Name: Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w poszczególnych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji replikacji mtDNA w neuronach przy użyciu analogu tymidyny EdU i wzmacniania sygnału tyramidowego. Technika umożliwia badanie biogenezy mitochondriów w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health NS-38849 i DK-076160, Juvenile Diabetes Research Foundation Center for the Study of Complications in Diabetes, Program for Neurology Research and Discovery oraz The A. Alfred Taubman Medical Research Institute na University of Michigan. W pracy wykorzystano Morphology and Image Analysis Core w Michigan Diabetes Research and Training Center, finansowane z grantu National Institutes of Health 5P60 DK-20572 przyznanego przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Autorzy dziękują Scottowi T. Clarke'owi z Molecular Probes/Invitrogen za cenne rady dotyczące różnych zestawów do znakowania Click-iT EdU oraz za hojną darowiznę odczynników, które wsparły wstępny rozwój techniki amplifikacji EdU.

<ol><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li>
<li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28De%29constructing+mitochondria%3A+what+for%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li>
<li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+matters%3A+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+%5B%283%29H%5Dthymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li>
<li>Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li>
<li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Ethynyl-2%27-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro.+J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li>
<li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li>
<li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opracowaliśmy czuły test do znakowania nowo syntetyzowanego mtDNA w pojedynczych komórkach, wykorzystując wzmocnienie sygnału tyramidą dla EdU. Jednym z największych problemów podczas optymalizacji tego protokołu były niespójne wyniki pomiędzy poszczególnymi szkiełkami cover-slip. Wprowadzono zmiany w protokołach zestawu Invitrogen, aby uniknąć mieszania małych objętości bezpośrednio na szkiełkach i zamiast tego przygotowywać roztwory główne do zastosowania dla wszystkich próbek. Objętość 75-80 μL użyta dla każdego okrągłego szklanego cover-slip o średnicy 12 mm jest objętością idealną, aby całkowicie pokryć powierzchnię, zapewniając jednocześnie wystarczającą ilość roztworu dla uzyskania spójnych wyników między próbkami. Czas inkubacji oraz stężenia odczynników zostały zoptymalizowane, jednak możliwe są dalsze ulepszenia poprzez ich dodatnią korektę.
Protokół został opracowany tak, aby każdy proces przeprowadzić jednorazowo. Niemniej jednak niektóre kroki powtórzono z użyciem nowych roztworów w celu odzyskania próbek, które nie powiodły się przy pierwszej próbie. W szczególności kroki reakcji klikowej EdU (3.4-3.6) powtórzono bez znaczącego wzrostu fluorescencji tła. Kroki inkubacji przeciwciała anty-Oregon Green-HRP (4.1-4.3) oraz amplifikacji tyramidowej (4.4-4.5) również zostały powtórzone, jednak częściej skutkowało to słabym stosunkiem sygnału do szumu z powodu zwiększonej fluorescencji tła.
Najbardziej wrażliwymi odczynnikami są dodatek do buforu Click-iT EdU (Komponent G) oraz przeciwciało królicze anty-Oregon Green-HRP (Komponent I) z zestawu Click-iT EdU Microplate Assay. Dodatek do buforu Click-iT EdU z czasem stopniowo żółknie podczas przechowywania w temperaturze 4°C, a w okresie od 6 do 12 miesięcy znacznie ciemnieje. Przechowywanie dodatku do buforu Click-iT EdU w temperaturze -20°C pozwoli rozwiązać ten problem. Etapy znakowania i amplifikacji tyramidowej przebiegają najskuteczniej, gdy przeciwciało królicze anty-Oregon Green-HRP zostanie wykorzystane w ciągu 4-6 miesięcy od jego reconstitution w MilliQ dH2O.
Łagodne znakowanie EdU w mtDNA umożliwia bezpośrednie porównania z dodatkowymi markerami komórkowymi9-11 i zwiększa użyteczność tej techniki w stosunku do innych analogów tymidyny, takich jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), która wymaga drastycznej obróbki w celu odsłonięcia epitopu w obrębie DNA. Nasze laboratorium11-12 oraz inne ośrodki13-15 z sukcesem wykorzystywały BrdU do znakowania mtDNA. Technika znakowania BrdU jest podobna do tej stosowanej dla EdU, lecz wykazuje pewne istotne różnice (Rycina 5). Po etapie permeabilizacji opisanym powyżej (3.1-3.2), epitop BrdU jest odzyskiwany poprzez etap denaturacji (2 N HCl przez 30 min w 37°C, a następnie trzy przemycia w 1X PBS). Następnie BrdU jest znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko BrdU (Vector Laboratories, rozcieńczonym 1:50 w 1% roztworze blokującym z zestawu TSA i inkubowanym przez noc w 4°C). Przed etapami TSA (powyższe 4.3-4.5) konieczny jest etap z przeciwciałem wtórnym w celu wzmocnienia sygnału BrdU (kozia anty-mysia IgG sprzężona z HRP z zestawów TSA nr 2 i nr 5, rozcieńczona 1:100 w 1% roztworze blokującym i inkubowana przez 45 min w temperaturze pokojowej). Posiadanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, do znakowania mtDNA jest korzystne przy przeprowadzaniu eksperymentów z podwójnym znakowaniem, w których mtDNA może być znakowane sekwencyjnie w paradygmatach znakowania pulsacyjnego11.
Nasze laboratorium wykorzystuje znakowanie mtDNA za pomocą EdU i BrdU do badania regulacji biogenezy mitochondriów w kontekście neuropatii cukrzycowej, częstego powikłania cukrzycy. Z sukcesem zastosowaliśmy wzmocnienie sygnału do pomiaru zmian w biogenezie mtDNA w pojedynczych neuronach11-12. Technika ta będzie użyteczna w innych eksperymentach mających na celu zbadanie mechanizmów replikacji i wymiany mtDNA lub w identyfikacji leków hamujących syntezę mtDNA. Ponadto podstawowe zasady wzmacniania sygnałów EdU i BrdU można zastosować w innych badaniach mierzących replikację lub naprawę DNA.

