Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją
February 24th, 2023
Skomplikowane obwody genetyczne są czasochłonne do projektowania, testowania i optymalizacji. Aby ułatwić ten proces, komórki ssaków są transfekowane w sposób, który umożliwia testowanie wielu stechiometrii elementów obwodu w jednym dołku. Protokół ten określa etapy planowania eksperymentu, transfekcji i analizy danych.
Nasz protokół ułatwia i przyspiesza zrozumienie relacji między częściami biologicznymi. Możemy przetestować zachowanie wielu kombinacji metrycznych proporcji części w jednym dołku. Technika ta pozwala naukowcom na bardziej kompleksowe scharakteryzowanie złożonych relacji między elementami obwodu z większą wydajnością eksperymentalną niż konwencjonalne podejścia.
Metoda ta ma zastosowanie w biologii syntetycznej i we wszelkich kwestiach biologicznych, badając zmiany behawioralne w komórce w odpowiedzi na różne poziomy transfekowanych genów, w których wynik można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Rozpocznij przygotowywanie probówek dla każdego agregatu DNA, odkładając na bok 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe oznaczone jako brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola neonowej zieleni, kontrola wszystkich kolorów, mieszanka politransfekcji jedna i mieszanka politransfekcyjna druga. Dodaj 36 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do kontroli bez koloru, kontroli mKO2, kontroli TagBFP, kontroli neonowej zieleni i wszystkich probówek kontrolnych koloru, a następnie dodaj 18 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej mieszanki politransfekcyjnej jednej i mieszanki politransfekcji dwóch probówek.
Następnie dodaj 600 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki bez koloru, 300 nanogramów mKO2 i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru mKO2 i dodaj 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru TagBFP. Do neonowej zielonej probówki kontrolnej koloru dodaj 300 nanogramów konstytutywnej neonowej zieleni i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego, a następnie dodaj 100 nanogramów każdego mKO2, TagBFP, konstytutywnej zieleni neonowej i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej wszystkich kolorów. Do politransfekcji wymieszaj jedną probówkę, dodaj 150 nanogramów mKO2, 75 nanogramów reporterowego neonowego zielonego plazmidu i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego.
Do politransfekcji wymieszaj dwie probówki, dodaj 150 nanogramów TagBFP, 75 nanogramów plazmidu L7Ae i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego. Po zakończeniu utwórz główną mieszankę transfekcji w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, łącząc 216 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 9,48 mikrolitrami odczynnika do transfekcji. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, zanim odstawisz na bok.
Dodaj 1,58 mikrolitra odczynnika wzmacniającego do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i dodaj 79 mikrolitrów odczynnika wzmacniającego do każdej probówki z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując. Dodaj 37,58 mikrolitra głównej mieszanki transfekcyjnej do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i wymieszaj, energicznie pipetując.
Następnie dodaj 18,79 mikrolitra głównej mieszanki do transfekcji do każdej probówki z mieszanką politransfekcji i dobrze wymieszaj każdą probówkę energicznym pipetowaniem. Dozować mieszaniny transfekcyjne do studzienek, pipetując 65,97 mikrolitrów każdej mieszanki transfekcyjnej dla kontroli bez koloru, pojedynczego koloru i wszystkich kolorów do odpowiednich studzienek, a następnie przenieść 32,98 mikrolitrów mieszanki politransfekcyjnej jeden do studzienki politransfekcyjnej i skutecznie rozprowadzić kompleksy, obracając płytkę szybko, ale delikatnie w szczelny, Ułóż wzór na płaskiej powierzchni, a następnie odpipetuj 32,98 mikrolitrów politransfekcji, wymieszaj dwa z tej samej studzienki politransfekcji i zakręć płytką w ten sam sposób. Inkubuj komórki przez dwa dni.
Wykonaj cytometrię przepływową, aby odczytać fluorescencję markerów transfekcji i wyjściowy reporter dla każdej komórki. Dobrze przeprowadzona kotransfekcja, odmienna od politransfekcji pokazanej na filmie, pokazuje ścisłą korelację między TagBFP i EYFP, ekspresją plazmidów, które zostały dostarczone jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, źle wykonana kotransfekcja wykazuje słabą korelację między dwoma plazmidami.
Dobrze przeprowadzona politransfekcja wykazała dobre pokrycie przestrzeni dwuwymiarowej i dobrą kompensację wszelkich wycieków spektralnych między białkami fluorescencyjnymi. Dane z politransfekcji z małą liczbą żywych komórek były trudne do podzielenia na wystarczającą liczbę komórek w każdym pojemniku do analizy. Politransfekcja o słabej wydajności transfekcji spowodowała rzadkie pokrycie dwuwymiarowej przestrzeni do analizy.
Efektywny stosunek DNA do ekspresji wyjściowej badano, umieszczając białko represorowe, L7Ae z mKO2 i białko wyjściowe, neonową zieleń z TagBFP, w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych. Ekspresja neonowej zieleni była następnie monitorowana na różnych poziomach mKO2 i TagBFP. Porównano wyniki kotransfekcji i politransfekcji dla tego obwodu.
Wyniki 11 indywidualnych kotransfekcji, które łączyły pokazane wcześniej części DNA, zostały zestawione w jeden zestaw danych i porównane z danymi z politransfekcji. Porównanie krzywych odpowiedzi na dawkę L7Ae tłumiących reporter wyjściowy wykazało, że mediana poziomu wyjściowego na pojemnik była bardzo podobna między danymi z kotransfekcji i politransfekcji. Wykazano udane zastosowanie politransfekcji w celu optymalizacji klasyfikatora typów komórek.
