Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Opracowaliśmy narzędzie do wykonywania obrazowania przyżyciowego na żywych myszach przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dzięki temu możemy śledzić dynamikę komórek skóry w trakcie homeostazy i porównywać zachowania komórek podczas początku i postępu choroby. Mikroskopia wielofotonowa jest podstawowym podejściem stosowanym w celu uzyskania śledzenia komórek w trybie przyżyciowym.

Jednak wady tych mikroskopów obejmują ograniczoną wszechstronność obrazowania w codziennym życiu, wysokie koszty i złożoność techniczną. Nasze nowe narzędzie umożliwia wykorzystanie wszechstronnych odwróconych mikroskopów konfokalnych do obrazowania przyżyciowego in vivo. Modyfikując plik projektowy, wymiary wkładki stolika można dostosować tak, aby pasowały do dowolnej marki mikroskopu odwróconego.

Otwór na obiektyw można zmienić jego rozmiar i położenie, aby dopasować go do dowolnego modelu zwierzęcego i tkanki. Aby rozpocząć instalację wydrukowanej w 3D wkładki do obrazowania na żywo na odwróconym stoliku mikroskopu, ostrożnie umieść wkładkę w dużym rowku stolika mikroskopu. Za pomocą zabezpiecz każdy róg wkładki.

Wsuń płytę grzewczą do bocznego otworu wkładki w orientacji wtyczki do dołu, tak aby płyta leżała na dolnych rowkach wkładki z portem wtyczki pod spodem stage. Dopasuj rowkowany okrągły otwór we wkładce do obiektywu zanurzeniowego z olejkiem silikonowym 40X i nałóż olej silikonowy na środek obiektywu. Następnie za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość smaru próżniowego wzdłuż rowkowanego okrągłego otworu.

Połóż krążek szkiełka nakrywkowego na górze otworu, aby uszczelnić go na wkładce. Na koniec podnieś obiektyw 40X, aż ledwo dotknie dna szklanego szkiełka nakrywkowego. Przed umieszczeniem znieczulonej myszy na wkładce do obrazowania na żywo zainstalowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, należy przewlec rurkę izofluranu z dołączonym stożkiem nosowym przez narożny wspornik rurki na wkładce.

Po wpięciu płyty grzewczej do sterownika zawierającego dołączoną sondę termometru analnego i włączeniu jej, przenieś znieczuloną mysz z komory indukcyjnej na płytę grzewczą. Następnie przymocuj stożek nosowy do myszy. Włóż sondę analną do zwierzęcia i wyreguluj kontroler, aby utrzymać stabilną temperaturę ciała około 36 stopni Celsjusza.

Przykryj prawidłowo ustawioną mysz plastikową folią spożywczą, aby zatrzymać ciepło ciała i podnieść temperaturę ciała. Ustaw mysz tak, aby jej głowa zrównywała się z krążkiem szkiełka nakrywkowego i unieruchamij ucho na środku szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą metalowego klipsa na ucho lub taśmy. Po zakończeniu obrazowania wybierz opcję niskiego przepływu w parowniku elektronicznym, aby zaprzestać dostarczania izofluranu.

Przenieś mysz na poduszkę grzewczą, aż stanie się ruchoma. Po wyjęciu szkiełka nakrywkowego należy go wytrzeć do czysta papierem do soczewek i roztworem do soczewek. Przechowuj go prawidłowo, aby uniknąć zadrapań do ponownego użycia.

Następnie odłącz rurkę znieczulenia od wspornika wkładki i odkręć wkładkę od stolika mikroskopu. Nabyty stos Z znakowanej fluorescencyjnie żywej tkanki ucha myszy wykazał minimalny dryf w osiach x, y i z w czasie, co potwierdza niestandardową drukowaną w 3D wkładkę do obrazowania na żywo. Punkty czasowe z trzygodzinnego filmu poklatkowego komórek naskórka ucha myszy mCherry z dodatnim wynikiem u dorosłego samca myszy ujawniły pojedynczą płaszczyznę Z, która pozostawała ostra przez dłuższy czas.

Podobne obserwacje poczyniono na podstawie innego trzygodzinnego filmu poklatkowego przedstawiającego fibroblasty skóry ucha z dodatnim wynikiem GFP dorosłej samicy myszy.