Name: Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę szybkiego projektowania obwodów genetycznych z wykorzystaniem politransfekcji komórek ssaków. Technika ta umożliwia testowanie wielu stosunków stoichiometrycznych w jednej próbce, zwiększając efektywność eksperymentalną w biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować byłym członkom Weiss Lab, którzy prowadzili lub przyczynili się do rozwoju metody politransfekcji i jej zastosowania w klasyfikatorach komórek: Jeremy Gam, Bre DiAndreth i Jin Huh; innym członkom laboratorium Weiss, którzy przyczynili się do dalszego rozwoju/optymalizacji metody: Wenlong Xu, Lei Wang i Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard i członkowie grupy, w tym Patrickowi Donahue i Hailey Edelstein, za przetestowanie politransfekcji i przekazanie informacji zwrotnych; oraz prof. Nice Shakiba za zaproszenie do publikacji tego manuskryptu i przekazanie informacji zwrotnej. Chcielibyśmy również podziękować Narodowym Instytutom Zdrowia [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; Narodowa Fundacja Nauki [1745645]; Grant Cancer Center Support (core) [P30CCA14051, częściowo] z NCI i National Institutes of Health [P50GM098792] na finansowanie tej pracy.

UWAGA: Tabela 1 i Tabela 2 służą jako istotne odniesienia dla tego protokołu. Tabela 1 przedstawia skalowanie odczynników dla reakcji, a Tabela 2 przedstawia arytmetykę stosunku DNA dla przykładowej politransfekcji opisanej w protokole (górna połowa) i dla możliwego eksperymentu uzupełniającego (dolna połowa).
1. Przygotowanie komórek do transfekcji
<ol>
	<li>Upewnij się, że hodowla ludzkich komórek nerki embrionalnej (HEK293) jest zlewna w 60%-80% przed rozpoczęciem protokołu. W tym celu należy wysiać 1 x 106 komórek w kulturze tkankowej o wymiarach 100 mm x 15 mm na szalce Petriego 2 dni wcześniej i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Chociaż nasz protokół koncentruje się na komórkach HEK293, inne typy komórek mogą zostać zastąpione.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę i komórki do transfekcji zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Podgrzej co najmniej 20 ml roztworu zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA; patrz tabela materiałów) do temperatury 37 °C. Podgrzej również do temperatury 37 °C co najmniej 2,4 ml trypsyny i 2,4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wstępnie rozgrzej zredukowaną pożywkę surowicy do ~16 °C. 
		UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową należy wykonywać ostrożnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w roztworze DMEM, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Zassać i wyrzucić obecne media. Dozuj 2 ml PBS na hodowlę komórkową HEK293, aby umyć komórki. Odessać i wyrzucić PBS.</li>
		<li>Dozuj 2 ml trypsyny do hodowli komórkowej HEK293. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do szalki. Umieść naczynie z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozcieńcz roztwór komórek, dozując 8 ml roztworu DMEM do płytki.</li>
		<li>Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Odessać całą pożywkę i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki o sile 300 x g przez 3 minuty, aby je ogrzać. Odessać pożywkę (uważając, aby nie zassać komórek) i wyrzucić ją. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml roztworu DMEM, mieszając delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Oszacuj aktualne stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (wymienionego w Tabeli materiałów). Wysiewaj sześć dołków (w tym przykładzie) na 24-dołkowej płytce z 1 x 105 komórek (dla gęstości wysiewu 50 000 komórek/cm2).</li>
	<li>Dodaj roztwór DMEM do 500 μL (najpierw dodaj roztwór DMEM do studzienek), a następnie oznacz jeden dołek na zabieg w następujący sposób: brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola NeonGreen, cała kontrola koloru i politransfekcja 1. Studnie kontrolne TagBFP, mKO2 i NeonGreen są jednokolorowymi kontrolami dla wszystkich białek fluorescencyjnych zawartych w politransfekcji.</li>
</ol>
2. Wykonywanie transfekcji
<ol>
	<li>Przygotuj probówki dla każdego agregatu DNA. Odłóż na bok probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i oznacz probówki jako: brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola NeonGreen, kontrola wszystkich kolorów, mieszanka politransfekcji 1 i mieszanka politransfekcji 2.
	<ol>
		<li>Dodaj 36 μl zredukowanej pożywki surowicy do kontroli bez koloru, kontroli mKO2, kontroli TagBFP, kontroli NeonGreen i wszystkich probówek kontrolnych koloru. Dodać 18 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej z probówek mieszaniny politransfekcyjnej 1 i mieszaniny politransfekcji 2. 
