Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Zademonstrowany protokół dysocjacji tkanki trzustki jest prosty i stanowi narzędzie do izolowania żywotnych pojedynczych komórek z tkanki trzustki na różnych etapach procesu nowotworowego, w tym guzów litych. Odzyskanie nienaruszonych i żywotnych komórek groniastych jest poważnym wyzwaniem. Protokół może odzyskać żywe pojedyncze komórki z normalnej trzustki, trzustki ze zmianami przednowotworowymi lub guzami trzustki zawierającymi liczne komórki zrębu i odpornościowe.

Zastosowanie tego protokołu do analizy ludzkich guzów trzustki lub stanu zapalnego trzustki może pomóc w badaniu tych chorób w celu znalezienia nowych biomarkerów i metod leczenia. Metoda jest łatwa w użyciu i może zapewnić pożądane rezultaty przy minimalnej praktyce. Ten film pomoże zobaczyć drobne szczegóły protokołu.

Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować wszystkie instrumenty i sprzęt na lodzie. Po unieruchomieniu uśpionej myszy spryskaj jej brzuch 70% etanolem. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie w kształcie litery V o długości 2,5 centymetra w okolicy narządów płciowych zwierzęcia i przejdź w górę, aby całkowicie otworzyć jamę brzuszną.

Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy i trzustkę, która znajduje się w pobliżu śledziony. Za pomocą dwóch kleszczy oddziel trzustkę od żołądka i dwunastnicy bez rozdzierania. Kontynuuj i oddziel trzustkę od jelita cienkiego, jelita czczego i jelita krętego.

Przesuń trzustkę na prawą stronę i oddziel pozostałe połączenia między trzustką a klatką piersiową za pomocą kleszczy, aby całkowicie odłączyć trzustkę i przyczepioną śledzionę. Ostrożnie usuń trzustkę bez tłuszczu krezkowego lub innych przyległych tkanek i rozłóż ją do badania na szalce Petriego na lodzie. Postępując zgodnie ze składem podanym w tekście, należy przygotować dysocjacyjne 1 i 2, wcześniej przepłukać bufor i roztwór zatrzymujący aktywność enzymów.

Umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce na lodzie i opłucz ją w 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS i zrównoważonym roztworze soli Hanka lub HBSS. Tłuszcz będzie unosił się na wodzie, a trzustka opadnie. Jest to łatwy sposób na wizualizację i szybkie usunięcie zanieczyszczającej białej tkanki tłuszczowej, która nadal jest przyczepiona do trzustki.

Następnie przenieś i trzymaj tkankę trzustki myszy na sterylnej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów HBSS na lodzie do czasu cięcia. Za pomocą nożyczek Noyes i skalpela pokrój trzustkę na małe kawałki o wielkości od jednego do trzech milimetrów sześciennych. Po przeniesieniu tkanek do probówki wirówkowej, odwiruj ją w temperaturze 350 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odessać i wyrzucić supernatant w celu usunięcia fragmentów komórek i komórek krwi. Ponownie zawiesić, zawiesić kawałki w buforze dysocjacyjnym 1 zawierającym 0,02% trypsyny-C i 0,05% EDTA na 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Natychmiast przemyć 10% FBS i zmodyfikowanym podłożem Orła firmy Dulbecco lub DMEM i odwirować przez pięć minut w temperaturze 350 G i czterech stopniach Celsjusza.

Przemyć ponownie, ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach buforu do przemywania i odwirowując jak poprzednio przez pięć minut przed następnym etapem dysocjacji. Inkubować trzustkę w buforze dysocjacyjnym 2 przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przy 180 obrotach na minutę. Po 15 minutach należy przeprowadzić dysocjację mechaniczną, energicznie pipetując fragmenty trzustki 10 razy w górę i w dół za pomocą sterylnych pipet serologicznych.

Powtórz za pomocą pipet o zmniejszającym się rozmiarze, zaczynając od 25, 10 do 5 mililitrów. Inkubować próbkę, aby doprowadzić ją do 37 stopni Celsjusza. Użyj mikroskopii świetlnej, aby monitorować dysocjację w zależności od ilości pojedynczej komórki w zawiesinie.

Monitoruj żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego. Kontynuować inkubację i sprawdzić dysocjację, pobierając próbki co pięć minut. Inkubować do momentu, aż 90% komórek zostanie rozdzielonych na pojedyncze komórki.

Po tym, jak tkanka trzustki jest dobrze zdysocjowana, na co wskazuje zanik fragmentów trzustki i rosnące zmętnienie roztworu, zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dwukrotnie przemywając roztwór zatrzymujący aktywność enzymatyczną na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na tym etapie utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie. Przepuść zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 70 mikronów.

Mniejszy rozmiar siatki nylonowej może zmniejszyć żywotność komórek. Sprawdź żywotność komórek pod mikroskopem. Ponownie zawiesić i przepłukać osad 5 do 10 mililitrami lodowatego buforowego roztworu płuczącego przed policzeniem komórek.

W przypadku zaobserwowania kilku czerwonych krwinek, należy je potraktować buforem do lizy czerwonych krwinek przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. W przypadkach, gdy obserwuje się grudki, próbki należy ponownie potraktować trypsyną, jak opisano wcześniej. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 80%, żywe komórki należy wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub zestawu do usuwania martwych komórek MACS z kolumnami MACS MS.

Czerwony kolor izolowanej tkanki trzustki wynikał z ekspresji tdTomato w komórkach groniarzych. We wczesnym stadium dysocjacji występowała mała liczba izolowanych komórek i duża liczba grudek. Później uzyskano wyizolowane żywe komórki, unikając zmniejszania liczby żywotnych komórek.

Dłuższa inkubacja zmniejszyła żywotność komórek. Komórki tdTomato dodatnie oszacowano za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Protokół łagodnej dysocjacji wspierał odzyskiwanie wielu typów komórek, z wysoką żywotnością, która pozwoliła na dalsze sortowanie komórek pożądanych typów komórek.

Liczenie żywych komórek do martwych komórek przeprowadzono za pomocą hemekytometru. Obrazy fluorescencyjne zamrożonych skrawków trzustki wykazały tdPomidorowo-dodatnie komórki groniaste. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki potwierdziło wykrycie wszystkich typów komórek wykrytych podczas sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w każdej wyciętej tkance ze wszystkich punktów czasowych.

Badano ekspresję karboksypeptydazy1 lub CPA1 w komórkach groniastych, wskazując na minimalne zanieczyszczenie transkryptomem innych typów komórek. Ważne jest, aby pamiętać, że dłuższy czas inkubacji zmniejszył żywotność komórek, dlatego ważne jest, aby monitorować próbkę i obserwować dysocjację tkanki i żywotność komórek co kilka minut pod mikroskopem. Protokół izolacji komórek może być stosowany do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, hodowli komórek lub jako materiał wyjściowy dla organoidów.

Technika ta pozwala zbadać, jak rozwija się rak trzustki i zbadać interakcje między komórkami, które naciekają tkankę zapalną lub nowotworową.