Name: Przepływ pracy Cell Surface Capture do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania białek powierzchniowych komórek z lizatów całych komórek w celu identyfikacji antygenów specyficznych dla typu komórki. Technika ta umożliwia analizę proteomiczną z wykorzystaniem spektrometrii masowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Kamalowi Mandalowi (Departamentowi Medycyny Laboratoryjnej, UCSF) za pomoc w skonfigurowaniu uruchomienia LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) za pomoc w analizie danych oraz dr Audrey Reeves (Departamentowi Medycyny Laboratoryjnej, UCSF) za pomoc w analizie danych. Powiązane prace w laboratorium APW są wspierane przez NIH R01 CA226851 i Chan Zuckerberg Biohub. Rysunek 1 i rysunek 2B zostały wykonane przy użyciu BioRender.com.

UWAGA: komórki plazmocytomy AMO1 zostały użyte w tym eksperymencie z proteomem na powierzchni komórki. Ten sam protokół może być również używany dla innych typów komórek, w tym szerokiej gamy zawiesinowych i przylegających linii komórkowych9, a także różnych typów próbek pierwotnych10. Jednak liczba komórek (materiał wyjściowy do eksperymentu) zazwyczaj musi być zoptymalizowana pod kątem równoważnego pokrycia proteomu. Szczegółowe informacje dotyczące materiałów i wyposażenia znajdują się w Tabeli materiałów. Szczegółowe informacje dotyczące i roztworów odczynników oraz ich składu znajdują się w Tabeli 1.
1. Znakowanie powierzchni komórek za pomocą biotyny
<ol>
	<li>Policzyć wyhodowane komórki i osad około 3,5 × 107 żywych komórek przez odwirowanie (5 min w temperaturze 500 × g, 24 °C). 
	UWAGA: Komórki plazmocytomy AMO1 pasażowano świeżą pożywką co 3 dni przed pobraniem.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 1 ml zimnego (4 °C) buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco (bez wapnia, bez magnezu) i delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Ponownie ogarnąć komórki (jak w kroku 1.1) i powtórzyć etap mycia (krok 1.2) jeszcze raz (w sumie dwa prania).</li>
	<li>Po drugim płukaniu rozpakować komórki w granulki (jak w kroku 1.1) i ponownie zawiesić je w 990 μl zimnego D-PBS, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Wcześniej przygotować roztwór podstawowy 160 mM metaperiodianu sodu (NaIO4). Podzielić na porcje o pojemności 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 10 μl 160 mM roztworu metaperiodianu sodu do zawiesiny komórek w kroku 1.4, dokładnie wymieszać i inkubować na wirniku typu end-to-end przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji zagnieździć komórki (jak w kroku 1.1), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego D-PBS. Powtórz ten krok prania dwa razy (w sumie trzy prania). Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 989 μl D-PBS.</li>
	<li>Wcześniej przygotować roztwór podstawowy 100 mM hydrazydu biocytyny. Podzielić na porcje o pojemności 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 1 μl aniliny i 10 μl 100 mM hydrazydu biocytyny do zawiesiny komórek w kroku 1.6, dokładnie wymieszać i inkubować na rotorze typu end-to-end przez 60 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji zagnieździć komórki (jak w kroku 1.1), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego D-PBS. Powtórz ten krok prania dwa razy (w sumie trzy prania).</li>
	<li>Po trzecim przemyciu ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety i zatrzaskowo zamrozić osad komórek, umieszczając probówkę w cieczyN2. Umieścić zamrożone granulki w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do przeprowadzenia lizy i ściągania.</li>
</ol>
2. Liza komórek i spadek biotyny
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożone osady komórkowe na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 500 μL 2x buforu do lizy do granulatu, dokładnie wymieszaj i wiruj przez 30 s. 
