzrostu i reakcji na bodźce środowiskowe. Holotomografia (HT) zapewnia trójwymiarową (3D) wizualizację żywych organoidów w wysokiej rozdzielczości bez konieczności stosowania markerów fluorescencyjnych, minimalizując w ten sposób fototoksyczność i zachowując integralność próbki. Obrazowanie fazowe w czasie rzeczywistym umożliwia ciągłe, bezznacznikowe śledzenie zmian strukturalnych i funkcjonalnych. Wykorzystując współczynnik załamania światła jako wewnętrzny kontrast obrazowania, metoda ta umożliwia ilościowe określenie właściwości biofizycznych, takich jak objętość, gęstość białka i zawartość białka. Dane obrazowania są dalej przetwarzane za pomocą segmentacji opartej na uczeniu maszynowym i ekstrakcji cech w celu wsparcia spójnej analizy o wysokiej przepustowości. Protokół ten szczegółowo opisuje kompletny eksperymentalny przepływ pracy w celu wykorzystania HT o niskiej koherentności w badaniach organoidów, obejmujący przygotowanie organoidów, akwizycję obrazowania i analizę danych opartą na uczeniu maszynowym. Integrując segmentację obliczeniową i oceny ilościowe, podejście to umożliwia bezstronną ocenę kluczowych właściwości organoidów, w tym żywotności, organizacji strukturalnej i odpowiedzi na lek. Możliwość uchwycenia zmian morfologicznych w czasie rzeczywistym w rozdzielczości subkomórkowej sprawia, że protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniach opartych na organoidach w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i farmaceutycznych badaniach przesiewowych. Przedstawiona tutaj metodologia krok po kroku ułatwia odtwarzalność i szeroką adaptację w różnych systemach organoidowych.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przebieg obrazowania 4D i analizy ilościowej sIOs. Niniejszy protokół umożliwia ciągłe obrazowanie żywych komórek oraz kompleksową ocenę sIOs poprzez czterostopniowy proces: hodowlę, obrazowanie 4D, przetwarzanie obrazów oraz analizę ilościową (Rysunek 1D).
Po 5-dniowym okresie inkubacji dojrzałe sIO przeniesiono do naczyń obrazujących z dnem z lamellki w celu wizualizacji z wykorzystaniem holotomogr...

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Accurate, label-free imaging of intestinal organoids is crucial for studying their morphology, growth dynamics, and responses to environmental stimuli. ...

Naszym celem jest opracowanie metod obrazowania w czasie rzeczywistym, bez znaczników, podczas monitorowania zmian biofizycznych w żywych organoidach podczas opracowywania i w odpowiedzi na leki. Protokół ten ułatwia usprawnioną skalę obrazowania i nieinwazyjne testowanie leków w żywych organoidach, wspierane przez mutacje sterowane przez sztuczną inteligencję i ilościową selekcję tekstury do badań biomedycznych. Planujemy dalszą integrację bezznacznikowego obrazowania 3D i rocznej analizy w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości, nieinwazyjnych badań organoidów w modelowaniu chorób i medycynie precyzyjnej.Na początek odessaj zużyte podłoże z każdej studzienki 48-dołkowej płytki zawierającej macierz zewnątrzkomórkową. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania komórek do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pipety delikatnie zebrać zawiesinę organoidu i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.Odwirować probówkę o masie 150 g przez trzy minuty, a następnie ostrożnie usunąć supernatant. Aby mechanicznie oddzielić osad, ponownie zawiesić go w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej i pipetować zawiesinę w górę iw dół 20 do 30 razy za pomocą pipety P200 przed odwirowaniem przez trzy minuty. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, dodać pożywkę i świeżą macierz zewnątrzkomórkową lub ECM w stosunku jeden do czterech do osadu i delikatnie odpipetować, aby dokładnie wymieszać.Dozować 15 mikrolitrów mieszaniny na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po polimeryzacji dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i wypełnij puste dołki zewnętrzne PBS.Aby przygotować próbkę do obrazowania, należy nalać 15 mikrolitrów organoidowej kopuły ECM na dolną płytkę obrazową z szkiełka nakrywkowego o numerze 1,5 i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie delikatnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby całkowicie zanurzyć organoidy.Po pięciu dniach od pasażu należy przemyć próbkę dwa do trzech razy PBS bezpośrednio przed obrazowaniem. Następnie, w celu obrazowania, włącz kontroler środowiska. Sterownik komory automatycznie ustawi temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dwutlenek węgla na 5%Naciśnij przycisk drzwi, aby otworzyć drzwi.Dodaj wodę, aby utworzyć cienką warstwę wewnątrz komory. Umieść czaszę obrazowania w uchwycie naczynia, włóż ją do komory obrazowania i zabezpiecz za pomocą kołka, aby zapobiec przemieszczaniu się. Zamknij drzwi, aby zapobiec zakłóceniom światła zewnętrznego.Teraz uruchom oprogramowanie TomoStudio X i zaloguj się. Kliknij przycisk Start, aby otworzyć okno główne, a następnie kliknij pozycję Dodaj projekt w lewym górnym rogu i przypisz eksperyment. Upewnij się, że wybrano właściwy typ medium dla odpowiedniego zastosowania współczynnika załamania światła.Kliknij na żądaną studzienkę w panelu, a następnie kliknij Utwórz u góry, aby zarejestrować studnię jako próbkę. Następnie kliknij Ustawienia ROI w prawym górnym rogu, aby zdefiniować obszar zainteresowania w daniu. Po ustawieniu kliknij Uruchom eksperyment w prawym dolnym rogu, aby otworzyć okno Akwizycja obrazu.Kliknij przycisk Załaduj naczynie w rogu, aby wyświetlić obraz w jasnym polu. Dostosuj pozycję Z za pomocą przycisków Z i Z, aby ustawić ostrość obrazu. Na karcie Single Imaging (Pojedyncze obrazowanie) dostosuj rozmiar ROI.Uchwyć organoidy w polu widzenia 160 mikrometrów na 160 mikrometrów i uzyskaj stosy o głębokości do 140 mikrometrów. Przejdź do zakładki Obrazowanie poklatkowe, aby skonfigurować obrazowanie długoterminowe i ustawić żądany czas trwania i czas interwału. Kliknij ikonę Skanuj, aby przechwycić bieżącą lokalizację zwrotu z inwestycji.Kliknij przycisk BF, aby dostosować intensywność i wartości ekspozycji dla obrazowania w jasnym polu. Przesuń pole ROI w panelu Podgląd, aby wybrać ROI. Po wybraniu żądanego zwrotu z inwestycji kliknij Dodaj punkt na dole, zostanie utworzona lista punktów obrazowania.Teraz kliknij Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie i uzyskać surowe dane obrazu. Uruchom serwer przetwarzania HTX, klikając ikonę Pulpit. Przeciągnij i upuść surowe pliki obrazów na serwer przetwarzania HTX.Kliknij przycisk Przetwarzaj, aby wygenerować plik TCF z pliku obrazu RAW. Uruchom przeglądarkę TomoAnalysis, klikając ikonę Pulpit. Załaduj przetworzone pliki TCF, przeciągając je i upuszczając w oknie przeglądarki.Kliknij dwukrotnie miniaturę pliku, aby otworzyć tomogram ROI. Widok 2D można wyświetlić, poruszając się po płaszczyznach X, Y i Z za pomocą elementów sterujących powiększaniem, przesuwaniem i przewijaniem. Kliknij ikonę widoku renderowania MIP po lewej stronie, aby przełączyć się do trybu renderowania 3D.Poruszanie się po widoku 3D polega na obracaniu, powiększaniu i przesuwaniu