		UWAGA: Przyjmuje się, że stężenia plazmidu wynoszą 150 ng/μl.</li>
		<li>Dodaj 600 ng plazmidu wypełniającego do probówki bez kontroli koloru. Dodaj 300 ng mKO2 i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru mKO2. Dodaj 300 ng TagBFP i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru TagBFP.</li>
		<li>Dodaj 300 ng konstytutywnego plazmidu NeonGreen i 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolującej kolor NeonGreen. Dodaj po 100 ng mKO2, TagBFP i składowego NeonGreen, a także 300 ng plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej wszystkich kolorów.</li>
		<li>Dodać 150 ng mKO2 do 1 probówki do mieszania politransfekcji. Dodać 75 ng plazmidu reporterowego NeonGreen i 75 ng plazmidu wypełniającego do 1 probówki z mieszanką politransfekcji.</li>
		<li>Dodać 150 ng TagBFP do probówki z mieszanką politransfekcji 2. Dodać 75 ng plazmidu L7ae i 75 ng plazmidu wypełniającego do probówki z mieszanką politransfekcji 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stworzyć główną mieszaninę transfekcji w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, łącząc 216 μl zredukowanej pożywki surowicy z 9,48 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela 1 dla proporcji odczynników i skalowania reakcji). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i odstaw na bok.</li>
	<li>Dodaj 1,58 μl odczynnika wzmacniającego do każdej z probówek bez kontroli koloru, z pojedynczą kontrolą koloru i ze wszystkimi probówkami do kontroli koloru. Dodać 79 μl odczynnika wzmacniającego do każdej z probówek z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.</li>
	<li>Dodaj główną mieszankę transfekcji do każdej probówki zawierającej DNA.
	<ol>
		<li>Dodaj 37,58 μl głównej mieszanki transfekcyjnej do każdej z probówek bez kontroli koloru, z pojedynczą kontrolą koloru i wszystkimi probówkami do kontroli koloru. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.</li>
		<li>Dodać 18,79 μl głównej mieszanki do transfekcji do każdej z probówek z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozować mieszanki transfekcyjne do studzienek.
	<ol>
		<li>Odpipetować 65,97 μl każdej mieszanki transfekcyjnej dla kontroli bez koloru, pojedynczego koloru i wszystkich kontrolek koloru do odpowiednich studzienek.</li>
		<li>Odpipetować 32,98 μl politransfekcji wymieszać 1 do studzienki politransfekcji i szybko, ale delikatnie zakręcić płytką w ciasny wzór ósemki wzdłuż płaskiej powierzchni, aby skutecznie rozprowadzić kompleksy. Następnie odpipetować 32,98 μl politransfekcji wymieszać 2 z tym samym dołkiem do politransfekcji i zawirować płytkę w ten sam sposób.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i bez wstrząsania, przez okres 48 h. 
	UWAGA: Aby zwiększyć żywotność komórek, pożywkę komórkową można wymieniać co 6 godzin po transfekcji (choć nie zawsze jest to konieczne, a w przypadku komórek HEK293 i jego pochodnych należy uważać, aby nie odłączyć komórek od płytki podczas zmiany pożywki).</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td colspan="3">Ilość</td>
			<td colspan="3">Skalowanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zredukowana pożywka surowicy do mieszaniny DNA</td>
			<td colspan="3">36 μL na probówkę kontrolną, 18 μL na probówkę do politransfekcji </td>
			<td colspan="3">0,05 μL Zredukowana pożywka surowicy/ng DNA na probówkę, z 10-20% dodatkową objętością do uwzględnienia pipetowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td colspan="3">300-600 ng na tubę</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał P3000</td>
			<td colspan="3">1,58 μl na probówkę kontrolną, 0,79 μl na probówkę do politransfekcji</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL P3000/ng DNA na probówkę, z 10-20% dodatkowym</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zredukowana pożywka surowicy do mieszanki Lipo Master</td>
			<td colspan="3">36 μL na probówkę kontrolną, 18 μL na probówkę do politransfekcji</td>
			<td colspan="3">0,05 μL zredukowanej pożywki surowicy/ng całkowitego DNA, z 10-20% dodatkową objętością do uwzględnienia pipetowania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do transfekcji i wzmacniacza</td>
			<td colspan="3">1,58 μl na probówkę kontrolną, 0,79 μl na probówkę do politransfekcji</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL Lipofektaminy 3000/ng DNA, z 10-20% dodatkiem</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skalowanie odczynnika dla transfekcji. Tabela wskazuje prawidłowy stosunek odczynnika, który należy uwzględnić dla ilości DNA zawartego w pojedynczym dołku. Można to wykorzystać do efektywnego skalowania reakcji i tworzenia miksów wzorcowych. Ilości odczynnika zostały przeskalowane tak, aby uwzględniały 20% nadmiaru.
3. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Podgrzać co najmniej 4,2 ml roztworu DMEM do temperatury 37 °C. Podgrzać co najmniej 4,2 ml trypsyny i 4,2 ml PBS do temperatury 37 °C. Roztwór buforowy do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w roztworze buforowym FACS (PBS uzupełniony 1% BSA, 5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA] i 0,1% azydkiem sodu [NaN 3], w celu zmniejszenia zbrylania; patrz tabela materiałów), jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Zassać i wyrzucić obecne media w każdej studzience. Dozuj 5 ml PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki. Odessać i wyrzucić PBS.</li>
		<li>Dozuj 5 ml trypsyny do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 minuty lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do naczynia. Umieść płytkę z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozcieńcz roztwory komórkowe, dozując 5 ml roztworu DMEM do każdej studzienki.</li>
		<li>Dla każdej studzienki wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Do każdej studzienki odessać wszystkie podłoża i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki o sile 300 x g przez 3 minuty, aby je ogrzać. Odessać pożywkę, uważając, aby nie zassać komórek i nie wyrzucić jej. W każdej probówce ponownie zawiesić komórki w 5 ml roztworu buforowego FACS, mieszając delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przepuścić każdy roztwór zawiesiny komórkowej przez sitko (w celu usunięcia grudek) do oddzielnych stożkowych probówek cytometrii przepływowej. Trzymaj te probówki na lodzie nie dłużej niż 1 godzinę i jak najszybciej wykonaj cytometrię przepływową.</li>
</ol>
4. Wykonywanie cytometrii przepływowej
UWAGA: Obsługa cytometru przepływowego wymaga odpowiedniego przeszkolenia i wiedzy na temat niezbędnych zadań. Ponieważ oprogramowanie i sprzęt mogą się różnić, a użytkownicy powinni być ogólnie przeszkoleni, ta sekcja odnosi się do konkretnych operacji, które są przydatne do wykonania.
<ol>
	<li>Najpierw zbadaj komórki transfekowane plazmidem wypełniającym (bez kontroli koloru), aby wybrać cechy komórek i uniknąć anomalii (w tym agregatów, szczątków itp.). Chociaż istnieje wiele kombinacji parametrów do rozróżniania komórek, użyj następujących trzech ogólnych opcji, aby dobrze zwizualizować cechy wyróżniające.
	<ol>
		<li>Spójrz na boczny obszar rozproszenia (skala logarytmiczna lub liniowa według preferencji/typu komórki) w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu (skala liniowa).</li>
		<li>Spójrz na wysokość bocznego rozrzutu (skala logarytmiczna) w porównaniu z szerokością bocznego rozrzutu (skala liniowa).</li>
		<li>Spójrz na szerokość rozproszenia do przodu (skala liniowa) w porównaniu z wysokością rozproszenia do przodu (skala liniowa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przyjrzyj się kontrolkom pojedynczego koloru. Użyj kontrolki wszystkich kolorów, aby dostroić napięcia instrumentu, tak aby sygnały z każdego białka fluorescencyjnego były znormalizowane do równoważnych dowolnych jednostek (au) fluorescencji. Następnie uruchom pojedyncze kontrolki koloru dla każdego białka fluorescencyjnego, które są używane do ustawiania macierzy kompensacji, co pozwala na korekcję przebijania. 
	UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby widoczny był pełny zakres dynamiczny wartości fluorescencji. Dalsza normalizacja fluorescencyjnych sygnałów białkowych może odbywać się poprzez konwersję do standaryzowanych jednostek (np. cząsteczek równoważnej fluoresceiny [MEFL; patrz Beal et al.15]). Aby włączyć konwersję MEFL podczas analizy, uruchom tęczowe koraliki kalibracyjne. Taka kalibracja jest również przydatna do zmniejszania różnic między instrumentami i codziennych zmian sygnału16.</li>
	<li>Uruchom probówkę z próbką politransfekcji. 
