Name: Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj protokół dysocjacji tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwia badanie nowotworów trzustki i zmian przednowotworowych, wspierając identyfikację nowych biomarkerów oraz terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Avital Sarusi-Portuguez za pomoc w analizie danych oraz dr Dror Kolodkin-Gal za pomoc w ustaleniu protokołu w poprzednim badaniu. Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium Parnas. Dziękujemy dr Gillian Kay i dr Michaelowi Kanovsky'emu za pomoc w montażu. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z grantu Izraelskiej Fundacji Naukowej (nr 526/18 O.P.), programu Alex U. Soyka oraz grantu z Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem (Nagroda za Rozwój Kariery Badawczej).

Wspólny komitet etyki (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Hebrajskiego (Jerozolima, Izrael) i Hadassah Medical Center (Jerozolima, Izrael) zatwierdził protokół badania dobrostanu zwierząt (MD-18-15417-5 "Dynamika tkanek w raku trzustki u myszy"), a przedstawiony tutaj protokół był zgodny ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi testów i badań na zwierzętach. Uniwersytet Hebrajski jest instytucją akredytowaną na arenie międzynarodowej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (Stowarzyszenie na rzecz Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi).
UWAGA: Szczep myszy #007908, #019378 i #008179 pochodzą z laboratorium Jacksona. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) powstały przez skrzyżowanie powyższych szczepów. Do badania wykorzystano myszy obu płci w wieku od 6 tygodni do 15 miesięcy. Tamoksyfen przygotowywano przez rozpuszczenie proszku w oleju kukurydzianym. Dorosłym myszom (w wieku 6-8 tygodni, samice i samce) wstrzyknięto tamoksyfen podskórnie w dniach 0 i 2 w dawce 400 mg/kg mc. i badano dwa razy w tygodniu po wstrzyknięciu. Nie było możliwe zmierzenie guzów, ponieważ były one zlokalizowane wewnętrznie; Dlatego eutanazja była wykonywana, jeśli zaobserwowano nieprawidłowe objawy kliniczne zgodnie z protokołem etycznym. Myszy poddano eutanazji w różnych punktach czasowych po indukcji tamoksyfenu, przy użyciu izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy.
1. Rozwarstwienie trzustki
UWAGA: Dla optymalnej wydajności podczas ekstrakcji i zapewnienia dobrej żywotności komórek, kluczowe znaczenie ma szybka sekcja. Aby skrócić czas potrzebny na izolację trzustki, wszystkie instrumenty i sprzęt muszą być gotowe na lodzie przed eutanazją myszy.
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 i zweryfikuj za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Od tego momentu wszystkie zabiegi muszą być wykonywane przy użyciu sterylnych narzędzi sekcyjnych.</li>
	<li>Napraw mysz i spryskaj brzuch 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V o długości 2,5 cm w okolicy narządów płciowych za pomocą nożyczek i kleszczy i przejdź w górę, aby całkowicie otworzyć jamę brzuszną.</li>
	<li>Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy. Zlokalizuj trzustkę, która znajduje się w pobliżu śledziony. Oddziel trzustkę od żołądka i dwunastnicy za pomocą dwóch kleszczy (bez rozdzierania). Kontynuuj i oddziel trzustkę od jelita cienkiego, jelita czczego i jelita krętego.</li>
	<li>Przesuń trzustkę na prawą stronę myszy. Oddziel pozostałe połączenia między trzustką a jamą piersiową za pomocą kleszczy, aby całkowicie odłączyć trzustkę i przyczepioną śledzionę.</li>
	<li>Wyjąć trzustkę i rozłożyć ją do badania na szalce Petriego na lodzie. 
	UWAGA: Podczas tego kroku należy zachować ostrożność, aby usunąć tylko trzustkę, a nie tkankę tłuszczową krezkową lub inną sąsiednią tkankę wraz z trzustką, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek.</li>
</ol>
2. Enzymatyczna i mechaniczna dysocjacja trzustki
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej następujące.