	UWAGA: Do pełnej lizy granulatu może być wymagane energiczne pipetowanie i wirowanie. Niektóre nierozpuszczalne zanieczyszczenia (np. DNA) są dopuszczalne, ponieważ są usuwane w kolejnym etapie sonikacji.</li>
	<li>Sonikacja lizatu komórkowego na lodzie (trzy impulsy, każdy po 20 s, 60% cykl pracy).</li>
	<li>Odwirować lizat w celu osadzenia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń (10 min w temperaturze 17 200 × g w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Podczas odwirowywania lizatu dodać 100 μl kulek żywicy agarozowej neutrawidyny do kolumny filtracyjnej. Przymocuj kolumnę do kolektora próżniowego, zastosuj delikatną próżnię i umyj kulki, przelewając na nie 3 ml buforu płuczącego 1.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę filtracyjną z kolektora próżniowego, zakryj dno i dodaj sklarowany lizat komórkowy do kolumny z kulkami. Przykryć górną część kolumny i inkubować lizat z kulkami na wirniku od końca do końca przez 120 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Podczas zaślepiania górnej części kolumny należy mocno przytrzymać dolną nasadkę na miejscu, w przeciwnym razie może się ona wysunąć, a lizat komórkowy może wyciekać podczas inkubacji.</li>
	<li>Przygotować do przemywania 1, 2 i 3 (około 5 ml każdego buforu do płukania na próbkę, patrz Tabela 1) i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji lizatu umieść kolumnę filtracyjną z powrotem na kolektorze próżniowym, zastosuj delikatną próżnię i umyj kulki, przepływając po nich 5 ml buforu płuczącego 1. 
	UWAGA: Do mycia można użyć więcej niż 5 ml do mycia; Dodatkowe pranie może zmniejszyć tło, niespecyficzne wiązanie na koralikach.</li>
	<li>Powtórzyć etap płukania z 5 ml buforu do przemywania 2.</li>
	<li>Powtórzyć etap płukania z 5 ml buforu do przemywania 3.</li>
	<li>Gdy końcowy bufor płuczący całkowicie przepłynie przez kulki, wyjmij kolumnę z kolektora. Dodać 100 μl roztworu "Lyse" do kulek i przenieść je do 1,7 ml probówki wirówkowej z mikrobiałkami o niskiej zawartości białka za pomocą pipety. Krótko obrócić probówkę, aby osadzić kulki i usunąć 50 μl roztworu, nie naruszając osadzonych kulek. 
	UWAGA: Odczynniki w tym kroku i we wszystkich kolejnych krokach wykorzystują dostępny na rynku zestaw do przygotowywania próbek proteomicznych. Zestaw zapewnia zoptymalizowany, uproszczony proces przygotowania próbki. Jednak te kroki można również wykonać niezależnie od zestawu, przy użyciu tradycyjnego przepływu pracy proteomiki, jak opisano w Verma et al.9. Jeśli koraliki pozostają przyklejone do boku lub dna kolumny, pozwól, aby koraliki, które zostały przeniesione do rurki, osiadły i użyj dodatkowego roztworu "Lizy" w rurze, aby przenieść pozostałe koraliki.</li>
	<li>Umieść probówkę na bloku grzewczym/wytrząsarce w temperaturze 65 °C i potrząsaj z prędkością 1 000 obr./min przez 10 minut 
	UWAGA: Ten etap jest wymagany do redukcji i alkilacji reszt cysteiny przed trawieniem.</li>
</ol>
3. Trawienie białek
<ol>
	<li>Zawiesić suszoną trypsynę (probówkę "Digest" w zestawie, przechowywaną w temperaturze -20 °C), dodając 210 μl roztworu "Resuspend". Odpipetować roztwór kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że cała wysuszona trypsyna została ponownie zawieszona.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji dodać 50 μl ponownie zawieszonego roztworu trypsyny do kulek. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 500 obr./min przez co najmniej 90 minut w celu strawienia białka.</li>
	<li>Po zakończeniu trawienia przenieś roztwór zawierający kulki do kolumny wirowej i włóż kolumnę do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości białka. Obracać probówkę (500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej [RT]), aby oddzielić strawiony roztwór peptydu od kulek. 
