Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Naszym celem jest opracowanie metod obrazowania w czasie rzeczywistym, bez znaczników, podczas monitorowania zmian biofizycznych w żywych organoidach podczas opracowywania i w odpowiedzi na leki. Protokół ten ułatwia usprawnioną skalę obrazowania i nieinwazyjne testowanie leków w żywych organoidach, wspierane przez mutacje sterowane przez sztuczną inteligencję i ilościową selekcję tekstury do badań biomedycznych. Planujemy dalszą integrację bezznacznikowego obrazowania 3D i rocznej analizy w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości, nieinwazyjnych badań organoidów w modelowaniu chorób i medycynie precyzyjnej.

Na początek odessaj zużyte podłoże z każdej studzienki 48-dołkowej płytki zawierającej macierz zewnątrzkomórkową. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania komórek do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pipety delikatnie zebrać zawiesinę organoidu i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.

Odwirować probówkę o masie 150 g przez trzy minuty, a następnie ostrożnie usunąć supernatant. Aby mechanicznie oddzielić osad, ponownie zawiesić go w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej i pipetować zawiesinę w górę iw dół 20 do 30 razy za pomocą pipety P200 przed odwirowaniem przez trzy minuty. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, dodać pożywkę i świeżą macierz zewnątrzkomórkową lub ECM w stosunku jeden do czterech do osadu i delikatnie odpipetować, aby dokładnie wymieszać.

Dozować 15 mikrolitrów mieszaniny na kopułę do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po polimeryzacji dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej do każdej studzienki i wypełnij puste dołki zewnętrzne PBS.

Aby przygotować próbkę do obrazowania, należy nalać 15 mikrolitrów organoidowej kopuły ECM na dolną płytkę obrazową z szkiełka nakrywkowego o numerze 1,5 i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie delikatnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby całkowicie zanurzyć organoidy.

Po pięciu dniach od pasażu należy przemyć próbkę dwa do trzech razy PBS bezpośrednio przed obrazowaniem. Następnie, w celu obrazowania, włącz kontroler środowiska. Sterownik komory automatycznie ustawi temperaturę na 37 stopni Celsjusza i dwutlenek węgla na 5%Naciśnij przycisk drzwi, aby otworzyć drzwi.

Dodaj wodę, aby utworzyć cienką warstwę wewnątrz komory. Umieść czaszę obrazowania w uchwycie naczynia, włóż ją do komory obrazowania i zabezpiecz za pomocą kołka, aby zapobiec przemieszczaniu się. Zamknij drzwi, aby zapobiec zakłóceniom światła zewnętrznego.

Teraz uruchom oprogramowanie TomoStudio X i zaloguj się. Kliknij przycisk Start, aby otworzyć okno główne, a następnie kliknij pozycję Dodaj projekt w lewym górnym rogu i przypisz eksperyment. Upewnij się, że wybrano właściwy typ medium dla odpowiedniego zastosowania współczynnika załamania światła.

Kliknij na żądaną studzienkę w panelu, a następnie kliknij Utwórz u góry, aby zarejestrować studnię jako próbkę. Następnie kliknij Ustawienia ROI w prawym górnym rogu, aby zdefiniować obszar zainteresowania w daniu. Po ustawieniu kliknij Uruchom eksperyment w prawym dolnym rogu, aby otworzyć okno Akwizycja obrazu.

Kliknij przycisk Załaduj naczynie w rogu, aby wyświetlić obraz w jasnym polu. Dostosuj pozycję Z za pomocą przycisków Z i Z, aby ustawić ostrość obrazu. Na karcie Single Imaging (Pojedyncze obrazowanie) dostosuj rozmiar ROI.

Uchwyć organoidy w polu widzenia 160 mikrometrów na 160 mikrometrów i uzyskaj stosy o głębokości do 140 mikrometrów. Przejdź do zakładki Obrazowanie poklatkowe, aby skonfigurować obrazowanie długoterminowe i ustawić żądany czas trwania i czas interwału. Kliknij ikonę Skanuj, aby przechwycić bieżącą lokalizację zwrotu z inwestycji.

Kliknij przycisk BF, aby dostosować intensywność i wartości ekspozycji dla obrazowania w jasnym polu. Przesuń pole ROI w panelu Podgląd, aby wybrać ROI. Po wybraniu żądanego zwrotu z inwestycji kliknij Dodaj punkt na dole, zostanie utworzona lista punktów obrazowania.

