Name: Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę obrazowania przyżyciowego skóry myszy przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z wkładkami drukowanymi 3D. Technika umożliwia długoterminowe śledzenie dynamiki komórek nabłonkowych w warunkach homeostazy i choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Valentinie Greco za myszy K14-mCherry-H2B. Jesteśmy wdzięczni Warsztatowi Mechanicznemu Wydziału Fizyki Uniwersytetu Emory za wygenerowanie szklanych dysków nakrywkowych. Praca ta została sfinansowana przez Career Development Award #IK2 BX005370 od Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych BLRD Service dla LS, NIH Awards RF1-AG079269 i R56-AG072473 dla MJMR oraz I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award dla MJMR.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Emory University i Atlanta Veterans Affairs Medical Center i zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Instalowanie wkładki do obrazowania na żywo na stoliku mikroskopu odwróconego
<ol>
	<li>Skonstruuj wkładkę przy użyciu plików .stl (plik uzupełniający 1, plik uzupełniający 2 i plik uzupełniający 3) określających wymiary 3D i projekt (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A), drukarki 3D i kwasu polimlekowego (PLA).</li>
	<li>Ostrożnie umieść wkładkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C) w dużym rowku stolika mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Użyj, aby przymocować wkładkę za pomocą czterech otworów na znajdujących się w każdym rogu wkładki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B-C). 
	UWAGA: Wkładka jest dwukierunkowa i można ją obracać o 180° w zależności od orientacji stolika mikroskopu i aparatu anestezjologicznego.</li>
	<li>Wsuń płytę grzewczą do wtyczki wkładanej stroną do dołu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) tak, aby urządzenie leżało na dolnych rowkach wkładki z portem wtyczki przechodzącym pod spodem stage (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Dopasuj rowkowany okrągły otwór we wkładce do 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego z olejkiem silikonowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C) i nałóż olej silikonowy na środek obiektywu.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazowania przez dłuższy czas (>1 h) nałóż dużą porcję oleju, który utrzyma się na granicy szkiełka nakrywkowego / obiektywu przez cały czas obrazowania. Nie pozwól, aby olej rozlał się po krawędziach obiektywu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość smaru próżniowego wzdłuż rowkowanego okrągłego otworu i połóż krążek szkiełka nakrywkowego na górze, aby uszczelnić wkładkę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). 
	UWAGA: Krążek szkiełka nakrywkowego powstaje poprzez usunięcie ścianek naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem o wymiarach 35 mm x 10 mm (wykonywane przez warsztat mechaniczny).</li>
	<li>Podnieś obiektyw 40x, aż olej pocałuje spód szklanego szkiełka nakrywkowego.</li>
</ol>
2. Konfiguracja izofluranu i przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Umieść elementy elektronicznego parownika o niskim przepływie (komora anestezjologiczna, rurka, parownik, kanister na węgiel drzewny) tak, aby stożek nosowy i dołączona rurka mogły dotrzeć do wkładu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym i należy obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć rozlania i zminimalizować narażenie ludzi.</li>
	<li>Zmierzyć masę butelki z izofluranem przed użyciem i zarejestrować. Przymocuj nakrętkę z waporyzatora elektronicznego do butelki z izofluranem.</li>
	<li>Podłącz przewód zasilający do parownika elektronicznego. Zamknij niebieskie zaciski stożka nosowego i otwórz białe zaciski komory indukcyjnej, aby umożliwić przepływ powietrza przez komorę do kanistra z węglem drzewnym. Zdejmij czerwoną nasadkę powietrza otoczenia z lewej strony urządzenia, aby umożliwić przepływ powietrza.</li>
	<li>Pozwól systemowi rozgrzać się przez 5 minut przy 200 ml/min (niski przepływ) i 2% izofluranu. 