	UWAGA: Na tym etapie leczenie PNGazą można przeprowadzić na kulkach po ich oddzieleniu od roztworu peptydów, aby wymyć biotynylowane fragmenty peptydu z kulek streptawidyny. Ta próbka peptydu może być następnie przeniesiona przez pozostałą część przepływu pracy jako oddzielna, wtórna próbka peptydu, którą można analizować i porównywać z pierwotną próbką z trypsynizacji na kulkach. Podejście PNGazy prawdopodobnie dostarczy danych uzupełniających do trypsynizacji na kulkach, biorąc pod uwagę dodatkową specyficzność dla wychwyconych N-glikozylowanych asparagin, opartą na wykrywalnej przez MS modyfikacji łańcucha bocznego12. Jednak wadą tego podejścia do sekwencyjnej elucji jest wymóg dwukrotnego czasu przyrządu spektrometru mas na analizę próbki.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu "Stop", aby zatrzymać reakcję trawienia i zakwasić roztwór peptydowy.</li>
</ol>
4. Odsalanie peptydów
<ol>
	<li>Za pomocą adaptera probówki umieść kolumnę odsalającą w probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości wiązania białek. Dodaj cały zakwaszony roztwór peptydu do kolumny. Obracać kolumnę (3 800 × g przez 3 minuty) tak, aby roztwór przepłynął przez kolumnę. Peptydy są teraz związane z kolumną; Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu "Wash 1" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu "Wash 2" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Przenieść kolumnę do nowej, znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości wiązania białek. Dodać 100 μl roztworu "Elute" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 minuty, RT). Dodać kolejne 100 μl roztworu "Elute" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Peptydy są teraz eluowane z kolumny do probówki.</li>
	<li>Umieść roztwór peptydowy w wirówce próżniowej i pozostaw do wyschnięcia na noc. Umieścić wysuszone peptydy w temperaturze -80 °C do momentu, aż będą gotowe do oznaczania ilościowego, i poddać analizie na spektrometrze masowym.</li>
</ol>
5. Reprodukcja peptydów i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Wysuszone peptydy zawiesić ponownie w 20 μl rozpuszczalnika A (0,1% kwas mrówkowy, 2% acetonitryl).</li>
	<li>Odwirować zawieszone peptydy (17 200 × g przez 10 minut) w celu osadzenia wszelkich nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przygotuj wzorce peptydowe do kolorymetrycznego testu ilościowego peptydów.
	<ol>
		<li>Umieścić 5 μl roztworu podstawowego peptydu o stężeniu 1,000 mg/ml w jednym dołku 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>Wykonać siedmiostopniowe seryjne rozcieńczanie w płytce z wodą dejonizowaną (DI) w następujący sposób, z 5 μl każdego wzorca na studzienkę: 1,000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/ml i 15,625 mg/mL. Umieść 5 μl wody DI w ósmym dołku na ślepą próbę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 4 μl wody DI w trzech oddzielnych studzienkach na 96-dołkowej płytce. Dodać 1 μl zawieszonego roztworu peptydu do każdej studzienki, uzyskując całkowitą objętość 5 μl. 
	UWAGA: Podczas pipetowania roztworu peptydowego w celu oznaczania ilościowego, należy ostrożnie pipetować od góry roztworu, aby zapobiec naruszeniu osiadłych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Oblicz, ile potrzebnego odczynnika roboczego (wymagane 45 μl na studzienkę). Przygotować wymaganą objętość odczynnika roboczego do testu kolorymetrycznego; Odwiruj odczynnik roboczy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie składników.</li>
	<li>Dodać 45 μl odczynnika roboczego do każdego z dołków wzorcowych i dołków na próbki. 
	UWAGA: Wykonaj wzorce w dwóch egzemplarzach i użyj pipety wielokanałowej, aby zapewnić minimalną różnicę w czasie dodawania odczynnika do studzienek.</li>
	<li>Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przeanalizuj płytkę na automatycznym czytniku płytek. Wartości absorbancji zarejestrowane dla próbek wzorcowych należy wykorzystać do wygenerowania liniowej krzywej wzorcowej. Określ równanie krzywej standardowej i wartości R2. Jeżeli wartość R2 jest rozsądna (≥0,95), należy użyć krzywej wzorcowej do określenia stężenia ponownie zawieszonych peptydów, biorąc pod uwagę pięciokrotne rozcieńczenie na płytce do oznaczania kolorymetrycznego.</li>
</ol>
6. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) analiza strawionych peptydów
<ol>
	<li>Dostosuj stężenie próbek peptydów do 0,2 μg/μl, dodając rozpuszczalnik A i przenieś 10 μl do 0,6 ml probówki o niskiej zawartości białka.</li>
	<li>Umieść probówkę w automatycznym podajniku próbek LC.</li>
	<li>Ustaw parametry LC i MS/MS zgodnie z Rysunek 2 i Rysunek 3.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 μl (1 μg) próbki peptydu do zestawu LC-MS/MS w celu analizy. 
