Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych pierwotnych wysp i komórek acynarnych z trzustki myszy, oferując cenne narzędzie do badania komunikacji wewnątrzkomórkowej w patogenezie ostrego zapalenia trzustki wywołanego cukrzycą (PPDMA). Obecne metody izolowania pierwotnych wysepek od myszy opierają się głównie na kaniulacji przewodów żółciowych. Technika ta wymaga precyzyjnej lokalizacji i kanulacji przewodu żółciowego, a następnie perfuzji in vivo roztworu kolagenazy P z przydzielawia trzustkowego.

Bez specjalistycznego szkolenia jest to dość trudne, a osiągnięcie skutecznej i efektywnej perfuzji trzustki jest wyzwaniem. Ten film uniemożliwia prostą i szybką metodę izolowania pierwotnych wysetek odpowiednich dla badaczy bez doświadczenia z perfuzją. Metoda umożliwia również jednoczesne pozyskiwanie pierwotnych komórek acynarnych trzustki, co daje wystarczającą liczbę wysokiej jakości wysepek i komórek acynarycznych.

Pozwala to badaczom prowadzić eksperymenty w tym samym kontekście patologicznym i fizjologicznym, co ułatwia dogłębną analizę mechanizmu interakcji między wysepkami a komórkami acynarycznymi. Izolacja wysepek trzustkowych i komórek acynarnych PACów trzustki. Dodaj zrównoważony roztwór soli Hanka i roztwór kolagenazy P do płytki 12-dołkowej oraz dodaj trzy mililitry roztworu kolagenazy P do rurki wirówki o pojemności 50 milimetrów do dalszego trawienia.

Znieczulać mysz 1,25% tribrometanolem przed operacją, a następnie uśpić. Zrób nacięcie w kształcie litery V w kształcie litery V, aby otworzyć jamę brzuszną myszy. Ciemnoczerwonym narządem limfoidalnym w lewym obszarze hipochondrycznym jest śledziona, a białym organem przymocowanym do śledziony jest trzustka.

Ostrożnie wykonaj rozwarstwienie trzustki wzdłuż dolnej krawędzi żołądka oraz połączenia trzustkowo-dwunastnicy. Umyj odizolowaną tkankę trzustkową w zrównoważonym roztworze soli Hanka i usuń pozostałości przyczepów krezkowe, śledziony oraz tkanki tłuszczowej okołotrzustkowej. Przenieś trzustkę do płytki z 12 dołkami, dodanej dwoma mililitrami roztworu kolagenazy P.

Trzymaj trzustkę pęsetą lewą ręką, a strzykawką o jednym mililitrze prawą wstrzyknij roztwór kolagenazy P do przydusznego mięśnia, aż tkanka trzustki stanie się przezroczysta i obrzękowa. Szybko pokróć trzustkę na kawałki tkanki o wymiarach od jednego do dwóch milimetrów sześciennych nożyczkami chirurgicznymi. Odetnij od jednego do 1,5 centymetra od końcówki pipety o średnicy jednego mililitra, aby powiększyć otwór, i użyj tej zmodyfikowanej końcówki do przeniesienia fragmentów tkanki trzustkowej razem z dwoma mililitrami roztworu kolagenazy P do rurki wirówki o pojemności 50 milimetrów, wstępnie załadowanej trzema mililitrami roztworu kolagenazy P.

Inkubuj rurkę wirówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 minut, delikatnie potrząsając rurką co pięć do sześciu minut w tym okresie. Dodaj 10 mililitrów RPMI 1640 kompletnego medium, aby zakończyć działanie trawienne roztworu kolagenazy P. Pipetować granulat wielokrotnie pięciolitrową pipetą Pasteura, wykonując od 15 do 20 ruchów w górę i w dół, aż nie pozostaną wyraźne duże grudki tkanki.

Dodaj 10 mililitrów RPMI 1640 pełnego medium. Następnie wiruj w 180 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić śrut 20 mililitrów RPMI 1640 pełnego medium.

Przefiltruj zawieszenie przez sito o średnicy 40 oczek. Następnie wiruj w 180 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Delikatnie odrzuć nadmiar.

Dodaj 20 mililitrów roztworu Ficoll, aby ponownie zawiesić pellet. Następnie powoli dodaj 15 mililitrów RPMI 1640 full media. W tym momencie można zaobserwować przezroczystą cieczową granicę.

Delikatnie wiruj w 640 razy G przez 20 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Ostrożnie wyjmij rurkę wirówki i zasysaj górną czerwoną warstwę medium za pomocą pięciolitrowej pipety Pasteura. Następnie ostrożnie zasysaj wysepki zawierające ciecz na granicy warstwy cieczy i przelej je do nowej rurki wirówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj 20 mililitrów RPMI 1640 full media. Wirówka w 180-krotności G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesić śrut z 20 mililitrami RPMI 1640 pełnego medium.