	<ol>
		<li>Bufor dysocjacyjny 1: 4 ml trypsyny C + 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz tabela 1) dla każdej próbki.</li>
		<li>Bufor dysocjacyjny 2: 9 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) 1x; 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA); 1 ml kolagenazy P (10 mg/ml); 200 μl inhibitora trypsyny (10 mg/ml); i 200 μl DNazy I (10 mg/ml) (patrz Tabela 1).</li>
		<li>Bufor do przemywania : 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml inhibitora trypsyny (10 mg / ml) i 1 ml DNazy 1 (10 mg / ml).</li>
		<li>Roztwór zatrzymujący aktywność enzymów: HBSS 1x zawierający 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 150 g DNazy I (0,2 mg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Wypłucz trzustkę w 10% FBS w HBSS 1x. Tkanka tłuszczowa będzie unosić się na wodzie, a trzustka opadnie. Jest to łatwy sposób na wizualizację i szybkie usunięcie zanieczyszczającej białej tkanki tłuszczowej, która nadal jest przyczepiona do trzustki.</li>
	<li>Przenieść tkankę trzustki myszy na sterylną szalkę Petriego zawierającą 5 ml HBSS 1x na lodzie. Pokrój trzustkę na małe kawałki o grubości od 1 do 3 mm3 za pomocą nożyczek Noyes i skalpela (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A). W przypadku więcej niż jednej próbki, próbki należy przechowywać na lodzie w 10% FBS/HBSS 1x.</li>
	<li>Przenieś tkanki do probówki wirówkowej. Wirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odessać i wyrzucić supernatant w celu usunięcia fragmentów komórek i komórek krwi.</li>
	<li>Zawiesić kawałki w buforze dysocjacyjnym 1 zawierającym 0,02% trypsyny C-0,05% EDTA na 10 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem (180 obr./min). Natychmiast umyć 10% modyfikowanym medium Eagle's (DMEM) firmy FBS/Dulbecco. Wirować przez 5 minut w temperaturze 350 g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć ponownie, ponownie zawieszając osad w 10 ml buforu do przemywania i odwirowując przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C przed następnym etapem dysocjacji.</li>
	<li>Inkubować trzustkę w buforze dysocjacyjnym 2 przez 15 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem (180 obr./min).</li>
	<li>Po 15 minutach przeprowadzić dysocjację mechaniczną, energicznie pipetując fragmenty trzustki w górę i w dół w sterylnych pipetach o zmniejszającym się rozmiarze (pipety serologiczne 25, 10 i 5 ml) 10 razy i przywrócić do temperatury 37 °C.
	<ol>
		<li>Po dodatkowych 5 minutach powtórzyć dysocjację mechaniczną i użyć mikroskopii świetlnej do monitorowania dysocjacji w zależności od ilości zawiesiny pojedynczej komórki. Zwykle, jeśli na tym etapie mniej niż 90% zawiesiny składa się z izolowanych pojedynczych komórek, potrzebny jest dłuższy czas inkubacji. Użyj trypana niebieskiego do monitorowania żywotności komórek.</li>
		<li>Kontynuować inkubację i pobierać próbki w celu wykrycia dysocjacji co 5 minut 
		UWAGA: Całkowity czas inkubacji zależy od tkanki i może się różnić w zależności od próbki. Inkubacja i dysocjacja tkanek powinny zakończyć się, gdy 90% komórek zostanie rozdzielonych na pojedyncze komórki lub gdy wykryte zostanie zmniejszenie żywotności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po tym, jak tkanka trzustki jest dobrze zdysocjowana (co odpowiada zanikowi fragmentów trzustki i rosnącemu zmętnieniu roztworu) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), zatrzymaj reakcję enzymatyczną, przemywając dwukrotnie roztwór zatrzymujący aktywność enzymu na 5 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 70 μm i sprawdź żywotność komórek pod mikroskopem. Mniejsze rozmiary siatki nylonowej mogą zmniejszyć żywotność komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i przepłukać osad 5-10 ml lodowato zimnego, buforowanego roztworu do mycia. Policz komórki.</li>
