Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym
30 czerwca 2023
Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.
Opracowaliśmy narzędzie do wykonywania obrazowania przyżyciowego na żywych myszach przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dzięki temu możemy śledzić dynamikę komórek skóry w trakcie homeostazy i porównywać zachowania komórek podczas początku i postępu choroby. Mikroskopia wielofotonowa jest podstawowym podejściem stosowanym w celu uzyskania śledzenia komórek w trybie przyżyciowym.
Jednak wady tych mikroskopów obejmują ograniczoną wszechstronność obrazowania w codziennym życiu, wysokie koszty i złożoność techniczną. Nasze nowe narzędzie umożliwia wykorzystanie wszechstronnych odwróconych mikroskopów konfokalnych do obrazowania przyżyciowego in vivo. Modyfikując plik projektowy, wymiary wkładki stolika można dostosować tak, aby pasowały do dowolnej marki mikroskopu odwróconego.
Otwór na obiektyw można zmienić jego rozmiar i położenie, aby dopasować go do dowolnego modelu zwierzęcego i tkanki. Aby rozpocząć instalację wydrukowanej w 3D wkładki do obrazowania na żywo na odwróconym stoliku mikroskopu, ostrożnie umieść wkładkę w dużym rowku stolika mikroskopu. Za pomocą zabezpiecz każdy róg wkładki.
Wsuń płytę grzewczą do bocznego otworu wkładki w orientacji wtyczki do dołu, tak aby płyta leżała na dolnych rowkach wkładki z portem wtyczki pod spodem stage. Dopasuj rowkowany okrągły otwór we wkładce do obiektywu zanurzeniowego z olejkiem silikonowym 40X i nałóż olej silikonowy na środek obiektywu. Następnie za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość smaru próżniowego wzdłuż rowkowanego okrągłego otworu.
Połóż krążek szkiełka nakrywkowego na górze otworu, aby uszczelnić go na wkładce. Na koniec podnieś obiektyw 40X, aż ledwo dotknie dna szklanego szkiełka nakrywkowego. Przed umieszczeniem znieczulonej myszy na wkładce do obrazowania na żywo zainstalowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, należy przewlec rurkę izofluranu z dołączonym stożkiem nosowym przez narożny wspornik rurki na wkładce.
Po wpięciu płyty grzewczej do sterownika zawierającego dołączoną sondę termometru analnego i włączeniu jej, przenieś znieczuloną mysz z komory indukcyjnej na płytę grzewczą. Następnie przymocuj stożek nosowy do myszy. Włóż sondę analną do zwierzęcia i wyreguluj kontroler, aby utrzymać stabilną temperaturę ciała około 36 stopni Celsjusza.
Przykryj prawidłowo ustawioną mysz plastikową folią spożywczą, aby zatrzymać ciepło ciała i podnieść temperaturę ciała. Ustaw mysz tak, aby jej głowa zrównywała się z krążkiem szkiełka nakrywkowego i unieruchamij ucho na środku szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą metalowego klipsa na ucho lub taśmy. Po zakończeniu obrazowania wybierz opcję niskiego przepływu w parowniku elektronicznym, aby zaprzestać dostarczania izofluranu.
Przenieś mysz na poduszkę grzewczą, aż stanie się ruchoma. Po wyjęciu szkiełka nakrywkowego należy go wytrzeć do czysta papierem do soczewek i roztworem do soczewek. Przechowuj go prawidłowo, aby uniknąć zadrapań do ponownego użycia.
Następnie odłącz rurkę znieczulenia od wspornika wkładki i odkręć wkładkę od stolika mikroskopu. Nabyty stos Z znakowanej fluorescencyjnie żywej tkanki ucha myszy wykazał minimalny dryf w osiach x, y i z w czasie, co potwierdza niestandardową drukowaną w 3D wkładkę do obrazowania na żywo. Punkty czasowe z trzygodzinnego filmu poklatkowego komórek naskórka ucha myszy mCherry z dodatnim wynikiem u dorosłego samca myszy ujawniły pojedynczą płaszczyznę Z, która pozostawała ostra przez dłuższy czas.