Wirówka w 180-krotności G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesić śrut z 10 mililitrami RPMI 1640 pełnego medium. I przenieś je do 60-milimetrowej misy do hodowli komórek.

Pod odwróconym mikroskopem biologicznym o 100-krotnym powiększeniu ręcznie wybieraj wysepki za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów. Przenieś wybrane wysepki na 24-dołkową płytkę hodowlę komórek z 500 mikrolitrami pełnego medium RPMI 1640 na dołek. Usuń warstwę roztworu Ficoll.

Ponownie zawiesij granulat z 10 mililitrami DMEM kompletnego medium. Przefiltruj przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów. Wirówka na 180 razy G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza.

I wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesij granulat z 10 mililitrami DMEM kompletnego medium. Wiruj w wirówce 180 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucaj supernatant.

Następnie ponownie zawiesić pellet z pięcioma mililitrami kompletnego medium DMEM do kolejnych eksperymentów. Po wirowaniu gęstościowym w roztworze Ficoll, w pobliżu granicy między przezroczystą, bezbarwną warstwą cieczy a medium obserwowano wysepki, z osadami obecnymi na dnie rurki. Wysepki były zazwyczaj okrągłe, owalne, złocistobrązowe, z stabilnym plonem 120 plus minus pięć na mysz, na rysunku A i B. Świeżo odizolowane PAC-y były kuliste i skupione.

Komórki acynary miały ciemniejsze końce wierzchołkowe z widocznymi granulkami zymogenu, a wydajność wynosiła 1,6 do 1,95 razy 10 do siódmego ogniwa mocy na mysz. Rysunek C i rysunek D. Barwienie klaceiny PI w komórkach acynarnych pokazuje, że większość komórek jest barwiona na zielono kalceinę, żywą i nieliczną czerwoną PI, martwą, Rysunek A. Analiza ilościowa oparta na obrazie J ujawnia, że izolowane wyspy i komórki acynarne mają wskaźniki żywotności 97,52 plus minus 0,16% oraz 96,55 plus lub minus odpowiednio 0,95%, Rysunek B. Wyizolowane komórki acynarne trzustki, aktywność bazalnej amylazy 0,79 plus lub minus 0,01 jednostki na mililitr. Po stymulacji 10 nanotrzonowców, 20 nanotrzonowców i 50 nanomolowych cerulein, ich aktywność amylazy wynosiła odpowiednio 1,45 plus minus 0,03 jednostki na mililitr, 1,65 plus minus 0,05 jednostki na mililitr oraz 1,39 plus minus 0,02 jednostki na mililitr. Jednokierunkowa analiza ANOVA wykazała, że wszystkie grupy ceruleiny miały istotnie różną aktywność amylazy w porównaniu do grupy kontrolnej, wszystkie wartości P poniżej 0,001.

Dodatkowo, grupa nanomolowa 20 różniła się znacząco od grupy 10-molowej, o wartości P mniejszej niż 0,001, rysunek A. Izolowane wysepki przy wydzielaniu insuliny 0,27 plus lub minus 0,04 nanograma na mililitr na wysewkę na godzinę przy stymulacji 5,6 milimolowej glukozy i 0,94 plus minus 0,94 nanograma na mililitr na wysepkę na godzinę przy 22 milimolowych glukozie, GSI równa się 3,44, rysunek B. Badanie to ustanowiło metodę jednoczesnej izolacji pierwotnych wysetek myszy i komórek acynarnych trzustki bez złożonej perfuzji in vivo. Dzięki długiej barierze technicznej metoda jest łatwa w obsłudze, dając 120 plus lub minus 5 wysepek oraz 1,6 do 1,95 razy 10 do siódmej mocowej komórek acinarnych na mysz, przy czym oba typy komórek wykazują żywotność ponad 96%. Izolowane wyspy wykazują prawidłową wydzielinę insuliny stymulowaną glukozą, a komórki acinne są wrażliwe na stymulację ceruleiną. Potwierdza to, że komórki uzyskane tą metodą mają nienaruszone funkcje, co czyni je odpowiednimi do badań nad interakcjami między trustką a hormonalnymi i egzokrinnymi.

Metoda jest jednak ograniczona przez potrzebę podstawowej wiedzy anatomicznej myszy, konieczność dostosowania dawki odczynników, ograniczenia dotyczące liczby myszy przetwarzanych jednocześnie oraz ryzyko niepotwierdzonego zastosowania. Wciąż zapewnia niezawodny protokół izolacji komórek dla badaczy bez doświadczenia perfuzyjnego.