Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w poszczególnych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Ogólnym celem tej procedury jest oznakowanie i wizualizacja replikacji M-T-D-N-A w hodowanych neuronach. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację neuronów z analogiem tymidyny EDU przez dwie do 24 godzin. Drugim krokiem procedury jest oznakowanie EDU, który zawiera alkin, fluorescencyjnym azydkiem orgon green 4 88 w wyniku reakcji kowalencyjnej katalizowanej miedzią.

Ostatnim etapem procedury jest wzmocnienie zielonego sygnału orgon etapem amplifikacji sygnału aramidowego w celu wizualizacji EDU, który został włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA MT. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują replikację DNA MT w określonych subkomórkowych przedziałach neuronów poprzez połączenie chemii clicka EDU i późniejszej amplifikacji sygnału łzawienia. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie BRDU, jest to, że znakowanie EDU jest łatwiejsze i łagodniejsze, co pozwala na dodatkowe barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych.

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji liczby mitochondriów, takie jak to, w jaki sposób neurony radzą sobie ze zmieniającymi się obciążeniami energetycznymi w swoich subkomórkowych przedziałach, w tym ciałach komórkowych, aksonach, dendrytach i zakończeniach synaptycznych. Metoda ta może więc dostarczyć informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw patogenezy wielu mitochondrialnych chorób neurologicznych, w tym neuropatii i neurodegeneracji. Ale co ważne, można go również zastosować do innych systemów, w których zmiany w kopii mitochondrialnego DNA prawdopodobnie leżą u podstaw patogenezy stanu chorobowego, w tym toksyczności leków, raka i starzenia się.

Ten film pokaże, jak oznaczyć nowo zsyntetyzowane mitochondrialne DNA, w skrócie M-T-D-N-A w neuronach zwojowych korzenia grzbietowego, które zostały wyhodowane na sterylnych 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych. Na 24-dołkowej płytce hodowlanej rozcieńczyć 10-milimolowy zapas pięciu etanoli dwóch doksyurydyny, w skrócie EDU z zestawu do oznaczania mikropłytek Clicka EDO, od jednego do 100 w pożywce hodowlanej dla materiału 10 XEDU. 10 wywarów XEDU jest następnie dodawany bezpośrednio do pożywki w każdej studzience, inkubuje leczone neurony przez dwie do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w dygestorium.

Utrwal neurony w 2% aldehydzie Paraform przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Prać dwa razy w jednym XPBS przez dwie do pięciu minut każde pranie. Utrwalone neurony mogą być przechowywane w świeżym XPBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.

Przygotuj wilgotną komorę zgodnie z opisem w dołączonym tekście. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś 28 stałych szkiełek nakrywkowych, w tym dodatnie i ujemne kontrole EDU, na arkusze hydrofobowego paraformu M wewnątrz wilgotnej komory. Ponownie nałóż od 200 do 300 mikrolitrów jednego XPBS, aby pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego.

Przygotuj zestaw do oznaczania na klik zgodnie z opisem w tekście oraz producentach i instrukcjach oznaczania mitochondrialnego DNA w 75 do 80 mikrolitrach przepuszczalnego roztworu zawierającego 0,1% trytonu X w jednym XPBS do każdej pokrywy, wsunięcia, przykrycia i inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj pipety do przenoszenia gruszki z końcówką o pojemności 200 mikrolitrów przymocowaną na końcu. Aby delikatnie usunąć płyn bez utraty komórek.

Użyj pipety do bańki, aby delikatnie zalać pokrywę. Poślizgnąć się z 200 do 300 mikrolitrami jednego XPBS, aby dokładnie wypłukać poprzedni roztwór. Umyj każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie.

Odpipetować od 75 do 80 mikrolitrów świeżego 1% nadtlenku wodoru w jednym XPBS na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy. Spłucz dwukrotnie jednym XPBS, tak jak poprzednio, świeżo przygotuj koktajl reakcyjny klik at, jak opisano w dołączonym tekście.