obrazu. W przypadku segmentacji obrazów opartej na uczeniu maszynowym wyeksportuj plik obrazu TCF do formatu HDF5, aby upewnić się, że dane są w formacie wielowymiarowym, zgodnym z ilastik. Otwórz ilastik i przejdź do nowego projektu.Wybierz opcję Pixel Classification (Klasyfikacja pikseli) w sekcji Segmentation Workflow (Obieg pracy segmentacji) i zapisz projekt w wyznaczonym folderze. Aby załadować plik HGF5, przejdź do zakładki Dane wejściowe, kliknij Dodaj nowy plik, wybierz odpowiedni zestaw danych H5 i sprawdź poprawność przypisań kanałów obrazu. Teraz przejdź do zakładki Wybór funkcji, aby wybrać cechy, takie jak kolor, intensywność, krawędź i tekstura, aby zoptymalizować segmentację.Na karcie Trening oznacz regiony organoidowe i nieorganoidalne za pomocą pociągnięć pędzlem w różnych kolorach. Kliknij opcję Live Update, aby wyświetlić podgląd wyników segmentacji i w razie potrzeby wprowadzić poprawki. Po zakończeniu przejdź do zakładki Eksport prognoz.Wybierz opcję Prosta segmentacja jako źródło eksportowania przewidywań oznaczonych etykietami, a następnie kliknij przycisk Eksportuj wszystko. Ustaw format eksportu na H5 lub TIFF w zależności od wymagań analizy. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej otwórz Dodatkowy plik kodowania 2.Wyznacz odpowiednie ścieżki folderów dla pliku maski i odpowiadającego mu pliku TCF w skrypcie. Uruchom kod, aby zainicjować analizę ilościową. Kod obliczy objętość organoidu, gęstość białka i całkowitą zawartość białka dla każdego zestawu danych.Rysunek ten ilustruje trójwymiarowe rekonstrukcje współczynnika załamania światła o wysokiej rozdzielczości wykorzystywane do wizualizacji ogólnej morfologii organoidów jelita cienkiego. Renderowane rekonstrukcje ujawniają wyraźne różnice strukturalne między organoidami traktowanymi podłożem i cisplatyną na wszystkich trzech głębokościach przekroju optycznego. Organoidy traktowane cisplatyną wykazywały znacznie większą objętość, niższą gęstość białka i wyższą całkowitą zawartość białka w porównaniu z organoidami traktowanymi podłożem po 10 minutach od zabiegu, co wskazuje na wczesny obrzęk strukturalny i zmieniony skład białka.Obrazowanie poklatkowe w ciągu 24 godzin wykazało, że organoidy traktowane nośnikiem zachowywały integralność strukturalną, podczas gdy organoidy traktowane cisplatyną doświadczały postępującej degradacji strukturalnej, w tym zapadania się krypty i zwiększonej dysocjacji komórek, co sugeruje zależne od czasu uszkodzenie cytotoksyczne. Śledzenie ilościowe potwierdziło, że organoidy traktowane podłożem zwiększały z czasem objętość i zawartość białka, podczas gdy organoidy traktowane cisplatyną wykazywały zależny od czasu spadek obu parametrów, co wskazuje, że cisplatyna hamowała wzrost i indukowała degradację komórkową. Gęstość białka pozostała stabilna w organoidach traktowanych podłożem, ale stopniowo zmniejszała się w organoidach traktowanych cisplatyną w ciągu 24 godzin, co sugeruje załamanie struktury komórkowej i zwiększenie przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wyniku złuszczania.

label-free-high-resolution-3d-imaging-machine-learning-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Odkryj metodę bezbarwnego obrazowania 3D organoidów jelitowych przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności i uczenia maszynowego. Technika umożliwia nieinwazyjną analizę odpowiedzi na leki w czasie rzeczywistym.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności (Wideo) | JoVE Journal

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Przeglądaj więcej filmów