<table><tbody><tr><td>laseczki 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>szalka BioAssay 245 mm x 245 mm</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>roztwór fosforanowo-buforowana soli PBS 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenek wodoru, 30% w wodzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>zestaw Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>zestaw TSA Kit #12, z HRP&amp;#8212;kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG i tyramidą Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>zestaw TSA Kit #15, z HRP&amp;#8211;kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG i tyramidą Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik antywyblakający ProLong Gold z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>poliklonalne królicze przeciwciało przeciwko neurofilamentom</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>mysie monoklonalne przeciwciało anty-BrdU</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>zestaw TSA Kit #2, z HRP&amp;#8212;kozim przeciwciałem anty-mysim IgG i tyramidą Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>zestaw TSA Kit #5, z HRP&amp;#8212;kozim przeciwciałem anty-mysim IgG i tyramidą Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja replikacji mitochondrialnego dna w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału edu

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondria są kluczowymi regulatorami energii komórkowej, a biogeneza mitochondriów stanowi niezbędny element regulacji ich liczby w zdrowych komórkach1-3. Jednym z podejść do monitorowania biogenezy mitochondriów jest pomiar szybkości replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA)4. Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mtDNA w poszczególnych komórkach w celu badania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU)5-7 z protokołem wzmocnienia sygnału tyramidą (TSA)8, aby zwizualizować replikację mtDNA w przedziałach subkomórkowych neuronów. EdU jest lepsza od innych analogów tymidyny, takich jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), ponieważ wstępna reakcja typu click służąca do znakowania EdU5-7 nie wymaga drastycznych zabiegów kwasowych ani trawienia enzymatycznego, które są niezbędne do odsłonięcia epitopu BrdU. Łagodniejsze znakowanie EdU umożliwia bezpośrednie porównanie jej wbudowywania z innymi markerami komórkowymi9-10. Możliwość wizualizacji i kwantyfikacji biogenezy mtDNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania mechanizmów regulujących biogenezę mitochondriów i pozwala na uzyskanie wglądu w patogenezę związaną z toksycznością leków, starzeniem się, nowotworami oraz chorobami neurodegeneracyjnymi. Nasza technika ma zastosowanie w neuronach sensorycznych, jak i w innych typach komórek. Wykorzystanie tej metody do pomiaru biogenezy mtDNA ma istotne znaczenie dla pogłębienia zrozumienia zarówno prawidłowej fizjologii komórkowej, jak i zaburzeń w stanach chorobowych.

Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w pojedynczych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie EdU z protokołem tyramidowej amplifikacji sygnału (TSA), aby zwizualizować replikację mtDNA w obrębie przedziałów subkomórkowych neuronów.

Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Mitochondria są kluczowymi regulatorami energii komórkowej, a biogeneza mitochondriów stanowi istotny element regulacji ich liczby w zdrowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie i wizualizacja replikacji mtDNA w hodowlanych neuronach. Jest to osiągane poprzez inkubację neuronów z analogiem tymidyny EDU przez okres od dwóch do 24 godzin. Drugim krokiem procedury jest znakowanie EDU zawierającego alkin przy użyciu fluorescencyjnego barwnika Oregon Green 488 azide w miedziowo katalizowanej reakcji kowalencyjnej.Ostatnim krokiem procedury jest wzmocnienie sygnału orgon green za pomocą etapu wzmocnienia sygnału aramide, aby zwizualizować EDU wbudowane w nowo syntetyzowane MT DNA. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące replikację MT DNA w określonych przedziałach subkomórkowych neuronów dzięki połączeniu chemii clicka EDU i następnego wzmocnienia sygnału tear mind. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie BRDU, jest to, że znakowanie EDU jest łatwiejsze i łagodniejsze, co pozwala na dodatkowe barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji liczby mitochondriów, takie jak sposób, w jaki neurony dostosowują się do zmieniającego się zapotrzebowania energetycznego w swoich przedziałach subkomórkowych, w tym w ciałach komórek, aksonach, dendrytach i zakończeniach synaptycznych. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw patogenezy wielu neurologicznych chorób mitochondrialnych, w tym neuropatii i neurodegeneracji. Co istotne, można ją również zastosować w innych układach, w których zmiany w liczbie kopii mtDNA prawdopodobnie leżą u podstaw patogenezy stanu chorobowego, w tym w przypadku toksyczności leków, nowotworów oraz starzenia się organizmu.W tym filmie zostanie zademonstrowano, jak znakować nowo zsyntetyzowane mitochondrialne DNA (w skrócie mtDNA) w neuronach z zwojów korzeniowych tylnych, które hodowano na sterylnych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm. W 24-dołkowej płytce hodowlanej należy rozcieńczyć 10 mM roztwór zapasowy 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (w skrócie EdU) z zestawu Clicka EdU Microplate assay kit w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej, aby uzyskać 10-krotny roztwór zapasowy EdU. Następnie 10-krotny roztwór zapasowy EdU dodaje się bezpośrednio do pożywki w każdym dołku. Traktowane neurony należy inkubować od 2 do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w komorze wyciągowej.Utrwal neurony w 2% Paraformaldehydzie przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj dwa razy w 1x PBS, wykonując każde płukanie przez dwie do pięciu minut. Utrwalone neurony można przechowywać w świeżym 1x PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego miesiąca.Przygotować komorę wilgotną zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Za pomocą pęsety z cienkimi końcami przenieść 28 utrwalonych szkiełek nakrywkowych, w tym pozytywne i negatywne kontrole EDU, na arkusze hydrofobowej paraformy M wewnątrz komory wilgotnej. Nanieść ponownie 200 do 300 µL 1x PBS, aby pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego.Przygotuj zestaw do analizy typu click zgodnie z opisem w tekście oraz instrukcjami producenta, aby oznakować mitochondrialne DNA; nanieś od 75 do 80 µL roztworu przepuszczalnego zawierającego 0,1% Triton X w 1x PBS na każdy szkiełko przedmiotowe i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj pipety transferowej z końcówką 200 µL przymocowaną do końca, aby delikatnie usunąć ciecz, nie tracąc przy tym komórek.Za pomocą pipety z gruszką delikatnie zalej szkiełko nakrywką. Dodaj od 200 do 300 µL 1x PBS, aby dokładnie wypłukać poprzedni roztwór. Każde szkiełko nakrywkowe przemyj dwukrotnie.Nanieś pipetą od 75 do 80 µL świeżego 1% nadtlenku wodoru w 1x PBS na każde szkiełko podstawowe. Inkubuj pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania endogennej aktywności peroksydazy. Przepłucz dwukrotnie 1x PBS, a następnie przygotuj świeży koktajl do reakcji click zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście.Mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Nie używać miksera vortex. Poddać