Szybki rozwój obwodów identyfikacji stanu komórki z politransfekcją

Nasz protokół ułatwia i przyspiesza zrozumienie relacji między częściami biologicznymi. Możemy przetestować zachowanie wielu kombinacji metrycznych proporcji części w jednym dołku. Technika ta pozwala naukowcom na bardziej kompleksowe scharakteryzowanie złożonych relacji między elementami obwodu z większą wydajnością eksperymentalną niż konwencjonalne podejścia.

Metoda ta ma zastosowanie w biologii syntetycznej i we wszelkich kwestiach biologicznych, badając zmiany behawioralne w komórce w odpowiedzi na różne poziomy transfekowanych genów, w których wynik można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Rozpocznij przygotowywanie probówek dla każdego agregatu DNA, odkładając na bok 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe oznaczone jako brak kontroli koloru, kontrola mKO2, kontrola TagBFP, kontrola neonowej zieleni, kontrola wszystkich kolorów, mieszanka politransfekcji jedna i mieszanka politransfekcyjna druga. Dodaj 36 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do kontroli bez koloru, kontroli mKO2, kontroli TagBFP, kontroli neonowej zieleni i wszystkich probówek kontrolnych koloru, a następnie dodaj 18 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej mieszanki politransfekcyjnej jednej i mieszanki politransfekcji dwóch probówek.

Następnie dodaj 600 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki bez koloru, 300 nanogramów mKO2 i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru mKO2 i dodaj 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej koloru TagBFP. Do neonowej zielonej probówki kontrolnej koloru dodaj 300 nanogramów konstytutywnej neonowej zieleni i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego, a następnie dodaj 100 nanogramów każdego mKO2, TagBFP, konstytutywnej zieleni neonowej i 300 nanogramów plazmidu wypełniającego do probówki kontrolnej wszystkich kolorów. Do politransfekcji wymieszaj jedną probówkę, dodaj 150 nanogramów mKO2, 75 nanogramów reporterowego neonowego zielonego plazmidu i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego.

Do politransfekcji wymieszaj dwie probówki, dodaj 150 nanogramów TagBFP, 75 nanogramów plazmidu L7Ae i 75 nanogramów plazmidu wypełniającego. Po zakończeniu utwórz główną mieszankę transfekcji w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, łącząc 216 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 9,48 mikrolitrami odczynnika do transfekcji. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, zanim odstawisz na bok.

Dodaj 1,58 mikrolitra odczynnika wzmacniającego do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i dodaj 79 mikrolitrów odczynnika wzmacniającego do każdej probówki z mieszanką politransfekcji. Wymieszaj każdą probówkę z osobna, energicznie pipetując. Dodaj 37,58 mikrolitra głównej mieszanki transfekcyjnej do probówek bez kontroli koloru, kontroli pojedynczego koloru i wszystkich probówek do kontroli koloru i wymieszaj, energicznie pipetując.

Następnie dodaj 18,79 mikrolitra głównej mieszanki do transfekcji do każdej probówki z mieszanką politransfekcji i dobrze wymieszaj każdą probówkę energicznym pipetowaniem. Dozować mieszaniny transfekcyjne do studzienek, pipetując 65,97 mikrolitrów każdej mieszanki transfekcyjnej dla kontroli bez koloru, pojedynczego koloru i wszystkich kolorów do odpowiednich studzienek, a następnie przenieść 32,98 mikrolitrów mieszanki politransfekcyjnej jeden do studzienki politransfekcyjnej i skutecznie rozprowadzić kompleksy, obracając płytkę szybko, ale delikatnie w szczelny, Ułóż wzór na płaskiej powierzchni, a następnie odpipetuj 32,98 mikrolitrów politransfekcji, wymieszaj dwa z tej samej studzienki politransfekcji i zakręć płytką w ten sam sposób. Inkubuj komórki przez dwa dni.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby odczytać fluorescencję markerów transfekcji i wyjściowy reporter dla każdej komórki. Dobrze przeprowadzona kotransfekcja, odmienna od politransfekcji pokazanej na filmie, pokazuje ścisłą korelację między TagBFP i EYFP, ekspresją plazmidów, które zostały dostarczone jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, źle wykonana kotransfekcja wykazuje słabą korelację między dwoma plazmidami.

Dobrze przeprowadzona politransfekcja wykazała dobre pokrycie przestrzeni dwuwymiarowej i dobrą kompensację wszelkich wycieków spektralnych między białkami fluorescencyjnymi. Dane z politransfekcji z małą liczbą żywych komórek były trudne do podzielenia na wystarczającą liczbę komórek w każdym pojemniku do analizy. Politransfekcja o słabej wydajności transfekcji spowodowała rzadkie pokrycie dwuwymiarowej przestrzeni do analizy.

Efektywny stosunek DNA do ekspresji wyjściowej badano, umieszczając białko represorowe, L7Ae z mKO2 i białko wyjściowe, neonową zieleń z TagBFP, w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych. Ekspresja neonowej zieleni była następnie monitorowana na różnych poziomach mKO2 i TagBFP. Porównano wyniki kotransfekcji i politransfekcji dla tego obwodu.

Wyniki 11 indywidualnych kotransfekcji, które łączyły pokazane wcześniej części DNA, zostały zestawione w jeden zestaw danych i porównane z danymi z politransfekcji. Porównanie krzywych odpowiedzi na dawkę L7Ae tłumiących reporter wyjściowy wykazało, że mediana poziomu wyjściowego na pojemnik była bardzo podobna między danymi z kotransfekcji i politransfekcji. Wykazano udane zastosowanie politransfekcji w celu optymalizacji klasyfikatora typów komórek.

Mikro RNA-21 obecny w komórkach HeLa i komórkach nie-HEK działa w celu obniżenia ekspresji BM3R1, ponieważ BM3R1 hamuje produkcję obwodu wyjściowego mKO2. Gdy mikro RNA 21 jest obecny w komórce, ekspresja mKO2 zostanie włączona. Ilość Gal4-VP16 dostraja ekspresję mKO2 przy niskich poziomach BM3R1.

Każdy element obwodu został dostarczony razem z innym markerem fluorescencyjnym. Ta politransfekcja określa ilościowo, ile każdego składnika obwodu otrzymało każde ogniwo. mKO2 jest wytwarzany w MIR21, wytwarzając komórki HeLa, ale nie w komórkach HEK.

Wyjście mKO2 analizowano po dostarczeniu tych elementów obwodu w oddzielnych mieszankach transfekcyjnych z odrębnymi reporterami fluorescencyjnymi, aby wskazać ilość każdego składnika obwodu odbieranego przez określone ogniwo. To podpróbkowanie przewidywało, że przy tym stosunku obwód współtransfekowany miał 91% swoistości, 62% czułości i 77% dokładności, podczas klasyfikacji komórek HEK293 w porównaniu z HeLa. Najczęstszym problemem w tym protokole jest brak ścisłej korelacji w każdej mieszance transfekcyjnej.

Pamiętaj więc, aby energicznie wymieszać probówki do transfekcji zaraz po dodaniu odczynnika wzmacniającego, a następnie delikatnie mieszać i pipetować probówki do transfekcji po dodaniu mieszanki transfekcyjnej zawierającej lipidy Składniki genetyczne w tej procedurze można zastąpić dowolnymi innymi składnikami genetycznymi, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące ich funkcjonowania w różnych środowiskach. Metoda ta szybko rozwinęła obwody genetyczne, takie jak klasyfikatory komórkowe, kontrolery sprzężenia zwrotnego i sprzężenia zwrotnego, motywy bistabilne i wiele innych.