	UWAGA: Pokazane tutaj ustawienia LC-MS/MS są reprezentatywne tylko dla ilustracji. W zależności od dostępności przyrządów LC i MS, użytkownicy mogą modyfikować ustawienia gradientu LC i parametrów MS/MS, aby uzyskać głębokie pokrycie proteomu. W tym artykule analizę danych MS przeprowadzono przy użyciu MaxQuant https://www.maxquant.org/, wtórną analizę danych przeprowadzono przy użyciu Perseus https://maxquant.net/perseus/, a analizę ścieżek przy użyciu https://reactome.org/.</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+silico+human+surfaceome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The in silico human surfaceome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advance+in+tumor+specific+antigens%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22AME+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research advance in tumor specific antigens: A narrative review.</a> AME Medical Journal. 6, 35(2021).</li>
<li>Li, Y., Qin, H., Ye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+enrichment+methods+for+cell+surface+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling.</a> Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Chandler, K. B., Costello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics+and+glycoproteomics+of+membrane+proteins+and+cell-surface+receptors%3A+present+trends+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities.</a> Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).</li>
<li>Ferguson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfaceome+of+multiple+myeloma+cells+suggests+potential+immunotherapeutic+strategies+and+protein+markers+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance.</a> Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).</li>
<li>Karcini, A., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SKBR3+cell-membrane+proteome+reveals+telltales+of+aberrant+cancer+cell+proliferation+and+targets+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).</li>
<li>Köhnke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiomic+approach+for+identification+of+novel+immunotherapeutic+targets+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML.</a> Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).</li>
<li>Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+workflow+of+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics+of+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).</li>
<li>Leung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+and+thematic+remodeling+of+the+surfaceome+and+glycoproteome+on+isogenic+cells+transformed+with+driving+proliferative+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).</li>
<li>Nix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+proteomics+reveals+CD72+as+a+target+for+in+vitro-evolved+nanobody-based+CAR-T+cells+in+KMT2A%2FMLL1-rearranged+B-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL.</a> Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+from+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Hosen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activated+conformation+of+integrin+%CE%B27+is+a+novel+multiple+myeloma-specific+target+for+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).</li>
<li>Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glycosylation%3A+A+new+road+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery.</a> Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).</li>
<li>Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+proteomics+in+the+discovery+of+cell-surface+markers+on+stem+cells%3A+Scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface.</a> Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).</li>
<li>Itzhak, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+approach+for+mapping+protein+subcellular+localization+reveals+the+spatial+proteome+of+mouse+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons.</a> Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).</li>
<li>Kirkemo, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+tethered+promiscuous+biotinylators+enable+comparative+small-scale+surface+proteomic+analysis+of+human+extracellular+vesicles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells.</a> eLife. 11, 73982(2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+bottom-up+proteomics+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows.</a> Current Protocols. 1 (3), 85(2021).</li>
<li>Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+popular+proteomics+software+workflows+for+label-free+proteome+quantification+and+imputation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).</li>
<li>Griss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReactomeGSA-efficient+multi-omics+comparative+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).</li>
<li>Waas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SurfaceGenie%3A+a+web-based+application+for+prioritizing+cell-type-specific+marker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates.</a> Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Proteomika oparta na spektrometrii mas jest potężnym narzędziem, które umożliwiło bezstronną charakterystykę tysięcy nieznanych białek na wcześniej niemożliwą skalę. Takie podejście pozwala nam zidentyfikować i określić ilościowo białka, a także uzyskać szereg informacji na temat zdolności strukturalnych i sygnalizacyjnych komórek i tkanek, poprzez scharakteryzowanie różnorodności białek obecnych w danej próbce. Wykraczając poza globalne profilowanie białek w próbce, spektrometria mas pozwala nam scharakteryzować różne m...