	<li>Jeśli zaobserwuje się kilka czerwonych krwinek, należy je traktować buforem do lizy czerwonych krwinek przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. W przypadkach, gdy obserwuje się grudki, próbkę należy ponownie potraktować trypsyną, jak opisano w kroku 2.5. Żywotność wykrywa się za pomocą błękitu trypanowego pod mikroskopem, a jeśli żywotność jest mniejsza niż 80%, żywe komórki należy wyizolować za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z kolumnami MACS MS (patrz Tabela 1).</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+single-cell+RNA-seq+highlights+intra-tumoral+heterogeneity+and+malignant+progression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell Research. 29 (9), 777(2019).</li>
<li>Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+progression+in+the+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetic progression in the pancreatic ducts.</a> The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).</li>
<li>Schlesinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+pancreatic+preinvasive+lesions+and+cancer+reveal+acinar+metaplastic+cells%27+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).</li>
<li>Kolodkin-Gal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senolytic+elimination+of+Cox2-expressing+senescent+cells+inhibits+the+growth+of+premalignant+pancreatic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions.</a> Gut. 71 (2), 345-355 (2021).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li>
<li>Elyada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+single-cell+analysis+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+reveals+antigen-presenting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.</a> Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).</li>
<li>Bernard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+pancreatic+cancer+precursors+demonstrates+epithelial+and+microenvironmental+heterogeneity+as+an+early+event+in+neoplastic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression.</a> Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).</li>
<li>Moncada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+microarray-based+spatial+transcriptomics+and+single-cell+RNA-seq+reveals+tissue+architecture+in+pancreatic+ductal+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas.</a> Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptome+profiling+of+pancreatic+cancer+identifies+multicellular+dynamics+associated+with+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment.</a> Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).</li>
<li>Cui Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+drivers+and+transitional+cell+populations+cooperate+with+the+microenvironment+in+untreated+and+chemo-resistant+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym artykule przedstawiamy protokół dysocjacji tkanek trzustkowych. Protokół jest prosty, łatwy w użyciu i zapewnia narzędzie do izolowania żywotnych pojedynczych komórek z tkanki trzustki na różnych etapach procesu nowotworowego, w tym guzów litych. W poprzednich badaniach do trawienia trzustki stosowano różne rodzaje kolagenaz 8,9. Stosowanie bardzo silnej kolagenazy, takiej jak kolagenaza D, skutkuje dużą populacją komórek odpornościowych i niższym odsetkiem...

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej agresywnych typów nowotworów1. Dowody kliniczne potwierdzają pogląd, że PDAC rozwija się z komórek układu zewnątrzwydzielniczego, w tym komórek groniastych, przez wiele lat, napędzanych przez mutacje w protoonkogenach KRAS klasy protoonkogenów<sup='xref'>2.
Guzy trzustki obejmują wiele różnych typów komórek, a wykazano, że komórki nowotworowe stanowią tylko 20%-50% masy guza3. Różne typy komórek oddziałują z komórkami nabłonka, wspomagają ich transformację oraz zwiększają powstawanie i wzrost guza. Wczesne zdarzenia powodują metaplazję zrazik, która prowadzi do mikroskopijnych zmian zwanych śródnabłonkową neoplazją trzustki (PanINs), które w niektórych przypadkach mogą przekształcić się w PDAC4.
Istnieje krytyczna potrzeba zbadania tych interakcji i ukierunkowania na kluczowe sygnały. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) to potężna metoda, która ujawnia ekspresję genów w rozdzielczości pojedynczej komórki, śledząc w ten sposób zmiany, jakie zachodzą w komórkach nabłonkowych, umożliwiając w ten sposób badanie rozwoju raka trzustki. 