	UWAGA: Chociaż wybrano ustawienie stożka nosowego, niebieska linia stożka nosowego powinna pozostać zamknięta, a biała linia komory indukcyjnej powinna pozostać otwarta.</li>
	<li>Gdy system zostanie odpowiednio zrównoważony, należy oczyścić przewody, aby usunąć pozostały izofluran z komory.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wybierz opcję High Flow. Zakończ wszystkie przygotowania myszy (tj. depilację, miejscowe podawanie leków, aplikację maści do oczu itp.) przed umieszczeniem ciała zwierzęcia na wkładce. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona za pomocą metody odruchu szczypania palców u stóp.
	<ol>
		<li>Przy wyprostowanej nodze użyj paznokcia, aby mocno uszczypnąć palec u nogi, nie powodując uszkodzeń fizycznych. Jeśli mysz wykaże pozytywną reakcję na bodziec (np. cofnięcie nogi, drganie stopy itp.), kontynuuj podawanie środka znieczulającego w komorze, aż nie zaobserwuje się żadnej reakcji. Po odpowiednim znieczuleniu częstość oddechów myszy powinna zwolnić do ~55-65 oddechów na minutę18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy mysz jest w pełni znieczulona, ponownie wybierz opcję High Flow, aby zatrzymać podawanie izofluranu. Oczyść komorę przed otwarciem i wyreguluj zaciski (niebieski: otwarty; biały: zamknięty), aby dostarczyć izofluran przez stożek nosowy. Wybierz Low Flow, gdy stożek nosowy jest przymocowany do myszy, aby kontynuować podawanie izofluranu.</li>
	<li>Przewlecz rurkę izofluranu z dołączonym stożkiem nosowym przez narożny wspornik rurki na wkładce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5).</li>
</ol>
3. Umieszczenie myszy na wkładce do obrazowania przyżyciowego
<ol>
	<li>Podłącz płytę grzewczą do kontrolera (zawierającego dołączoną sondę analną), włącz zasilanie i pozwól płycie osiągnąć 36 °C (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
	<li>Wyjmij znieczuloną mysz z komory indukcyjnej i połóż ją na płycie grzewczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B i Rysunek 5A). Szybko przenieś się z komory do wkładki, aby zminimalizować czas aktywności myszy bez znieczulenia wziewnego.</li>
	<li>Przymocuj stożek nosowy do myszy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4B, C i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5). W razie potrzeby użyj taśmy, aby dodatkowo zabezpieczyć kąt i położenie stożka nosowego.</li>
	<li>Włóż sondę analną i wyreguluj temperaturę kontrolera, aż temperatura ciała myszy ustabilizuje się na poziomie ~36 °C (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A,B). Po prawidłowym ustawieniu myszy użyj plastikowej folii spożywczej, aby zatrzymać ciepło, jeśli to konieczne, aby dodatkowo utrzymać odpowiednią temperaturę ciała (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C).</li>
	<li>Ustaw mysz tak, aby głowa zrównywała się z krążkiem szkiełka nakrywkowego i unieruchamiaj ucho na środku szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą metalowego klipsa na ucho (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A,B) lub taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). 
	UWAGA: Docisk metalowego klipsa na ucho można regulować, poluzowując mocującą klips do wkładki. Można dodać metalową sprężynę, aby zwiększyć elastyczność dokręcania klipsów.
	<ol>
		<li>Aby zmienić położenie klipsa na ucho, odkręć kluczem imbusowym 2,5 mm i przenieś do miejsca dodatkowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B, C). Podczas ponownego montażu klipsa na ucho umieść klips na wkładce, a następnie podkładkę na górze. Użyj, aby bezpiecznie przymocować klips z niewielką siłą, aby go obrócić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj ustawienie obiektywu z do momentu, aż komórki znajdą się w ognisku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A,D). Ustaw parametry z-stack i time-lapse zgodnie z celami eksperymentu i rozpocznij akwizycję obrazu. 
	UWAGA: Jeśli zostanie osiągnięta prawidłowa konfiguracja, ucho myszy może być obrazowane przez co najmniej 3 kolejne godziny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A',D').