Białka służą jako podstawowe jednostki, za pomocą których realizowana jest większość funkcji komórkowych. Scharakteryzowanie struktury i funkcji odpowiednich białek jest niezbędnym krokiem do zrozumienia procesów biologicznych. W ciągu ostatniej dekady postępy w technologii spektrometrii mas, oprogramowaniu analitycznym i bazach danych umożliwiły dokładne wykrywanie i pomiar białek w skali obejmującej cały proteom1. Proteomika oparta na spektrometrii mas może być wykorzystywana w różnorodnych zastosowaniach, od podstawowej analizy szlaków biochemicznych, przez identyfikację nowych celów leków w warunkach translacyjnych, po diagnostykę i monitorowanie chorób w klinice2. Podczas badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych celów terapeutycznych szczególnie ważna jest charakterystyka proteomu powierzchni komórki, przy czym ponad 65% obecnie zatwierdzonych leków dla ludzi jest ukierunkowanych na białka powierzchni komórki3. Dziedzina immunoterapii nowotworów również całkowicie opiera się na antygenach powierzchniowych specyficznych dla raka, które celują i specyficznie eliminują komórki nowotworowe4. Proteomika oparta na spektrometrii mas może zatem służyć jako obiecujące narzędzie do identyfikacji nowych białek powierzchniowych komórek w celu interwencji terapeutycznych.
Istnieje jednak kilka ograniczeń podczas korzystania z konwencjonalnych metod proteomicznych do badania komórek nowotworowych pod kątem nowych celów białkowych na powierzchni komórki. Podstawowym problemem jest to, że białka powierzchniowe stanowią bardzo małą część wszystkich cząsteczek białka w komórce. W związku z tym fragmenty tych białek są maskowane przez dużą obfitość białek wewnątrzkomórkowych podczas wykonywania analizy spektrometrii mas lizatu całokomórkowego5. To ograniczenie sprawia, że dokładne scharakteryzowanie proteomu powierzchni komórki za pomocą tradycyjnego przepływu pracy proteomicznego jest trudne. Aby sprostać temu wyzwaniu, konieczne jest opracowanie sposobów wzbogacania białek powierzchniowych komórek z lizatu całokomórkowego przed analizą na spektrometrze mas. Jedna z takich metod polega na utlenianiu i znakowaniu biotyną glikozylowanych białek powierzchniowych komórek w nienaruszonych komórkach, a następnie wzbogacaniu tych biotynylowanych białek z lizatu za pomocą neutrawidyny, procesu, który został nazwany "wychwytywaniem powierzchni komórki"<klasa sup = "xref">6. Ponieważ uważa się, że ~85% białek powierzchniowych komórek ssaków jest glikozylowanych7, służy to jako skuteczna metoda wzbogacania proteomu powierzchni komórki z całego lizatu komórkowego. Ten artykuł opisuje pełny przebieg pracy, począwszy od hodowanych komórek, znakowania biotyny na powierzchni komórki, a następnie przygotowania próbki do analizy spektrometrii mas (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W przypadku kilku powtórzeń metoda ta zapewnia solidne pokrycie proteomu powierzchni komórki w określonej próbce. Wykorzystanie tej metody do scharakteryzowania proteomu powierzchni komórki zarówno nowotworu, jak i zdrowych komórek może ułatwić odkrycie nowych antygenów powierzchniowych komórek w celu identyfikacji potencjalnych celów immunoterapeutycznych8.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST Zestaw do przygotowania próbek</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Zestaw do przygotowania próbek Proteomics. Zawiera odczynniki do redukcji, alkilowania i trawienia. Obejmują również kolumny odsalające i odczynniki.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy</td><td>Thermo</td><td>23275</td><td>Zestaw do kwantyfikacji peptydów. Obejmuje wzorce peptydowe i składniki odczynników roboczych.&nbsp;</td></tr><tr><td><silne>odczynniki</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazyd biocytyny</td><td>Biotium</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (bez soli wapnia i magnezu)</td><td>UCSF Zakład hodowli komórkowych</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibitor proteazy i fosfatazy Jednorazowy koktajl</td><td>Thermo</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Żywica agarozowa o dużej pojemności Neutrawidyna Thermo</td><td></td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana fosforanami sól fizjologiczna</td><td>UCSF Zakład hodowli komórkowych</td><td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Metaperiodat sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik (klasa