Teraz kliknij Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie i uzyskać surowe dane obrazu. Uruchom serwer przetwarzania HTX, klikając ikonę Pulpit. Przeciągnij i upuść surowe pliki obrazów na serwer przetwarzania HTX.

Kliknij przycisk Przetwarzaj, aby wygenerować plik TCF z pliku obrazu RAW. Uruchom przeglądarkę TomoAnalysis, klikając ikonę Pulpit. Załaduj przetworzone pliki TCF, przeciągając je i upuszczając w oknie przeglądarki.

Kliknij dwukrotnie miniaturę pliku, aby otworzyć tomogram ROI. Widok 2D można wyświetlić, poruszając się po płaszczyznach X, Y i Z za pomocą elementów sterujących powiększaniem, przesuwaniem i przewijaniem. Kliknij ikonę widoku renderowania MIP po lewej stronie, aby przełączyć się do trybu renderowania 3D.

Poruszanie się po widoku 3D polega na obracaniu, powiększaniu i przesuwaniu obrazu. W przypadku segmentacji obrazów opartej na uczeniu maszynowym wyeksportuj plik obrazu TCF do formatu HDF5, aby upewnić się, że dane są w formacie wielowymiarowym, zgodnym z ilastik. Otwórz ilastik i przejdź do nowego projektu.

Wybierz opcję Pixel Classification (Klasyfikacja pikseli) w sekcji Segmentation Workflow (Obieg pracy segmentacji) i zapisz projekt w wyznaczonym folderze. Aby załadować plik HGF5, przejdź do zakładki Dane wejściowe, kliknij Dodaj nowy plik, wybierz odpowiedni zestaw danych H5 i sprawdź poprawność przypisań kanałów obrazu. Teraz przejdź do zakładki Wybór funkcji, aby wybrać cechy, takie jak kolor, intensywność, krawędź i tekstura, aby zoptymalizować segmentację.

Na karcie Trening oznacz regiony organoidowe i nieorganoidalne za pomocą pociągnięć pędzlem w różnych kolorach. Kliknij opcję Live Update, aby wyświetlić podgląd wyników segmentacji i w razie potrzeby wprowadzić poprawki. Po zakończeniu przejdź do zakładki Eksport prognoz.

Wybierz opcję Prosta segmentacja jako źródło eksportowania przewidywań oznaczonych etykietami, a następnie kliknij przycisk Eksportuj wszystko. Ustaw format eksportu na H5 lub TIFF w zależności od wymagań analizy. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej otwórz Dodatkowy plik kodowania 2.

Wyznacz odpowiednie ścieżki folderów dla pliku maski i odpowiadającego mu pliku TCF w skrypcie. Uruchom kod, aby zainicjować analizę ilościową. Kod obliczy objętość organoidu, gęstość białka i całkowitą zawartość białka dla każdego zestawu danych.

Rysunek ten ilustruje trójwymiarowe rekonstrukcje współczynnika załamania światła o wysokiej rozdzielczości wykorzystywane do wizualizacji ogólnej morfologii organoidów jelita cienkiego. Renderowane rekonstrukcje ujawniają wyraźne różnice strukturalne między organoidami traktowanymi podłożem i cisplatyną na wszystkich trzech głębokościach przekroju optycznego. Organoidy traktowane cisplatyną wykazywały znacznie większą objętość, niższą gęstość białka i wyższą całkowitą zawartość białka w porównaniu z organoidami traktowanymi podłożem po 10 minutach od zabiegu, co wskazuje na wczesny obrzęk strukturalny i zmieniony skład białka.

Obrazowanie poklatkowe w ciągu 24 godzin wykazało, że organoidy traktowane nośnikiem zachowywały integralność strukturalną, podczas gdy organoidy traktowane cisplatyną doświadczały postępującej degradacji strukturalnej, w tym zapadania się krypty i zwiększonej dysocjacji komórek, co sugeruje zależne od czasu uszkodzenie cytotoksyczne. Śledzenie ilościowe potwierdziło, że organoidy traktowane podłożem zwiększały z czasem objętość i zawartość białka, podczas gdy organoidy traktowane cisplatyną wykazywały zależny od czasu spadek obu parametrów, co wskazuje, że cisplatyna hamowała wzrost i indukowała degradację komórkową. Gęstość białka pozostała stabilna w organoidach traktowanych podłożem, ale stopniowo zmniejszała się w organoidach traktowanych cisplatyną w ciągu 24 godzin, co sugeruje załamanie struktury komórkowej i zwiększenie przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wyniku złuszczania.