	<ol>
		<li>Po ustawieniu granic stosu z dostosuj moc lasera i wzmocnienie, aby upewnić się, że żadna płaszczyzna z nie jest przesycona, aby zminimalizować fotowybielanie. Określ parametry poklatkowe, korzystając z całkowitej grubości stosu z, numerów kroków (zalecane próbkowanie Nyquista) i przedziałów czasowych.</li>
		<li>Określ parametry obrazowania (przedziały czasowe, całkowity czas obrazowania itp.) przy użyciu wielu czynników, w tym żywotności zwierząt w znieczuleniu, fotowybielania/fototoksyczności wywołanej laserem oraz celu obrazowania na żywo (tj. dynamiki podziału komórki, interakcji komórka-komórka itp.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zakończenie obrazowania
<ol>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą z cyrkulacją wody i ustaw cykl ciągły i 35 °C na co najmniej 30 minut przed zakończeniem akwizycji obrazu.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania wybierz Low Flow w parowniku elektronicznym, aby zatrzymać podawanie izofluranu i przesuń mysz na poduszkę grzewczą do czasu rozpoczęcia ruchu.</li>
	<li>Po przebudzeniu przenieś mysz z powrotem do pojemnika transferowego, kontynuując utrzymywanie na poduszce grzewczej, aż do pełnego poruszania się. Konsekwentnie monitoruj mysz na poduszce grzewczej, aż zacznie reagować.</li>
	<li>Na parowniku elektronicznym kliknij Wybierz Menu > Kontrola znieczulenia > Puste. Wyjąć butelkę z izofluranem z systemu i ponownie nałożyć na butelkę nakrętkę producenta.</li>
	<li>Zmierz wagę butelki z izofluranem i kanistra na węgiel drzewny i wprowadź odważniki do dziennika. Gdy pojemnik na węgiel drzewny waży 50 g powyżej wartości pomiarowej, wyrzuć pojemnik i wymień go na nową jednostkę. Zwróć izofluran do skrytki.</li>
	<li>Wyjmij krążek szkiełka nakrywkowego i wytrzyj do czysta papierem do soczewek i roztworem do soczewek. Przechowuj prawidłowo, aby uniknąć zadrapań do ponownego użycia.</li>
	<li>Wyjmij rurkę znieczulającą ze wspornika wkładki i odkręć wkładkę od stolika mikroskopu.</li>
</ol>

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy prezentujemy nowe narzędzie, które ułatwia stabilne, długoterminowe obrazowanie przyżyciowe nienaruszonego nabłonka skóry myszy na odwróconych mikroskopach konfokalnych. Ten wynalazek jest wykonany z PLA, który jest najpowszechniejszym i najtańszym materiałem do druku 3D; wszystkie wewnętrzne koszty druku 3D dla tej wkładki wynoszą < 5 USD. Dwa oddzielne elementy wkładki (Rysunek 1, Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2) można łatwo ...

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które pozwala na monitorowanie zachowań komórek w ich niezakłóconym środowisku in vivo. Ta unikalna metoda dostarczyła kluczowych informacji na temat wewnętrznego funkcjonowania złożonych układów narządów ssaków, w tym płuc1, brain2, liver3, gruczoł sutkowy4, intestine5 i skin6. Co więcej, podejście to ujawniło zmiany w zachowaniu komórek podczas rozwoju nowotworu7, gojenie się ran8,9, zapalenie10 i inne różne patologie in situ. W tym badaniu koncentrujemy się na zwiększeniu dostępności mikroskopii przyżyciowej do obrazowania żywej dynamiki nabłonka i zrębu w nienaruszonej skórze myszy. Zrozumienie zachowań komórek w skórze ssaków ma duże znaczenie kliniczne ze względu na niezwykłą zdolność regeneracyjną i rakotwórczą tej tkanki.