Ruruj w górę iw dół, aby wymieszać. Nie należy zawirowywać neuronów za pomocą 75 do 80 mikrolitrów kliknięcia w utrwalacz EDU na szkiełko nakrywkowe, inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji postfiksowej rozcieńczyć koktajl reakcyjny równą objętością utrwalacza clicka EDU.

Dodaj koktajl reakcyjny do każdej okładki szkiełka nakrywkowego, aby chronić przed światłem i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Delikatnie usunąć płyn do płukania koktajlu reakcyjnego dwukrotnie rozcieńczonym buforem blokującym 1x pod mikroskopem fluorescencyjnym epi. Sprawdź, czy w jądrach nie ma zielonego zabarwienia orgonu po zakończeniu barwienia EDU.

Rozpocznij wzmacnianie sygnału termitów lub TSA, dodaj 1% roztwór blokowy TSA do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Krótko odwirować zapas przeciwciał sprzężonych z zielonym chrzanem i peroksydazą chrzanową Przygotowany od dwóch do 24 godzin przed TSA, rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe od jednego do 300 w roztworze blokującym TSA i odwrócić lub pipetować, aby wymieszać wir węzła tune. Dodaj 75 mikrolitrów do każdej pokrywy, wsuń i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia spłucz trzy razy jednym XPBS w temperaturze pokojowej. Inkubować szkiełka nakrywkowe w końcowym płukaniu przez dodatkowe 30 do 60 minut, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe zostało usunięte. Przygotuj reakcję IDE zgodnie z częścią tekstową tego protokołu bezpośrednio przed użyciem.

Inkubować szkiełka nakrywkowe w reakcji IDE przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie jednym XPBS, inkubując w końcowym płukaniu przez 30 do 60 minut, tak jak poprzednio pod mikroskopem. Sprawdź, czy MT DNA znakuje pomyślnie wybarwione neurony na szkiełkach za pomocą pożywki montażowej ANTIFA zawierającej DPI, pokazane tutaj są reprezentatywne obrazy kontrastu interferencji różnicowej neuronów zwojowych korzenia grzbietowego i dorosłych, które są zwykle używane do analizy.

Te schematy ideowe przedstawiają procedurę oznaczania EDU w MTD NA zielonym sygnałem fluorescencyjnym. Mitotycznie aktywne komórki nerwiaka zarodkowego F 11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzór znakowania EDU, który został włączony do jądrowego i mitochondrialnego DNA w tych reprezentatywnych obrazach fluorescencyjnych nałożonych na jasne pole. Zielone sygnały punktowe pokazują wzmocniony sygnał EDU włączony do nowo zsyntetyzowanych M-D-D-N-A zarówno embrionalnych, jak i dorosłych neuronów zwoju korzenia grzbietowego.

Procedura znakowania EDU pozwala na późniejsze immunofluorescencyjne barwienie markerów neuronalnych, takich jak neurofilament w kolorze czerwonym. Te schematy ideowe przedstawiają procedurę oznaczania EDU i MTD NA czerwonym sygnałem fluorescencyjnym. Mitotycznie aktywne komórki nerwiaka zarodkowego F 11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzorzec znakowania EDU, który został włączony do jądrowego i mitochondrialnego DNA.

Ten schemat ideowy przedstawia procedurę oznaczania BRDU w nowo zsyntetyzowanym M-T-D-N-A za pomocą zielonego lub czerwonego sygnału fluorescencyjnego. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o przeprowadzeniu kontroli przy użyciu komórek aktywnych mitotycznie w celu sprawdzenia pomyślnego znakowania EDU i jąder komórkowych przed przejściem do etapów amplifikacji w celu wizualizacji znakowania DNA MT Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak standardowa immunofluorescencja, mogą być wykonane w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób synteza DNA mitochondriów jest regulowana w określonych subpopulacjach neuronów lub przedziałach neuronalnych Ze względu na swój rozwój, technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania regulacji liczby mitochondriów w modelach hodowlanych zarówno normalnej fizjologii, jak i modelach kulturowych, które symulują upośledzoną chorobę.

Stany neurologiczne.