Sekcja tkanek i trawienie do pojedynczych komórek to pierwszy etap eksperymentu z sekwencją scRNA. Kilka czynników sprawia, że trawienie tkanki trzustki jest szczególnie trudne: i) komórki groniaste stanowią ponad 90% trzustki, a komórki groniaste zawierają duże ilości enzymów trawiennych, w tym proteaz i RNaz, które obniżają jakość bibliotek opartych na RNA; (ii) komórki groniaste są bardzo wrażliwe i mogą ulegać lizie, jeśli stosowane są standardowe protokoły; (iii) Komórki groniaste wyrażają niewielką liczbę genów na bardzo wysokich poziomach. Dlatego, jeśli komórki te zostaną poddane lizie podczas eksperymentu, może to zanieczyścić obserwowany profil ekspresji genów innych komórek; (iv) Tkanka trzustki odzyskana z guzów jest desmoplastyczna, co utrudnia jej preparację bez uszkodzenia komórek. Tak więc, mimo że wymagane jest utrzymanie wysokiej żywotności wszystkich typów komórek, duża liczba i wrażliwość komórek groniastych dodatkowo komplikuje sprawę. Czynniki te utrudniają uzyskanie zawiesiny pojedynczej komórki, która jest w ponad 80% żywotna i nie ma grudek, co jest wymagane w eksperymentach z sekwencją scRNA. 
Tutaj opracowaliśmy protokół z użyciem trypsyny C i kolagenazy P, wraz z częstym monitorowaniem tkanek. Wspiera to dysocjację do pojedynczych komórek, zachowując jednocześnie wysoką żywotność, aby wspierać sukces eksperymentów z sekwencją scRNA5,6.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik lub Zasób</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; M Siatka nylonowa&nbsp;</td><td></td><td>Corning cat##431751</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat# A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td></td><td>Roche cat# 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Critical Commercial Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>cat#MBD0015</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Modele eksperymentalne: Organizmy/ Szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca Ameryka Południowoamerykańska</td><td></td><td>ThermoFisher Cat#10270106</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>kat#02-018-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>KRASLSL-G12D myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX008179</td><td></td></tr><tr><td>MACS zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Milteny Biotec</td><td>cat#130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>kat#02-023-1A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX019378</td><td></td></tr><tr><td>Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX007908</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna C-EDTA 0.05%</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>kat.# 03-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna inhibitor</td><td></td><td>Roche cat#T6522</td><td></td></tr></tbody></table>

wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

Trzustka składa się z dwóch głównych systemów: układu hormonalnego, który produkuje i wydziela hormony, oraz systemu zewnątrzwydzielniczego, który stanowi około 90% trzustki i zawiera komórki, które produkują i wydzielają enzymy trawienne. Enzymy trawienne są wytwarzane w komórkach groniastych trzustki, przechowywane w pęcherzykach zwanych zymogenami, a następnie są uwalniane do dwunastnicy przez przewód trzustkowy w celu zainicjowania procesów metabolicznych. Enzymy wytwarzane przez komórki groniaste mogą zabijać komórki lub degradować bezkomórkowe RNA. Ponadto komórki groniaste są delikatne, a powszechne protokoły dysocjacji skutkują dużą liczbą martwych komórek i bezkomórkowymi proteazami i RNazami. Dlatego jednym z największych wyzwań w trawieniu tkanki trzustki jest odzyskanie nienaruszonych i żywotnych komórek, zwłaszcza komórek groniastych. Protokół przedstawiony w tym artykule przedstawia dwuetapową metodę, którą opracowaliśmy, aby zaspokoić tę potrzebę. Protokół może być stosowany do trawienia normalnej trzustki, trzustki, która zawiera zmiany przednowotworowe lub guzów trzustki, które obejmują dużą liczbę komórek zrębu i komórek odpornościowych.

W niedawno opublikowanej pracy5 zastosowaliśmy opisany powyżej protokół do zbadania wczesnych etapów rozwoju PDAC z wykorzystaniem modelu mysiego. Mysz została zmodyfikowana genetycznie w celu wprowadzenia kaset&#160;Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, które umożliwiają ekspresję konstytutywnie aktywnego KRAS w komórkach acynarnych po wstrzyknięciu tamoksyfenu.