Obrazowanie przyżyciowe u myszy zostało wykonane głównie przy użyciu pionowych mikroskopów wielofotonowych ze względu na ich zdolność do dostarczania obrazowania w wysokiej rozdzielczości na głębokości tkanek >100 μm11,12. Niemniej jednak instrumentom tym brakuje wszechstronności i bardziej ogólnej dostępności odwróconych mikroskopów konfokalnych, które są bardziej przyjazne dla użytkownika i opłacalne, zapewniają możliwość obrazowania hodowanych komórek, nie wymagają całkowitej ciemności podczas akwizycji obrazu i są ogólnie bezpieczniejsze, wśród innych godnych uwagi zalet13,14. W tym badaniu prezentujemy nowe narzędzie, które znacznie zwiększa dostępność obrazowania przyżyciowego poprzez dostosowanie tego podejścia do odwróconych mikroskopów konfokalnych.
Tutaj prezentujemy wydrukowany w 3D niestandardowy projekt wkładki scenicznej, który zawiera kilka kluczowych funkcji ułatwiających stabilne, długoterminowe obrazowanie przyżyciowe skóry uszu myszy pod odwróconym mikroskopem konfokalnym (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, oraz Rysunek 5). Te specjalistyczne funkcje obejmują przesunięty otwór obiektywu, który pozwala na całkowite ułożenie ciała dorosłej myszy całkowicie płasko podczas obrazowania. Minimalizuje to zakłócenia wibracyjne ruchów ciała myszy podczas obrazowania i eliminuje potrzebę podawania ketaminy i ksylazyny w celu stłumienia oddechu, co często jest praktyką połączoną z obrazowaniem przyżyciowym6. Ponadto wsporniki narożne na wkładce prawidłowo ustawiają stożek nosowy izofluranu, aby wyrównał się z twarzą myszy, metalowy klips na ucho unieruchamia ucho myszy do specjalnie zbudowanego dysku nakrywkowego, a opcjonalna odłączana płytka grzewcza biofeedback w zamkniętej pętli leży równo z wkładką, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas długich sesji obrazowania. Niestandardowy krążek szkiełka nakrywkowego, który zapewnia płaską powierzchnię niezbędną do płaskiego ułożenia głowy i ucha myszy, został wygenerowany w warsztacie mechanicznym poprzez usunięcie ścianek ogólnego naczynia do hodowli komórkowych zawierającego szkiełko nakrywkowe. Zastosowanie soczewki zanurzeniowej z 40-krotnym olejkiem silikonowym (apertura numeryczna 1,25 [N.A.], odległość robocza 0,3 mm) w połączeniu z dyskiem nakrywkowym i niestandardową wkładką sceniczną zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości >50 μm w głąb skóry właściwej ucha.
Aby przetestować funkcjonalność tej nowej wkładki do stolika mikroskopu z odwróconym mikroskopem, przechwyciliśmy stosy z obejmujące wszystkie warstwy nabłonka naskórka w ciągu 3 godzin w uchu żywego transgenicznego K14-H2B-mCherry15 dorosłych myszy (jądra nabłonkowe w tej linii myszy zawierają czerwoną fluorescencyjną etykietę) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A-A'). Uchwyciliśmy również stosy z obejmujące kilka warstw fibroblastów w skórze właściwej w ciągu 3-godzinnego kursu czasowego w uchu żywego transgenicznego Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 dorosła mysz (jądra fibroblastów w tej linii myszy zawierają zieloną fluorescencyjną etykietę po indukcji doksycykliny) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B-D'). Nasze dane o wysokiej rozdzielczości wykazują stałą stabilność dzięki brakowi dryftu w płaszczyznach x, y i z, udowadniając w ten sposób skuteczność tego nowego narzędzia do obrazowania przyżyciowego do stosowania w mikroskopach odwróconych. Co ważne, wymiary tej wydrukowanej w 3D wkładki scenicznej można dostosować, zgodnie z opisem w Pliku Uzupełniającym 1, Pliku Uzupełniającym 2 i Pliku Uzupełniającym 3, aby pasowały do każdego mikroskopu odwróconego, a położenie otworu obiektywu można przesunąć w alternatywne miejsca we wkładce, aby lepiej dopasować się do obrazowania określonej tkanki i / lub modelu zwierzęcego będącego przedmiotem zainteresowania. Wynalazek ten może zatem umożliwić poszczególnym laboratoriom lub badaczom z dostępem konfokalnym do podstawowej placówki dostosowanie tego narzędzia do ich unikalnych potrzeb w zakresie obrazowania przyżyciowego, usprawniając w ten sposób ocenę różnorodnej biologii komórki in vivo.