	UWAGA: Tam, gdzie to możliwe, zaleca się uruchomienie komórek 1,000 x 10^ (^ = miesza), ponieważ bardziej wymiarowe politransfekcje muszą być podzielone na więcej pojemników podczas analizy, a każdy pojemnik potrzebuje wystarczającej liczby komórek (najlepiej >10), aby dokonać statystycznie istotnych porównań.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie analizy po eksperymencie
<ol>
	<li>Na początku użyj danych z kontrolek (i, w stosownych przypadkach, koralików), aby zapewnić dokładne wyniki. Użyj jednego z dostępnych narzędzi programowych, aby wykonać bramkowanie żywych komórek (przy użyciu bramek opisanych powyżej), kompensację i korekcję autofluorescencji. 
	UWAGA: Zazwyczaj używamy niestandardowego kodu MATLAB (np. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis lub Cytoflow17), który ma zarówno graficzny interfejs użytkownika, jak i bibliotekę Pythona odpowiednią dla fazy wstępnego przetwarzania i analizy politransfekcji.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>metoda</td>
			<td>kompleks</td>
			<td>ng Marker fluorescencyjny</td>
			<td>ng L7ae (frakcja)</td>
			<td>ng Reporter (ułamek)</td>
			<td>ng Wypełniacz DNA (frakcja)</td>
			<td>Ogółem (ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Politransfekcja 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td> szt.
			<td>75 (1/2)</td>
			<td></td>
			<td>75 (1/2)</td>
			<td>300</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>→</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>150</td> szt.
			<td></td>
			<td>75 (1/2)</td>
			<td>75 (1/2)</td>
			<td>300</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Politransfekcja 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td> szt.
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>→</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>150</td> szt.
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>art. 25 ust. 1/6</td>
			<td>300</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ilości DNA do politransfekcji pokazane w protokole oraz przykładowy eksperyment uzupełniający z dostrojonymi proporcjami plazmidu. Górna połowa tabeli przedstawia skład plazmidów użytych w prostym eksperymencie politransfekcji. Dolna połowa pokazuje skład zaktualizowanego eksperymentu, który dostosowuje proporcje plazmidu, aby lepiej podpróbkować hipotetyczną przestrzeń stężeń, w której modulator ekspresji genów ma bardziej optymalny stosunek 1:5 w stosunku do swojego reportera, co daje więcej transfekowanych komórek do pobrania próbki w okolicach tego stosunku.

<ol><li>Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+circuits+and+cellular+decision-making+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells.</a> Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).</li>
<li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li>
<li>Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li>
<li>Nissim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-based+immunomodulatory+gene+circuits+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy.</a> Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).</li>
<li>Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+dual-promoter+integrator+for+targeting+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells.</a> Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).</li>
<li>Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+regulatory+effect+size+of+cis-acting+genetic+variation+using+allelic+fold+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change.</a> Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).</li>
<li>Prochazka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete-to-analog+signal+pluripotent+stem+cells+conversion+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity%2C+context-dependence%2C+and+insulation+in+engineered+biological+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits.</a> Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).</li>
<li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27poly-transfection%27+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+tunable+signal+processing+in+mammalian+cells+via+engineered+covalent+modification+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles.</a> Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSIST+platform+provides+programmable+RNA+regulation+using+CRISPR+endoRNases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases.</a> Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).</li>
<li>Frei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+mitigation+of+gene+expression+burden+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).</li>
<li>Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+fast%2C+high-precision+characterization+of+synthetic+biology+devices.+Computer+Science+and+Artificial+Intelligence+Laboratory+Technical+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Massachusetts+institute+of+technology%22%5BJournal%5D)">A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report.</a> Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).</li>
<li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+measurement+precision+requirements+for+effective+engineering+of+genetic+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+Python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+gene+expression+with+synthetic+upstream+open+reading+frames%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).</li>
<li>Michaels, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+tuning+of+gene+expression+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 818(2019).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Wroblewska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+synthetic+circuits+with+RNA+binding+proteins+for+RNA-only+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).</li>
<li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).</li>
<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

R.W. jest współzałożycielem Strand Therapeutics i Replay Bio; R.W. i R.J. złożyli tymczasowy patent związany z klasyfikatorem typów komórek.

Metody szybkiego prototypowania, takie jak projektowanie wspomagane komputerowo (CAD), płytki stykowe i druk 3D, zrewolucjonizowały dyscypliny mechaniczne, elektryczne i inżynierii lądowej. Możliwość szybkiego przeszukania wielu możliwych rozwiązań danego wyzwania znacznie przyspiesza postęp w danej dziedzinie. Uważamy, że politransfekcja jest analogiczną technologią dla inżynierii biologicznej, umożliwiającą szybkie prototypowanie obwodów genetycznych. Ponadto inne technologie szybkiego prototypowania wymagają praktyczn...

Dziedzina syntetycznej biologii ssaków szybko się rozwinęła, od opracowania prostych części wyczuwania i reagowania w hodowanych liniach komórkowych do optymalizacji złożonych sieci genów w celu sprostania rzeczywistym wyzwaniom w diagnostyce i terapii1. Te wyrafinowane obwody są w stanie wykrywać dane biologiczne, od profili mikroRNA, przez cytokiny, po leki małocząsteczkowe, oraz implementować obwody przetwarzania logicznego, w tym tranzystory, filtry pasmowo-przepustowe, przełączniki dwustabilne i oscylatory. Wykazały również obiecujące wyniki w modelach zwierzęcych chorób takich jak rak, zapalenie stawów, cukrzyca i wiele innych1,2,3,4,5. Jednak wraz ze wzrostem złożoności obwodu optymalizacja poziomów każdego z jego komponentów staje się coraz większym wyzwaniem.
Jednym szczególnie użytecznym typem obwodu genetycznego jest klasyfikator komórek, który można zaprogramować tak, aby wykrywał stany komórkowe i reagował na nie. Selektywna produkcja białek lub RNA w określonych stanach komórkowych jest potężnym narzędziem do kierowania i programowania różnicowania komórek i organoidów, identyfikowania i niszczenia chorych komórek i/lub niepożądanych typów komórek oraz regulowania funkcji komórek terapeutycznych1,2,3,4,5. Jednak stworzenie obwodów w komórkach ssaków, które mogą dokładnie klasyfikować stany komórkowe na podstawie wielu komórkowych gatunków RNA i/lub białek, było bardzo trudne.
Jednym z najbardziej czasochłonnych etapów tworzenia obwodu klasyfikacji komórek jest optymalizacja względnych poziomów ekspresji poszczególnych genów składowych, takich jak czujniki i czynniki przetwarzające, w obwodzie. Aby przyspieszyć optymalizację obwodów i umożliwić budowę bardziej wyrafinowanych obwodów, w ostatnich pracach wykorzystano modelowanie matematyczne obwodów klasyfikatorów komórek i ich komponentów do przewidywania optymalnych składów i topologii6,7. Chociaż do tej pory przyniosło to potężne wyniki, analiza matematyczna jest ograniczona potrzebą systematycznego charakteryzowania zachowania wejścia-wyjścia genów składowych w obwodzie, co jest czasochłonne. Co więcej, w złożonych obwodach genetycznych może pojawić się niezliczona ilość problemów zależnych od kontekstu, powodując, że zachowanie pełnego obwodu wymyka się przewidywaniom opartym na charakterystyce poszczególnych części8,9.
Aby szybciej rozwijać i testować złożone obwody ssaków, takie jak klasyfikatory stanów komórek, nasze laboratorium opracowało technikę zwaną politransfekcją10, ewolucję protokołów kotransfekcji plazmidu. Podczas kotransfekcji wiele plazmidowych gatunków DNA jest kompleksowanych razem z dodatnio naładowanym odczynnikiem lipidowym lub polimerowym, a następnie dostarczanych do komórek w skorelowany sposób (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A). W politransfekcji plazmidy są oddzielnie kompleksowane z odczynnikiem, tak że DNA z każdego kompleksu transfekcji jest dostarczane do komórek w sposób zdeskorelowany (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Korzystając z tej metody, komórki w transfekowanej populacji są wystawione na liczne kombinacje stosunków dwóch lub więcej ładunków DNA przenoszących różne składniki obwodu.
Aby zmierzyć proporcje składników obwodu dostarczanych do każdej komórki, każdy kompleks transfekcyjny w politransfekcji zawiera konstytutywnie wyrażony fluorescencyjny reporter, który służy jako wskaźnik dla komórkowego pobierania kompleksu. Wypełniacz DNA, który nie zawiera żadnych pierwiastków aktywnych w komórce ssaków, służy do dostrajania względnej ilości fluorescencyjnego reportera i składników obwodu dostarczanych do komórki w pojedynczym kompleksie transfekcji i jest omawiany bardziej szczegółowo w dyskusji. Przykładem wypełniacza DNA używanego w laboratorium Weissa jest plazmid zawierający sekwencję terminatora, ale bez promotora, sekwencji kodującej itp. Komórki o różnych proporcjach składników obwodu można następnie porównać, aby znaleźć optymalne proporcje dla funkcji obwodu genu. To z kolei daje użyteczne prognozy dotyczące wyboru promotorów i innych elementów obwodu w celu osiągnięcia optymalnych poziomów ekspresji genów podczas łączenia składników obwodu w jeden wektor w celu integracji genetycznej (np. lentiwirusa, transpozonu lub lądowiska). Tak więc, zamiast wybierać proporcje między składnikami obwodu w oparciu o intuicję lub czasochłonny proces prób i błędów, politransfekcja ocenia szeroki zakres stechiometrii między częściami genetycznymi w reakcji jednogarnkowej.
