Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Protokół ten pozwala nam badać antygeny obecne na powierzchni komórek różnych typów komórek w celu znalezienia antygenów specyficznych dla tego typu komórki lub tkanki. Technika, którą tutaj prezentujemy, pozwala na wzbogacenie białek błony komórkowej z lizatu całego komórkowego, ostatecznie do analizy za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Tak więc jednym z konkretnych zastosowań tego protokołu jest zastosowanie go do komórek nowotworowych w celu poszukiwania antygenów obecnych na powierzchni tych komórek rakowych, a nie normalnych komórek, które mogłyby służyć jako nowe cele w immunoterapii raka.

Jedną z rzeczy, na które należy zwrócić uwagę w przypadku tego protokołu, jest to, że może być ważne zoptymalizowanie danych wejściowych próbki pod kątem interesującego Cię eksperymentu. Dlatego znalezienie optymalnych warunków może zająć kilka iteracji lub miareczkowania. Procedurę zademonstruje Akul Naik, młodszy specjalista z naszego laboratorium.

Na początek usuń zamrożone osady komórkowe znakowane biotyną z minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na lodzie. Dodaj 500 mikrolitrów 2X Lysis Buffer do granulki, dokładnie wymieszaj i energicznie wiruj przez 30 sekund. Sonikować lizat komórkowy na lodzie i odwirowywać lizat przy 17,200 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby rozpalić wszelkie pozostałe zanieczyszczenia.

Podczas wirowania lizatu dodaj 100 mikrolitrów kulek żywicy agarozowej NeutrAvidin do kolumny filtracyjnej przymocowanej do kolektora próżniowego. Zastosuj delikatny odkurzacz i umyj koraliki, spływając po nich 3 mililitry buforu do prania 1. Wyjmij kolumnę filtracyjną z kolektora próżniowego, zakryj dno i dodaj sklarowany lizat komórkowy do kolumny z kulkami.

Przykryj górną część kolumny i inkubuj lizat z kulkami na wirniku od końca do końca przez 120 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji lizatu umieść kolumnę filtracyjną z powrotem na kolektorze próżniowym i zastosuj delikatne podciśnienie. Umyj koraliki, przelewając na nie pięć mililitrów buforu myjącego 1.

Powtórz etap mycia z pięcioma mililitrami buforu do płukania 2 i buforu do płukania 3. Gdy ostatni bufor płuczący całkowicie przepłynie przez kulki, wyjmij kolumnę z kolektora. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu lizy do kulek i przenieś je do 1,7-mililitrowej probówki wirówki z mikro wiążącą białka o niskiej zawartości białka za pomocą pipety.

Krótko obróć probówkę, aby osadzić kulki i usunąć 50 mikrolitrów roztworu. Następnie umieść rurkę na wytrząsarce z blokiem grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut przy 1000 obr./min, wstrząsając. Ponownie zawiesić wysuszoną trypsynę w probówce do trawienia z zestawu, dodając 210 mikrolitrów roztworu do ponownego zawieszania i pipetując go kilka razy w górę iw dół, aby upewnić się, że cała wysuszona trypsyna została ponownie zawieszona.

Pod koniec inkubacji kulek wyjmij ją z wytrząsarki bloku grzewczego i dodaj 50 mikrolitrów ponownie zawieszonego roztworu trypsyny do kulek. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 500 obr./min przez co najmniej 90 minut, aby strawić białko. Po zakończeniu trawienia przenieś roztwór zawierający kulki do kolumny wirowej i włóż kolumnę do 1,7-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej o niskiej zawartości białka

Zakręć probówką, aby oddzielić strawiony roztwór peptydu od kulek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego, aby zatrzymać reakcję trawienia i zakwasić roztwór peptydowy. Za pomocą adaptera probówki umieść kolumnę odsalającą w 1,7-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek.

Dodaj cały zakwaszony roztwór peptydu do kolumny. Obracać kolumnę pod ciśnieniem 3 800 G przez 3 minuty, tak aby roztwór przepłynął przez kolumnę. Odrzuć przepływ, ponieważ peptydy są teraz związane z kolumną.

Dodać 200 mikrolitrów roztworu Wash 1 do kolumny, wirować w temperaturze 3,800 G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić przepływ. Powtórz etap mycia z 200 mikrolitrami roztworu Wash 2. Przenieś kolumnę do nowej, znakowanej 1,7-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej o niskiej zawartości wiązania białka.

Dodać 100 mikrolitrów roztworu elucji do kolumny i wirować w temperaturze 3,800 G przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Peptydy są teraz eluowane z kolumny do probówki. Umieść roztwór peptydowy w wirówce próżniowej i pozostaw do wyschnięcia na noc.

Umieść wysuszone peptydy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do ilościowego określenia i analizy na spektrometrze masowym. Analizę proteomu przeprowadzono w celu scharakteryzowania wzbogaconych białek powierzchniowych komórek za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Końcowe stężenie peptydu wynoszące około 630 nanogramów na mikrolitr uzyskano w oparciu o kolorymetryczny test kwantyfikacji peptydów.

Dane ze spektrometrii mas przeanalizowane za pomocą MaxQuant i późniejsza analiza zestawów danych białek powierzchniowych komórek dały 601 białek powierzchniowych w próbce, około 27% wszystkich zidentyfikowanych białek. Wykres przedstawiający rozkład zidentyfikowanego białka w wyniku Andromedy jest pokazany tutaj, a wykres punktowy ilustruje korelację między próbkami. Wykresy pudełkowe przedstawiały wariant typu run-to-run.

Wykres rozkładu dla każdej próbki reprezentował jakość danych powtórzonych. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest to, gdzie peptydy znajdują się na każdym kroku. Początkowo znajdują się w roztworze, następnie są związane z kulkami aż do trawienia, a następnie są wiązane z kolumną odsalającą, aż w końcu zostaną wymyte.

Po tej procedurze istnieją różne sposoby walidacji kilku zidentyfikowanych białek, takie jak celowana cytometria przepływowa i ukierunkowana proteomika. Dostarczy to bardziej szczegółowych informacji na temat poziomów ekspresji tych białek w próbce.