<table><tbody><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Qudi Tech</td><td>i-Fast</td><td>Wydruki 3D przy użyciu materiału PLA</td></tr><tr><td>40x 1,25NA silikonowa soczewka obiektywowa</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td></td> Wacik z bawełnianą końcówką Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>Aplikacja kremu/maści</td></tr><tr><td>Hyklat doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Indukuje znakowanie GFP jąder fibroblastów w Pdgfra-rtTA; Myszy pTRE-H2B-GFP</td></tr><tr><td>Śrubokręt płaski (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Wkładka Affiix do stolika mikroskopu</td></tr><tr><td>z płaskim x 4 (#6-32)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wkładka śrubowa do stolika mikroskopu</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli szkła</td><td>chemglass Nauki biologiczne</td><td>CLS-1811-002</td><td>Zmodyfikowane przez usunięcie ścianek naczynia do użycia jako krążek nakrywkowy kompatybilny z wkładką na żywo; Dysk o szerokości 35 mm zawiera szklane szkiełko nakrywkowe o szerokości 20 mm; ścianki naczynia były usunięty przez warsztat mechaniczny</td></tr><tr><td>Kontroler płyty grzewczej</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>Regulator temperatury zwierząt - niskie napięcie; Nasadka sondy analnej do monitorowania temperatury ciała myszy</td></tr><tr><td>Klucz imbusowy (1,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Do regulacji dociskowych M3</td></tr><tr><td>Klucz imbusowy (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Dostosuj napięcie metalowego klipsa na ucho</td></tr><tr><td>Wkładka</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do obrazowania przyżyciowegoIsoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td> Taśma do etykietowania <td>znieczulenia dla myszy</td></tr><tr><td>(lub taśma klejąca)</td><td>VWR</td><td>10127-458</td><td>Alternatywa dla metalowego klipsa na ucho do unieruchomienia ucha do szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Metalowe</td><td></td><td></td> zapięcie <td>używane jako klips na ucho</td></tr><tr><td>Mysz: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>RRID: IMSR_JAX:034459</td><td>Specyficzny dla fibrroblastu promotor napędzający indukowaną doksycykliną ekspresję rtTA</td></tr><tr><td>Mysz: K14-H2BPAmCherry</td><td>Dzięki uprzejmości dr Valentiny Greco z Uniwersytetu</td><td></td> Yale <td>Etykietuje jądra komórek nabłonka naskórka za pomocą mCherry; określane w tekście jako "K14-H2B-mCherry"</td></tr><tr><td>Mysz: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>RRID: IMSR_JAX:005104</td><td>&nbsp; Znakuje jądra fibroblastów za pomocą GFP w połączeniu z Pdgfra-rtTA i indukowane doksycykliną</td></tr><tr><td>Uniwersalna folia uszczelniająca</td><td>Glad</td><td></td><td>Enhance mouse warmth</td></tr><tr><td>Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>Smar do oczu</td></tr><tr><td>ustalające x 3 (M3; 6 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>Nasadka do modułu płyty grzewczej</td></tr><tr><td>Silikonowy olejek</td><td></td><td></td> immersyjny <td>Nakładany na 40x silikon obiektyw</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza dla małych zwierząt</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>Dostarcza ciepło do zwierzęcia</td></tr><tr><td>Elektroniczny waporyzator Somnoflow o niskim przepływie</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td> Smar próżniowy <td>do znieczulenia myszy</td></tr><tr><td>Flinn</td><td>Scientific</td><td>AP1095</td><td>Uszczelki krążka nakrywkowego do włożenia</td></tr><tr>depilacji<td>Veet</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza z cyrkulacją wody</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td><td>do obrazowania po ożywieniu myszy</td></tr></tbody></table>

uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Zrozumienie normalnych i nieprawidłowych zachowań komórek in vivo jest niezbędne do opracowania klinicznych interwencji udaremniających inicjację i postęp choroby. Dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie metod obrazowania, które ułatwiają obserwację dynamiki komórek in situ, gdzie struktura i skład tkanek pozostają niezakłócone. Naskórek jest najbardziej zewnętrzną barierą organizmu, a także źródłem najczęstszych nowotworów u ludzi, a mianowicie raków skóry. Dostępność tkanki skórnej stwarza wyjątkową okazję do monitorowania zachowań komórek nabłonka i skóry właściwej u nienaruszonych zwierząt przy użyciu nieinwazyjnej mikroskopii przyżyciowej. Niemniej jednak to wyrafinowane podejście do obrazowania zostało osiągnięte przede wszystkim przy użyciu pionowych mikroskopów wielofotonowych, które stanowią istotną barierę wejścia dla większości badaczy. Badanie to przedstawia specjalnie zaprojektowaną, wydrukowaną w 3D wkładkę stolika mikroskopu, odpowiednią do stosowania z odwróconymi mikroskopami konfokalnymi, usprawniając długoterminowe przyżyciowe obrazowanie skóry ucha u żywych myszy transgenicznych. Wierzymy, że ten wszechstronny wynalazek, który może być dostosowany do marki i wybranego modelu mikroskopu odwróconego oraz przystosowany do obrazowania dodatkowych układów narządów, okaże się nieoceniony dla szerszej społeczności naukowej, znacznie zwiększając dostępność mikroskopii przyżyciowej. Ten postęp technologiczny ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat dynamiki żywych komórek w kontekście normalnym i chorobowym.

Prawidłowy montaż wkładki do obrazowania żywych tkanek w odwróconym mikroskopie konfokalnym oraz odpowiednia orientacja transgenicznej myszy na wkładce są weryfikowane poprzez pozyskanie stosów z-stack z fluorescencyjnie znakowanej, żywej tkanki ucha w czasie ≥1 h, przy minimalnych dowodach na dryf w osiach x, y i z. Obrazy powinny być rejestrowane w stałych odstępach czasu (czas odstępu zależy od problemu biologicznego, siły sygnału fluorescencyjnego itp.), aby można było śledzić dynamikę komórek i dryf obrazu w czasie....

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Opracowaliśmy narzędzie do wykonywania obrazowania przyżyciowego na żywych myszach przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Dzięki temu możemy śledzić dynamikę komórek skóry w trakcie homeostazy i porównywać zachowania komórek podczas początku i postępu choroby. Mikroskopia wielofotonowa jest podstawowym podejściem stosowanym w celu uzyskania śledzenia komórek w trybie przyżyciowym.Jednak wady tych mikroskopów obejmują ograniczoną wszechstronność obrazowania w codziennym życiu, wysokie koszty i złożoność techniczną. Nasze nowe narzędzie umożliwia wykorzystanie wszechstronnych odwróconych mikroskopów konfokalnych do obrazowania przyżyciowego in vivo. Modyfikując plik projektowy, wymiary wkładki stolika można dostosować tak, aby pasowały do dowolnej marki mikroskopu odwróconego.Otwór na obiektyw można zmienić jego rozmiar i położenie, aby dopasować go do dowolnego modelu zwierzęcego i tkanki. Aby rozpocząć instalację wydrukowanej w 3D wkładki do obrazowania na żywo na odwróconym stoliku mikroskopu, ostrożnie umieść wkładkę w dużym rowku stolika mikroskopu. Za pomocą zabezpiecz każdy róg wkładki.Wsuń płytę grzewczą do bocznego