W naszym laboratorium politransfekcja umożliwiła optymalizację wielu obwodów genetycznych, w tym klasyfikatorów komórkowych, kontrolerów sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego oraz motywów bistabilnych. Ta prosta, ale skuteczna metoda znacznie przyspiesza cykle projektowania złożonych obwodów genetycznych w komórkach ssaków. Od tego czasu politransfekcja została wykorzystana do scharakteryzowania kilku obwodów genetycznych w celu ujawnienia ich wielowymiarowych funkcji transferu wejścia-wyjścia w wysokiej rozdzielczości10, optymalizacji alternatywnej topologii obwodu dla klasyfikacji stanu komórki11, oraz przyspieszenia różnych published12,13 i trwających projektów.
Tutaj opisujemy i opisujemy przebieg pracy przy użyciu politransfekcji do szybkiej optymalizacji obwodu genetycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Protokół pokazuje, jak generować wysokiej jakości dane politransfekcji i unikać kilku typowych błędów w protokole politransfekcji i analizie danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Następnie pokazano, jak wykorzystać politransfekcję do scharakteryzowania prostych elementów obwodu, a w tym procesie porównać wyniki politransfekcji z kotransfekcją (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Wreszcie, wyniki politransfekcji pokazują optymalizację obwodu klasyfikatora nowotworów (<silna klasa="xfig">Rysunek 5).

<table><tbody><tr><td>15 ml probówki stożkowe Corning Falcon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td> 24-dołkowa <td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Dowolna firma do wyboru</td><td></td> <td>(bez pirogenów, sterylnych, RNaz, DNaz, DNA i pirogenów)</td></tr> <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td> Wirówka <td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dowolna</td><td></td> wybrana firma <td>Możliwość wystawienia 15 ml probówek Falcona na 300 rcf</td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Komora do liczenia komórek Szkiełka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>Niekomercyjny pakiet</td><td></td> oprogramowania <td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Używaj nośnika odpowiedniego dla Twojego typu ogniwa</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HEK</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Użyj odpowiedniego typu komórki do swoich eksperymentów. Komórki HEK mają tendencję do bardzo wydajnej transfekcji.</td></tr><tr><td>Ogniwa HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>Użyj odpowiedniego typu ogniwa do swoich eksperymentów.</td></tr><tr><td>Wzmacniacz lipofetaminy 3000 i P3000</td><td>ThermoFisher Scientific L3000001</td><td></td><td>Użyj odczynnika odpowiedniego do Twojego typu komórki; odczynnik do transfekcji i wzmacniacza</td></tr><tr><td>LSRFortessa cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Dowolna firma do wyboru</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific 31985070</td><td></td><td>zredukowana pożywka surowicy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Tęczowe kulki kalibracyjne</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Obwody genetyczne ssaków wykazały potencjał do wykrywania i leczenia szerokiego zakresu stanów chorobowych, ale optymalizacja poziomów komponentów obwodów pozostaje wyzwaniem i pracochłonnym. Aby przyspieszyć ten proces, nasze laboratorium opracowało politransfekcję, wysokoprzepustowe rozszerzenie tradycyjnej transfekcji ssaków. W politransfekcji każda komórka w transfekowanej populacji zasadniczo przeprowadza inny eksperyment, testując zachowanie obwodu przy różnej liczbie kopii DNA i umożliwiając użytkownikom analizę dużej liczby stechiometrii w reakcji jednogarnkowej. Do tej pory zademonstrowano politransfekcje, które optymalizują proporcje obwodów trójskładnikowych w pojedynczej studzience komórek; Zasadniczo tę samą metodę można zastosować do opracowania jeszcze większych obwodów. Wyniki politransfekcji można łatwo zastosować w celu znalezienia optymalnych proporcji DNA do kotransfektu dla obwodów przejściowych lub do wyboru poziomów ekspresji dla składników obwodu w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych.