Po zwichnięciu stawów szyjnych (zg...

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Zademonstrowany protokół dysocjacji tkanki trzustki jest prosty i stanowi narzędzie do izolowania żywotnych pojedynczych komórek z tkanki trzustki na różnych etapach procesu nowotworowego, w tym guzów litych. Odzyskanie nienaruszonych i żywotnych komórek groniastych jest poważnym wyzwaniem. Protokół może odzyskać żywe pojedyncze komórki z normalnej trzustki, trzustki ze zmianami przednowotworowymi lub guzami trzustki zawierającymi liczne komórki zrębu i odpornościowe.Zastosowanie tego protokołu do analizy ludzkich guzów trzustki lub stanu zapalnego trzustki może pomóc w badaniu tych chorób w celu znalezienia nowych biomarkerów i metod leczenia. Metoda jest łatwa w użyciu i może zapewnić pożądane rezultaty przy minimalnej praktyce. Ten film pomoże zobaczyć drobne szczegóły protokołu.Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować wszystkie instrumenty i sprzęt na lodzie. Po unieruchomieniu uśpionej myszy spryskaj jej brzuch 70% etanolem. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie w kształcie litery V o długości 2,5 centymetra w okolicy narządów płciowych zwierzęcia i przejdź w górę, aby całkowicie otworzyć jamę brzuszną.Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy i trzustkę, która znajduje się w pobliżu śledziony. Za pomocą dwóch kleszczy oddziel trzustkę od żołądka i dwunastnicy bez rozdzierania. Kontynuuj i oddziel trzustkę od jelita cienkiego, jelita czczego i jelita krętego.Przesuń trzustkę na prawą stronę i oddziel pozostałe połączenia między trzustką a klatką piersiową za pomocą kleszczy, aby całkowicie odłączyć trzustkę i przyczepioną śledzionę. Ostrożnie usuń trzustkę bez tłuszczu krezkowego lub innych przyległych tkanek i rozłóż ją do badania na szalce Petriego na lodzie. Postępując zgodnie ze składem podanym w tekście, należy przygotować dysocjacyjne 1 i 2, wcześniej przepłukać bufor i roztwór zatrzymujący aktywność enzymów.Umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce na lodzie i opłucz ją w 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i zrównoważonym roztworze soli Hanka lub HBSS. Tłuszcz będzie unosił się na wodzie, a trzustka opadnie. Jest to łatwy sposób na wizualizację i szybkie usunięcie zanieczyszczającej białej tkanki tłuszczowej, która nadal jest przyczepiona do trzustki.Następnie przenieś i trzymaj tkankę trzustki myszy na sterylnej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów HBSS na lodzie do czasu cięcia. Za pomocą nożyczek Noyes i skalpela pokrój trzustkę na małe kawałki o wielkości od jednego do trzech milimetrów sześciennych. Po przeniesieniu tkanek do probówki wirówkowej, odwiruj ją w temperaturze 350 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odessać i wyrzucić supernatant w celu usunięcia fragmentów komórek i komórek krwi. Ponownie zawiesić, zawiesić kawałki w buforze dysocjacyjnym 1 zawierającym 0,02% trypsyny-C i 0,05% EDTA na 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Natychmiast przemyć 10% FBS i zmodyfikowanym podłożem Orła firmy Dulbecco lub DMEM i odwirować przez pięć minut w temperaturze 350 G i czterech stopniach Celsjusza.Przemyć ponownie, ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach buforu do przemywania i odwirowując jak poprzednio przez pięć minut przed następnym etapem dysocjacji. Inkubować trzustkę w buforze dysocjacyjnym 2 przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przy 180 obrotach na minutę. Po 15 minutach należy przeprowadzić dysocjację mechaniczną, energicznie pipetując fragmenty trzustki 10 razy w górę i w dół za pomocą sterylnych pipet serologicznych.Powtórz za pomocą pipet o zmniejszającym się rozmiarze, zaczynając od 25, 10 do 5 mililitrów. Inkubować próbkę, aby doprowadzić ją do 37 stopni Celsjusza. Użyj mikroskopii świetlnej, aby monitorować dysocjację w zależności