otworu wkładki w orientacji wtyczki do dołu, tak aby płyta leżała na dolnych rowkach wkładki z portem wtyczki pod spodem stage. Dopasuj rowkowany okrągły otwór we wkładce do obiektywu zanurzeniowego z olejkiem silikonowym 40X i nałóż olej silikonowy na środek obiektywu. Następnie za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość smaru próżniowego wzdłuż rowkowanego okrągłego otworu.Połóż krążek szkiełka nakrywkowego na górze otworu, aby uszczelnić go na wkładce. Na koniec podnieś obiektyw 40X, aż ledwo dotknie dna szklanego szkiełka nakrywkowego. Przed umieszczeniem znieczulonej myszy na wkładce do obrazowania na żywo zainstalowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, należy przewlec rurkę izofluranu z dołączonym stożkiem nosowym przez narożny wspornik rurki na wkładce.Po wpięciu płyty grzewczej do sterownika zawierającego dołączoną sondę termometru analnego i włączeniu jej, przenieś znieczuloną mysz z komory indukcyjnej na płytę grzewczą. Następnie przymocuj stożek nosowy do myszy. Włóż sondę analną do zwierzęcia i wyreguluj kontroler, aby utrzymać stabilną temperaturę ciała około 36 stopni Celsjusza.Przykryj prawidłowo ustawioną mysz plastikową folią spożywczą, aby zatrzymać ciepło ciała i podnieść temperaturę ciała. Ustaw mysz tak, aby jej głowa zrównywała się z krążkiem szkiełka nakrywkowego i unieruchamij ucho na środku szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą metalowego klipsa na ucho lub taśmy. Po zakończeniu obrazowania wybierz opcję niskiego przepływu w parowniku elektronicznym, aby zaprzestać dostarczania izofluranu.Przenieś mysz na poduszkę grzewczą, aż stanie się ruchoma. Po wyjęciu szkiełka nakrywkowego należy go wytrzeć do czysta papierem do soczewek i roztworem do soczewek. Przechowuj go prawidłowo, aby uniknąć zadrapań do ponownego użycia.Następnie odłącz rurkę znieczulenia od wspornika wkładki i odkręć wkładkę od stolika mikroskopu. Nabyty stos Z znakowanej fluorescencyjnie żywej tkanki ucha myszy wykazał minimalny dryf w osiach x, y i z w czasie, co potwierdza niestandardową drukowaną w 3D wkładkę do obrazowania na żywo. Punkty czasowe z trzygodzinnego filmu poklatkowego komórek naskórka ucha myszy mCherry z dodatnim wynikiem u dorosłego samca myszy ujawniły pojedynczą płaszczyznę Z, która pozostawała ostra przez dłuższy czas.Podobne obserwacje poczyniono na podstawie innego trzygodzinnego filmu poklatkowego przedstawiającego fibroblasty skóry ucha z dodatnim wynikiem GFP dorosłej samicy myszy.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Ten film demonstruje wizualizację śródnabłonkowych limfocytów γδ (IELs) u myszy transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zabieg chirurgiczny polega na wytworzeniu linii perforacji i wykonaniu podłużnego nacięcia w celu odsłonięcia błony śluzowej i kosmków jelitowych. Transgeniczne myszy wyrażają białka reporterowe wyłącznie w γδ IELs, umożliwiając ich śledzenie. Obrazowanie przyżyciowe rejestruje dynamiczny ruch IEL γδ znakowanych zieloną fluorescencją wzdłuż błony podstawnej komórki...

Wizualizacja śródnabłonkowych limfocytów śródnabłonkowych gamma delta

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Poznaj uproszczoną metodę obrazowania przyżyciowego skóry myszy przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z wkładkami drukowanymi 3D. Technika umożliwia długoterminowe śledzenie dynamiki komórek nabłonkowych w warunkach homeostazy i choroby.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym (Wideo) | JoVE Journal

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Przeglądaj więcej filmów