Tutaj pokazujemy użycie politransfekcji do optymalizacji obwodu trójskładnikowego. Protokół rozpoczyna się od eksperymentalnych zasad projektowania i wyjaśnia, w jaki sposób politransfekcja opiera się na tradycyjnych metodach kotransfekcji. Następnie przeprowadzana jest politransfekcja komórek, a kilka dni później cytometria przepływowa. Na koniec dane są analizowane poprzez badanie wycinków danych cytometrii przepływowej pojedynczej komórki, które odpowiadają podzbiorom komórek o określonych proporcjach składników. W laboratorium politransfekcja została wykorzystana do optymalizacji klasyfikatorów komórek, kontrolerów sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego, motywów bistabilnych i wielu innych. Ta prosta, ale skuteczna metoda przyspiesza cykle projektowania złożonych obwodów genetycznych w komórkach ssaków.

Na Rysunku 1 porównujemy kotransfekcję z politransfekcją. W przypadku kotransfekcji wszystkie plazmidy są dostarczane w tej samej mieszaninie do transfekcji, co skutkuje wysoką korelacją między ilością każdego plazmidu otrzymanego przez pojedynczą komórkę (Rysunek 1A). Chociaż całkowita liczba plazmidów dostarczonych do każdej komórki znacząco się różni, fluorescencja dwóch białek reporterowych w poszczególnych komórkach w całej populacji jest dobrze skorelowana...

Skomplikowane obwody genetyczne są czasochłonne do projektowania, testowania i optymalizacji. Aby ułatwić ten proces, komórki ssaków są transfekowane w sposób, który umożliwia testowanie wielu stechiometrii elementów obwodu w jednym dołku. Protokół ten określa etapy planowania eksperymentu, transfekcji i analizy danych.

Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Nasz protokół ułatwia i przyspiesza zrozumienie relacji między częściami biologicznymi. Możemy przetestować zachowanie wielu kombinacji metrycznych proporcji części w jednym dołku. Technika ta pozwala naukowcom na bardziej kompleksowe scharakteryzowanie złożonych relacji między elementami obwodu z większą wydajnością eksperymentalną niż konwencjonalne podejścia.Metoda ta ma zastosowanie w biologii syntetycznej i we wszelkich kwestiach biologicznych, badając zmiany behawioralne w komórce w odpowiedzi na różne poziomy transfekowanych genów, w których wynik można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Rozpocznij przygotowywanie probówek dla każdego agregatu DNA, odkładając na bok 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe oznaczone jako brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola neonowej zieleni, kontrola wszystkich kolorów, mieszanka politransfekcji jedna i mieszanka politransfekcyjna druga. Dodaj 36 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do kontroli bez koloru, kontroli mKO2, kontroli TagBFP, kontroli neonowej zieleni i wszystkich probówek kontrolnych koloru, a następnie dodaj 18 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej mieszanki politransfekcyjnej jednej i mieszanki politransfekcji dwóch probówek.Następnie dodaj 600 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki bez koloru, 300 nanogramów mKO2 i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru mKO2 i dodaj 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru TagBFP. Do neonowej zielonej probówki kontrolnej koloru dodaj 300 nanogramów konstytutywnej neonowej zieleni i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego, a następnie dodaj 100 nanogramów każdego mKO2, TagBFP, konstytutywnej zieleni neonowej i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej wszystkich kolorów. Do politransfekcji wymieszaj jedną probówkę, dodaj 150 nanogramów mKO2, 75 nanogramów reporterowego neonowego zielonego plazmidu i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego.Do politransfekcji wymieszaj dwie probówki, dodaj 150 nanogramów TagBFP, 75 nanogramów plazmidu L7Ae i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego. Po zakończeniu utwórz główną mieszankę transfekcji w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, łącząc 216 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 9,48 mikrolitrami odczynnika do transfekcji. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, zanim odstawisz na bok.Dodaj 1,58 mikrolitra odczynnika wzmacniającego do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i dodaj 79 mikrolitrów odczynnika wzmacniającego do każdej probówki z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując. Dodaj 37,58 mikrolitra głównej mieszanki transfekcyjnej do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i wymieszaj, energicznie pipetując.Następnie dodaj 18,79 mikrolitra głównej mieszanki do transfekcji do każdej probówki z mieszanką politransfekcji i dobrze wymieszaj każdą probówkę energicznym pipetowaniem. Dozować mieszaniny transfekcyjne do studzienek, pipetując 65,97 mikrolitrów każdej mieszanki transfekcyjnej dla kontroli bez koloru, pojedynczego koloru i wszystkich kolorów do odpowiednich studzienek, a następnie przenieść 32,98 mikrolitrów mieszanki politransfekcyjnej jeden do studzienki politransfekcyjnej i skutecznie rozprowadzić kompleksy, obracając płytkę szybko, ale delikatnie w szczelny, Ułóż wzór na płaskiej powierzchni, a następnie odpipetuj 32,98 mikrolitrów politransfekcji, wymieszaj dwa z tej samej studzienki politransfekcji i zakręć płytką w ten sam sposób. Inkubuj komórki przez dwa dni.Wykonaj cytometrię przepływową, aby odczytać fluorescencję markerów transfekcji i wyjściowy reporter dla każdej komórki. Dobrze przeprowadzona kotransfekcja, odmienna od politransfekcji pokazanej na filmie, pokazuje ścisłą korelację między TagBFP i EYFP, ekspresją plazmidów, które zostały dostarczone jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, źle wykonana kotransfekcja wykazuje słabą korelację między dwoma plazmidami.Dobrze przeprowadzona politransfekcja wykazała dobre pokrycie przestrzeni dwuwymiarowej i dobrą kompensację wszelkich wycieków spektralnych między białkami fluorescencyjnymi. Dane z politransfekcji z małą liczbą żywych komórek były trudne do podzielenia na wystarczającą liczbę komórek w każdym pojemniku do analizy. Politransfekcja o słabej wydajności transfekcji spowodowała rzadkie pokrycie dwuwymiarowej przestrzeni do analizy.Efektywny stosunek DNA do ekspresji wyjściowej badano, umieszczając białko represorowe, L7Ae z mKO2 i białko wyjściowe, neonową zieleń z TagBFP, w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych. Ekspresja neonowej zieleni była następnie monitorowana na różnych poziomach mKO2 i TagBFP. Porównano wyniki kotransfekcji i politransfekcji dla tego obwodu.Wyniki 11 indywidualnych kotransfekcji, które łączyły pokazane wcześniej części DNA, zostały zestawione w jeden zestaw danych i porównane z danymi z politransfekcji. Porównanie krzywych odpowiedzi na dawkę L7Ae tłumiących reporter wyjściowy wykazało, że mediana poziomu wyjściowego na pojemnik była bardzo podobna między danymi z kotransfekcji i politransfekcji. Wykazano udane zastosowanie politransfekcji w celu optymalizacji klasyfikatora typów komórek.Mikro RNA-21 obecny w komórkach HeLa i komórkach nie-HEK działa w celu obniżenia ekspresji BM3R1, ponieważ BM3R1 hamuje produkcję obwodu wyjściowego mKO2. Gdy mikro RNA 21 jest obecny w komórce, ekspresja mKO2 zostanie włączona. Ilość Gal4-VP16 dostraja ekspresję mKO2 przy niskich poziomach BM3R1.Każdy element obwodu został dostarczony razem z innym markerem fluorescencyjnym. Ta politransfekcja określa ilościowo, ile każdego składnika obwodu otrzymało każde ogniwo. mKO2 jest wytwarzany w MIR21, wytwarzając komórki HeLa, ale nie w komórkach HEK.Wyjście mKO2 analizowano po dostarczeniu tych elementów obwodu w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych z odrębnymi reporterami fluorescencyjnymi, aby wskazać ilość każdego składnika obwodu odbieranego przez określone ogniwo. To podpróbkowanie przewidywało, że przy tym stosunku obwód współtransfekowany miał 91% swoistości, 62% czułości i 77% dokładności, podczas klasyfikacji komórek HEK293 w porównaniu z HeLa. Najczęstszym problemem w tym protokole jest brak ścisłej korelacji w każdej mieszance transfekcyjnej.Pamiętaj więc, aby energicznie wymieszać probówki do transfekcji zaraz po dodaniu odczynnika wzmacniającego, a następnie delikatnie mieszać i pipetować probówki do transfekcji po dodaniu mieszanki transfekcyjnej zawierającej lipidy Składniki genetyczne w tej procedurze można zastąpić dowolnymi innymi składnikami genetycznymi, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące ich funkcjonowania w różnych środowiskach. Metoda ta szybko rozwinęła obwody genetyczne, takie jak klasyfikatory komórkowe, kontrolery sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego, motywy bistabilne i wiele innych.

rapid-development-cell-state-identification-circuits-with-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Poznaj metodę szybkiego projektowania obwodów genetycznych z wykorzystaniem politransfekcji komórek ssaków. Technika ta umożliwia testowanie wielu stosunków stoichiometrycznych w jednej próbce, zwiększając efektywność eksperymentalną w biologii syntetycznej.

Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

Przeglądaj więcej filmów