Mikro RNA-21 obecny w komórkach HeLa i komórkach nie-HEK działa w celu obniżenia ekspresji BM3R1, ponieważ BM3R1 hamuje produkcję obwodu wyjściowego mKO2. Gdy mikro RNA 21 jest obecny w komórce, ekspresja mKO2 zostanie włączona. Ilość Gal4-VP16 dostraja ekspresję mKO2 przy niskich poziomach BM3R1.
Każdy element obwodu został dostarczony razem z innym markerem fluorescencyjnym. Ta politransfekcja określa ilościowo, ile każdego składnika obwodu otrzymało każde ogniwo. mKO2 jest wytwarzany w MIR21, wytwarzając komórki HeLa, ale nie w komórkach HEK.
Wyjście mKO2 analizowano po dostarczeniu tych elementów obwodu w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych z odrębnymi reporterami fluorescencyjnymi, aby wskazać ilość każdego składnika obwodu odbieranego przez określone ogniwo. To podpróbkowanie przewidywało, że przy tym stosunku obwód współtransfekowany miał 91% swoistości, 62% czułości i 77% dokładności, podczas klasyfikacji komórek HEK293 w porównaniu z HeLa. Najczęstszym problemem w tym protokole jest brak ścisłej korelacji w każdej mieszance transfekcyjnej.
Pamiętaj więc, aby energicznie wymieszać probówki do transfekcji zaraz po dodaniu odczynnika wzmacniającego, a następnie delikatnie mieszać i pipetować probówki do transfekcji po dodaniu mieszanki transfekcyjnej zawierającej lipidy Składniki genetyczne w tej procedurze można zastąpić dowolnymi innymi składnikami genetycznymi, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące ich funkcjonowania w różnych środowiskach. Metoda ta szybko rozwinęła obwody genetyczne, takie jak klasyfikatory komórkowe, kontrolery sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego, motywy bistabilne i wiele innych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół upraszcza projektowanie i testowanie złożonych obwodów genetycznych, umożliwiając testowanie wielu stechiometrii komponentów obwodu w jednej kryzance. Badacze mogą wydajnie charakteryzować relacje między częściami biologicznymi i ich zachowania w odpowiedzi na różne poziomy transfekowanych genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia syntetyczna
- Inżynieria genetyczna
- Biologia komórki
Tło
- Złożone obwody genetyczne są trudne do zaprojektowania i optymalizacji.
- Konwencjonalne metody często są czasochłonne i mniej wydajne.
- Cytometria przepływowa może mierzyć wyjście transfekowanych genów.
- Ten protokół ma na celu poprawę wydajności eksperymentu.
Cel badania
- Aby ułatwić testowanie wielu komponentów obwodu genetycznego.
- Aby poprawić zrozumienie relacji między częściami biologicznymi.
- Aby umożliwić kompleksową charakteryzację zachowań obwodu.
Stosowane metody
- Transfekcja komórek ssaczy z różnymi agregatami DNA.
- Przygotowanie mikro probówek centryfugowych dla różnych kontroli i mieszanek.
- Zastosowanie ośrodka z zmniejszonym stężeniem surowicy dla optymalnych warunków transfekcji.
- Pomiar wyjść za pomocą cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Efektywne testowanie wielu stechiometrii w jednej kryzance.
- Lepsze zrozumienie złożonych relacji między komponentami.
- Większa wydajność eksperymentu w porównaniu do metod tradycyjnych.
- Zastosowanie do różnych pytań biologicznych.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza projektowanie i testowanie obwodów genetycznych.
- Umożliwia bardziej kompleksową analizę zachowań obwodu.
- Badaczom pozwala na skuteczne badanie wpływu różnych poziomów genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Poly-transfection enables rapid, high-throughput optimization of mammalian genetic circuits by allowing simultaneous testing of multiple DNA stoichiometries in a single well. This approach accelerates the design-build-test cycle for cell state identification circuits, supporting predictive confidence and functional target validation in early discovery. The method streamlines portfolio triage by providing robust quantitative data for complex synthetic biology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of genetic circuit component relationships in mammalian cells.
- Supports functional de-risking and target validation by quantifying circuit behavior across diverse stoichiometries.
- Facilitates rapid hypothesis testing for cell classifier and regulatory motif development.
- Provides actionable data for prioritizing circuit designs with optimal specificity and sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via flow cytometry for robust assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of circuit performance in a single-pot format.
- Supports scalable optimization of multi-component genetic constructs for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell state identification circuits with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Provides quantitative specificity, sensitivity, and accuracy metrics for preclinical model selection.
- Reduces mechanistic ambiguity in circuit-driven cell classification and functional readouts.
- Supports risk-adjusted advancement of synthetic biology assets into preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
Poly-transfection integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid optimization of genetic circuits for downstream translational and preclinical workflows.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification by mapping circuit output to DNA input ratios.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry data for assay readiness and platform reuse.
- Analytics: Enables binning and statistical comparison of circuit performance across multiple conditions in a single experiment.
- Translational Research: Supports alignment of circuit outputs with disease-relevant cell states and biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, generalizable workflow for rapid optimization of diverse genetic circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic circuit optimization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transfection and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of synthetic biology assets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and flow cytometry analysis.
- Demands access to high-throughput flow cytometry and robust data analytics infrastructure.
- Necessitates rigorous mixing and pipetting protocols to ensure reproducibility across transfection mixes.
- May require adaptation of fluorescent markers and circuit components for different cell types or model systems.
- Dependent on sufficient transfection efficiency and live cell numbers for robust statistical analysis.