proteomiczna)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>silny>Sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR Mikrowirówka</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>VWR</td><td>Branson Sonifier 240</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>Promega</td><td>Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsający blok grzewczy</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>Rotator end-to-end</td><td>Rewolwer Labnet</td><td>Regulowany rotator</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC i UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrydowy kwadrapolowy spektrometr masowy Orbitrap</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżniowy</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Probówki białkowe LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Mikrowirówki Kolumny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtracyjne</td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny wirowe</td><td>Thermo</td><td>Numer katalogowy: 69725</td><td></td></tr></tbody></table>

przepływ pracy "cell surface capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

W ciągu ostatniej dekady, proteomika oparta na spektrometrii mas umożliwiła dogłębną charakterystykę systemów biologicznych w szerokim zakresie zastosowań. Proteom powierzchniowy komórki ("surfaceom") w chorobach człowieka jest bardzo interesujący, ponieważ białka błony komórkowej są głównym celem większości klinicznie zatwierdzonych terapii, a także kluczową cechą, dzięki której można diagnostycznie odróżnić chore komórki od zdrowych tkanek. Jednak skoncentrowana charakterystyka białek błonowych i powierzchniowych komórki pozostaje wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na złożoność lizatów komórkowych, które maskują białka będące przedmiotem zainteresowania innymi białkami o wysokiej liczebności. Aby pokonać tę barierę techniczną i dokładnie zdefiniować proteom powierzchni komórki różnych typów komórek za pomocą proteomiki spektrometrii mas, konieczne jest wzbogacenie lizatu komórkowego w białka powierzchniowe komórki przed analizą na spektrometrze mas. W artykule przedstawiono szczegółowy przebieg procesu znakowania białek powierzchniowych komórek z komórek nowotworowych, wzbogacania tych białek z lizatu komórkowego, a następnie przygotowania próbki do analizy spektrometrii mas.

W niniejszym eksperymencie scharakteryzowano proteom powierzchni komórkowej linii komórek nowotworowych poprzez znakowanie biotyną białek błonowych z N-glikozylacją w nienaruszonych komórkach, a następnie wzbogacenie tych znakowanych białek z lizatu całych komórek za pomocą immunoprecypitacji z użyciem neutrawidyny (Rycina 1). Następnie przeprowadzono analizę proteomu metodą LC-MS/MS w celu scharakteryzowania wzbogaconych białek powierzchni komórkowej. W przeciwieństwie do analizy p...

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Protokół ten pozwala nam badać antygeny obecne na powierzchni komórek różnych typów komórek w celu znalezienia antygenów specyficznych dla tego typu komórki lub tkanki. Technika, którą tutaj prezentujemy, pozwala na wzbogacenie białek błony komórkowej z lizatu całego komórkowego, ostatecznie do analizy za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Tak więc jednym z konkretnych zastosowań tego protokołu jest zastosowanie go do komórek nowotworowych w celu poszukiwania antygenów obecnych na powierzchni tych komórek rakowych, a nie normalnych komórek, które mogłyby służyć jako nowe cele w immunoterapii raka.Jedną z rzeczy, na które należy zwrócić uwagę w przypadku tego protokołu, jest to, że może być ważne zoptymalizowanie danych wejściowych próbki pod kątem interesującego Cię eksperymentu. Dlatego znalezienie optymalnych warunków może zająć kilka iteracji lub miareczkowania. Procedurę zademonstruje Akul Naik, młodszy specjalista z naszego laboratorium.Na początek usuń zamrożone osady komórkowe znakowane biotyną z minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na lodzie. Dodaj 500 mikrolitrów 2X Lysis Buffer do granulki, dokładnie wymieszaj i energicznie wiruj przez 30 sekund. Sonikować

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Poznaj metodę wzbogacania białek powierzchniowych komórek z lizatów całych komórek w celu identyfikacji antygenów specyficznych dla typu komórki. Technika ta umożliwia analizę proteomiczną z wykorzystaniem spektrometrii masowej.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Przeglądaj więcej filmów