Podobne obserwacje poczyniono na podstawie innego trzygodzinnego filmu poklatkowego przedstawiającego fibroblasty skóry ucha z dodatnim wynikiem GFP dorosłej samicy myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia nowe narzędzie do obrazowania intravitalnego z wykorzystaniem odwróconej mikroskopii konfokalnej u żywych myszy, co pozwala badaczom na śledzenie dynamiki komórek skóry podczas homeostazy i progresji choroby. Nowe narzędzie rozwiązuje ograniczenia mikroskopii wielofotonowej, czyniąc obrazowanie intravitalne bardziej dostępnym i wszechstronnym.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Obrazowanie intravitalne
- Dynamika komórek skóry
- Techniki mikroskopowe
Wprowadzenie
- Obecne ograniczenia mikroskopii wielofotonowej obejmują wysokie koszty oraz złożoność techniczną.
- Odwrócone mikroskopy konfokalne oferują wszechstronne możliwości obrazowania żywych tkanek.
- Zindywidualizowana konstrukcja pozwala na adaptację do różnych modeli zwierzęcych.
Zastosowane metody
- Odwrócona mikroskopia konfokalna z niestandardowymi wkładkami wydrukowanymi w technologii 3D
- Żywe myszy jako system biologiczny
- Konfigurowalny zestaw do obrazowania dla różnych tkanek
Główne wyniki
- Pomyślne pozyskanie stosów Z (Z-stacks) tkanki ucha znakowanej fluorescencyjnie przy minimalnym dryfcie.
- Ciągłe obrazowanie komórek skóry (dodatnich dla mCherry i GFP) przez przedłużone okresy czasu.
- Potwierdzenie skuteczności wydrukowanych w technologii 3D wkładów do obrazowania na żywo w celu zapewnienia stabilności obrazowania.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje innowacyjne podejście do usprawnienia możliwości obrazowania intravitalnego.
- Narzędzie to zwiększa możliwość badania dynamiki komórkowej w żywych modelach, co przyczynia się do rozwoju badań nad biologią komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Długoterminowe obrazowanie intravitalne dynamiki tkanki nabłonkowej jest kluczowe dla zrozumienia zachowań komórkowych leżących u podstaw inicjacji i progresji chorób. To usprawnione podejście z wykorzystaniem odwróconej mikroskopii konfokalnej obniża bariery techniczne i kosztowe, umożliwiając szersze zastosowanie obrazowania in vivo w badaniach biofarmaceutycznych na etapie odkrywania leków. Zwiększona dostępność do stabilnego, ilościowego obrazowania żywych komórek wspiera pewność prognostyczną we wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz w badaniach mechanistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację zachowań żywych komórek w nienaruszonym środowisku tkankowym.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez śledzenie odpowiedzi komórkowych podczas rozwoju choroby.
- Ułatwia funkcjonalną walidację punktów uchwytu dzięki podłużnemu monitorowaniu dynamiki komórek.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnej selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne obrazowanie komórek znakowanych fluorescencyjnie in vivo.
- Dostarcza ilościowych wyników w postaci stosów Z (Z-stack) dla rzetelnego opracowywania testów.
- Wspiera standaryzację i skalowalność w wielu typach tkanek i modelach zwierzęcych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na dynamikę komórkową na poziomie tkanki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania in vivo do modeli istotnych dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu, skorygowanych o ryzyko, w oparciu o odpowiedzi tkankowe w czasie rzeczywistym.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez korelację dynamicznych zachowań komórkowych z progresją choroby.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy, które pomagają w wyborze odpowiedniego modelu przedklinicznego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta platforma obrazowania integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badanie dynamiki komórkowej w natywnym kontekście tkankowym w oparciu o stawiane hipotezy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania w celu przygotowania testów analitycznych.
- Analityka: Wspiera podłużne pomiary zachowań komórkowych i stabilności tkanek.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki danym obrazowym istotnym dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Możliwość dostosowania projektu pozwala na adaptację w różnych platformach i układach organów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach tkanek żywych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy w obrazowaniu dzięki zestandaryzowanym, wielokrotnego użytku komponentom.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję barier technicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z żywymi zwierzętami oraz w obsłudze mikroskopu konfokalnego.
- Wymaga dostępu do odwróconych mikroskopów konfokalnych i kompatybilnych wkładów do stolika wykonanych w druku 3D.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli zwierzęcych i typów tkanek poprzez modyfikacje konstrukcyjne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują utrzymanie żywotności zwierząt oraz stabilności obrazowania podczas długich sesji.