neurony postfiksacji, dodając od 75 do 80 µl utrwalacza Click-iT EDU na każde szkiełko podstawowe i inkubując w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji postfiksacyjnej rozcieńczyć koktajl reakcyjny równą objętością utrwalacza Click-iT EDU.Dodaj koktajl reakcyjny do każdego szkiełka podstawowego, zabezpieczając je przed światłem, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Delikatnie usuń koktajl reakcyjny i przemyj dwukrotnie rozcieńczonym 1x buforem blokującym pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Po zakończeniu barwienia EDU sprawdź barwienie jąder Organ Green.Rozpocznij amplifikację sygnału tyraminowego (TSA), dodając 1% roztwór blokujący TSA do każdej szkiełka cover slip i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Krótko odwiruj zapas przeciwciała anty-green horse radish peroxidase (konjugat z peroksydazą chrzanową), przygotowany od dwóch do 24 godzin przed TSA. Rozcieńcz przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:300 w roztworze blokującym TSA i wymieszaj przez odwracanie lub pipetowanie; nie stosuj vortexa. Dodaj 75 µL do każdego szkiełka cover slip i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia trzykrotnie wypłucz próbki za pomocą 1X PBS w temperaturze pokojowej. Inkubuj szkiełka nakrywki w ostatnim płukaniu przez dodatkowe 30 do 60 minut, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zostały usunięte. Przygotuj odczynnik do reakcji IDE zgodnie z opisem w tej procedurze bezpośrednio przed użyciem.Inkubować szkiełka nakrywkowe z reakcją IDE przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie roztworem XPBS, inkubując podczas ostatniego płukania przez 30 do 60 minut, analogicznie jak poprzednio, obserwując pod mikroskopem. Sprawdzić znakowanie MT DNA, a następnie zamontować pomyślnie zabarwione neurony na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego ANTIFA zawierającego DPI. Przedstawione tutaj obrazy z kontrastu interferencyjnego są reprezentatywnymi obrazami neuronów z embrionalnych i dorosłych zwojów korzeni grzbietowych, które są zazwyczaj wykorzystywane do analizy.Niniejsze schematy przedstawiają procedurę znakowania EDU w MTD NA za pomocą zielonego sygnału fluorescencyjnego. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F 11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzorzec znakowania EDU włączonego do DNA jądrowego i mitochondrialnego na reprezentatywnych obrazach fluorescencyjnych nałożonych na obraz w polu jasnym. Zielone sygnały punktowe wskazują wzmocniony sygnał EDU włączony do nowo syntetyzowanego M-D-D-N-A w neuronach zwojów korzeni grzbietowych zarówno zarodkowych, jak i dorosłych.Procedura znakowania EDU umożliwia późniejsze barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, takich jak neurofilament, kolorem czerwonym. Przedstawione schematy ilustrują procedurę znakowania EDU i MTD NA czerwonym sygnałem fluorescencyjnym. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F 11 służą jako kontrola pozytywna i obrazują wzór znakowania EDU wbudowanego w DNA jądrowe i mitochondrialne.Ten schemat przedstawia procedurę znakowania BrdU w nowo syntetyzowanym mtDNA sygnałem fluorescencyjnym w kolorze zielonym lub czerwonym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przeprowadzenie kontroli z wykorzystaniem komórek aktywnych mitotycznie, aby sprawdzić poprawność znakowania EdU oraz widoczność jąder komórkowych przed przejściem do etapów amplifikacji w celu wizualizacji znakowania mtDNA zgodnie z poniższą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób regulacji syntezy mtDNA w konkretnych subpopulacjach neuronów lub przedziałach neuronalnych, można zastosować inne metody, np. standardową immunofluorescencję. Dzięki opracowaniu tej techniki badacze z dziedziny neurobiologii zyskają możliwość badania regulacji liczby mitochondriów w modelach hodowlanych odzwierciedlających zarówno prawidłową fizjologię, jak i modelach symulujących procesy chorobowe.Stany neurologiczne.

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja replikacji DNA mitochondrialnego w pojedynczych komórkach poprzez wzmacnianie sygnału EdU

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj metodę wizualizacji replikacji mtDNA w neuronach przy użyciu analogu tymidyny EdU i wzmacniania sygnału tyramidowego. Technika umożliwia badanie biogenezy mitochondriów w komórkach nerwowych.

Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Przeglądaj więcej filmów