od ilości pojedynczej komórki w zawiesinie.Monitoruj żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. Kontynuować inkubację i sprawdzić dysocjację, pobierając próbki co pięć minut. Inkubować do momentu, aż 90% komórek zostanie rozdzielonych na pojedyncze komórki.Po tym, jak tkanka trzustki jest dobrze zdysocjowana, na co wskazuje zanik fragmentów trzustki i rosnące zmętnienie roztworu, zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dwukrotnie przemywając roztwór zatrzymujący aktywność enzymatyczną na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na tym etapie utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie. Przepuść zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 70 mikronów.Mniejszy rozmiar siatki nylonowej może zmniejszyć żywotność komórek. Sprawdź żywotność komórek pod mikroskopem. Ponownie zawiesić i przepłukać osad 5 do 10 mililitrami lodowatego buforowego roztworu płuczącego przed policzeniem komórek.W przypadku zaobserwowania kilku czerwonych krwinek, należy je potraktować buforem do lizy czerwonych krwinek przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. W przypadkach, gdy obserwuje się grudki, próbki należy ponownie potraktować trypsyną, jak opisano wcześniej. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 80%, żywe komórki należy wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub zestawu do usuwania martwych komórek MACS z kolumnami MACS MS.Czerwony kolor izolowanej tkanki trzustki wynikał z ekspresji tdTomato w komórkach groniarzych. We wczesnym stadium dysocjacji występowała mała liczba izolowanych komórek i duża liczba grudek. Później uzyskano wyizolowane żywe komórki, unikając zmniejszania liczby żywotnych komórek.Dłuższa inkubacja zmniejszyła żywotność komórek. Komórki tdTomato dodatnie oszacowano za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Protokół łagodnej dysocjacji wspierał odzyskiwanie wielu typów komórek, z wysoką żywotnością, która pozwoliła na dalsze sortowanie komórek pożądanych typów komórek.Liczenie żywych komórek do martwych komórek przeprowadzono za pomocą hemekytometru. Obrazy fluorescencyjne zamrożonych skrawków trzustki wykazały tdPomidorowo-dodatnie komórki groniaste. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki potwierdziło wykrycie wszystkich typów komórek wykrytych podczas sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w każdej wyciętej tkance ze wszystkich punktów czasowych.Badano ekspresję karboksypeptydazy1 lub CPA1 w komórkach groniastych, wskazując na minimalne zanieczyszczenie transkryptomem innych typów komórek. Ważne jest, aby pamiętać, że dłuższy czas inkubacji zmniejszył żywotność komórek, dlatego ważne jest, aby monitorować próbkę i obserwować dysocjację tkanki i żywotność komórek co kilka minut pod mikroskopem. Protokół izolacji komórek może być stosowany do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, hodowli komórek lub jako materiał wyjściowy dla organoidów.Technika ta pozwala zbadać, jak rozwija się rak trzustki i zbadać interakcje między komórkami, które naciekają tkankę zapalną lub nowotworową.

pancreatic-tissue-dissection-to-isolate-viable-single-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Tutaj opisujemy metodę izolacji komórek w mikrośrodowisku trzustki z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy, koncentrując się na izolacji komórek mezenchymalnych. Metoda ta umożliwia profilowanie ekspresji genów komórkowych i wydzielania białek w celu wyjaśnienia sygnałów zewnętrznych, które regulują rozwój, funkcję i nowotworzenie trzustki.

Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj protokół dysocjacji tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek. Metoda ta umożliwia badanie nowotworów trzustki i zmian przednowotworowych, wspierając identyfikację nowych biomarkerów oraz terapii.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów