Name: Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę immobilizacji pionowej do analizy dynamiki białek podziału komórkowego u sinic nitkowatych Anabaena. Technika umożliwia szczegółowe obserwacje struktury Z-ring w płaszczyźnie XY przy użyciu mikroskopii poklatkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Krajowym Stypendiom Doktoranckim (ANID 21211333; 21191389) za finansowanie. Grant Fondecyt 1161232.
Ta praca była wspierana przez de Advanced Microscopy Facility UMA UC.

1. Rozważania i wybór modelu komórkowego
UWAGA: Sinice mają silną autofluorescencję ze względu na obecność pigmentów fotosyntetycznych. Sygnał ten znajduje się w czerwonej części widma, dlatego białka fluorescencyjne odpowiednie do obrazowania w sinicach to te, które są daleko od emisji czerwonej. Na przykład GFP, YFP, Venus, Turkus i BFP.
<ol>
	<li>Należy wybrać składnik diosomowy obecny w docelowym nitkowatym szczepie sinic. Do eksperymentów konieczne jest skonstruowanie nitkowatego mutanta sinicowego, który wyraża wybrany składnik diwisomowy połączony z białkiem fluorescencyjnym. W tym protokole jako przykład mutant Anabaena sp., który wyraża FstZ-sfGFP. Szczep ten uzyskano przez krzyżowanie trójrodzicielskie z E. coli11.</li>
	<li>Sprawdź poziom segregacji mutanta, który będzie używany. W tym przykładzie segregację określono przez amplifikację PCR docelowego genu. Mutant FtsZ-sfGFP zastosowany w tym protokole jest w pełni segregowanym szczepem, który nie ma genu ftsZ typu dzikiego.</li>
</ol>
2. Warunki wzrostu
<ol>
	<li>Wykonać nową subkulturę mutanta, używając 10 ml kultury w fazie stacjonarnej (hodowanej przez około 14 dni w ciągłym świetle, w temperaturze 25°C, dla Anabaena sp.) i dodając do 90 ml pożywki BG11 uzupełnionej antybiotykami (spektynomycyna i streptomycyna 10 μl ml-1 dla mutanta FtsZ-sfGFP).</li>
	<li>Hoduj nową kulturę komórkową w stałym świetle i w optymalnej temperaturze, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej. Mutant FtsZ-sfGFP Anabaena sp. jest hodowany w temperaturze 25 °C przez 7 dni przed przygotowaniem próbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki w matrycy agarozowej
<ol>
	<li>Weź 2 ml homogenizowanej kultury wzrostu.</li>
	<li>Wirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W międzyczasie w kolbie o pojemności 50 ml podgrzej 30 ml 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w płynnym podłożu BG11. Użyj kuchenki mikrofalowej ustawionej na średni poziom mocy i sprawdzaj roztwór co 15 sekund, aż do całkowitego rozpuszczenia. Odstawić do ostygnięcia do temperatury 37 °C. 
	UWAGA: Roztwór agarozy należy sterylizować w autoklawie, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania należy wyrzucić 1,9 ml supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, pipetując co najmniej trzy razy w górę i w dół.</li>
	<li>Wymieszać zawieszone komórki z 900 μl 3% roztworu agarozy, pipetując w górę i w dół co najmniej trzy razy. 
	UWAGA: Roztwór agarozy musi być płynny, ale nie za gorący, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Następny krok należy wykonać szybko i zanim roztwór agarozy utworzy żelową konsystencję =.</li>
	<li>Ostrożnie odessać matrycę agarozy do strzykawki o pojemności 1 ml. Ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas zasysania próbki za pomocą strzykawki. 
	UWAGA: Przed tym krokiem upewnij się, że końcówka strzykawki jest przecięta, aby wyeliminować wąski otwór wejściowy.</li>
	<li>Pozostawić mieszaninę próbki i agarozy do zestalenia, umieszczając strzykawkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej na 2 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć matrycę agarozową za pomocą tłoka i umieścić ją na czystej i płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Zestaloną próbkę pokroić w plastry w zakresie grubości 0,5 - 1 mm, zachowując integralność matrycy. 
	UWAGA: Aby uzyskać lepsze rezultaty, przetnij matrycę agarozy za pomocą skalpela lub cienkich żyletek.</li>
	<li>Ułóż plastry obok siebie na szkiełku nakrywkowym. Liczba krążków na szkiełku nakrywkowym zależy od jego wymiarów. 
	UWAGA: Do mikroskopii poklatkowej zaleca się stosowanie komory komórkowej przeznaczonej do analizy mikroskopowej (np. komory Attofluor lub Chamlide Magnetic). Komory te umożliwiają pobranie próbki bez odwodnienia. W tym przykładzie próbki są przygotowywane na zaokrąglonych szkiełkach nakrywkowych (25 mm) przy użyciu komory Attofluor.</li>
	<li>Dodać 2 ml stopionego 3% roztworu agarozy do próbki umieszczonej w komorze, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	<li>Poczekaj, aż roztwór agarozy całkowicie zestali się, aby utworzyć żel.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Standaryzacja parametrów w celu wizualizacji białka fluorescencyjnego będącego przedmiotem zainteresowania w zmutowanym szczepie w mikroskopie konfokalnym. Upewnij się, że mikroskop może wykryć zarówno autofluorescencję, jak i wybrany marker fluorescencyjny.</li>
	<li>Wizualizuj próbkę w konformacji jasnego pola z maksymalnym powiększeniem i wyszukaj pionowo zorientowany filament, jak pokazano na Rysunek 1.</li>
	<li>Znajdź interesujące Cię miejsce podziału za pomocą wstępnego skanowania przy użyciu sygnału autofluorescencji wzdłuż płaszczyzny Z.</li>
	<li>Wykorzystaj parametry markera białka fluorescencyjnego, aby zobrazować sygnał białka będącego przedmiotem zainteresowania w miejscu podziału.</li>
	<li>Wykonuj eksperymenty poklatkowe zgodnie z modelem biologicznym i białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład, w tym przypadku przeprowadzono eksperymenty poklatkowe trwające 10 s na 50 s, aby zarejestrować dynamikę FtsZ wzdłuż pierścienia Z w Anabaena sp. (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Löwe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li>
<li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ%2C+a+prokaryotic+homolog+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin.</a> Cell. 80 (3), 367-370 (1995).</li>
<li>Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FtsZ+C-terminal+variable+%28+CTV+%29+region+in+Z-ring+assembly+and+interaction+with+the+Z-ring+stabilizer+ZapD+in+E%5BTitle%5D)+AND+%22coli+cytokinesis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E.</a> coli cytokinesis. , 1-24 (2016).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+dynamics+of+divisome+proteins+and+PBP2x%3AFtsW+in+cells+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).</li>
<li>Bisson-Filho, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+by+FtsZ+filaments+drives+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division.</a> Science. 355 (6326), 739-743 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activity-coupled+treadmilling+of+the+bacterial+tubulin+FtsZ+organizes+septal+cell+wall+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis.</a> Science. 355 (6326), 744-747 (2017).</li>
<li>Whitley, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+treadmilling+is+essential+for+Z-ring+condensation+and+septal+constriction+initiation+in+Bacillus+subtilis+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division.</a> Nature Communications. 12 (1), (2021).</li>
<li>Mazón, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LexA-binding+sequences+in+Gram-positive+and+cyanobacteria+are+closely+related%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).</li>
<li>Mandakovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDiv%2C+a+conserved+and+novel+filamentous+cyanobacterial+cell+division+protein+involved+in+septum+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).</li>
<li>Camargo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZipN+is+an+essential+FtsZ+membrane+tether+and+contributes+to+the+septal+localization+of+SepJ+in+the+filamentous+cyanobacterium+Anabaena%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Thiel, T., Peter Wolk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugal+Transfer+of+Plasmids+to+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+An+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

Nie ma konfliktu interesów.

Badanie dynamiki białek divisome'owych jest bez wątpienia wyzwaniem. Szczególnie w przypadku sinic nitkowatych jednym z wyzwań jest wizualizacja pierścienia Z w płaszczyźnie poziomej, dla której komórki muszą być zorientowane pionowo. Opisana przez nas metoda pozwala na pozycjonowanie pierścienia Z w płaszczyźnie XY w celu przeprowadzenia różnych analiz. Jest to pierwsza prosta metoda dla sinic nitkowatych, która pozwala na pełną wizualizację pierścienia Z. 
Chociaż protokół ten jest prosty i ...

Podział komórek bakteryjnych to proces, w którym komórka macierzysta generuje dwie komórki potomne, w większości przypadków za pomocą mechanizmu znanego jako rozszczepienie binarne. Jednym z najwcześniejszych zdarzeń w procesie septacji jest lokalizacja FtsZ w środku komórki1. To białko, które jest strukturalnie homologiczne do tubuliny2, jest konserwatywne i szeroko rozpowszechnione u większości bakterii, a jego polimeryzacja generuje strukturę kurczliwą znaną jako Z-ring3. Pierścień ten służy jako rusztowanie dla innych białek podziałowych i razem tworzą maszynerię molekularną zwaną diwsomem. Kilka badań wykazało, że pierścień Z jest bardzo dynamiczny i że protofilamenty FtsZ poruszają się podczas bieżni4,5,6. Aby zbadać pierścień Z w eksperymentach poklatkowych, zaleca się zarejestrowanie miejsca podziału w płaszczyźnie XY w celu uzyskania lepszej rozdzielczości i szybkiego próbkowania. Aby to osiągnąć, konieczne jest opracowanie metod pionowej immobilizacji komórek, które zwykle obejmują nanowytwarzanie pułapek na komórki z mikrootworami i złożonych urządzeń mikroprzepływowych7.
Cyjanobakterie to mikroorganizmy fotosyntetyzujące, które są klasyfikowane jako Gram-ujemne ze względu na ich morfologię komórkową. Jednak filogenetycznie bliżej im do bakterii Gram-dodatnich8. Organizmy te mają geny podziału komórek, które są powszechne u bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, ale ich divisom zawiera również unikalne elementy9. Anabaena sp. PCC 7120 (zwana dalej Anabaena sp.) jest sinicą nitkowatą z jedną płaszczyzną podziału i stanowi model do badania podziału komórek u sinic wielokomórkowych. W tym szczepie udało się określić położenie FtsZ w środku komórek10. Niemniej jednak nie ma badań pokazujących dynamikę in vivo FtsZ w tym modelu. W naszym laboratorium, poprzez kojarzenie trirodzicielskie i rekombinację homologiczną, uzyskaliśmy całkowicie wyseparowany mutant Anabaena sp., który wykazuje ekspresję białka FtsZ połączonego z sfGFP, które zastąpiło cały endogenny gen ftsZ. Opracowaliśmy szybką i prostą metodę immobilizacji komórek, która faworyzuje pionową orientację włókien zmutowanego szczepu do eksperymentów poklatkowych w celu wizualizacji białek podziałowych w nitkowatych cyjanobakteriach. Ta metoda nie wymaga urządzeń mikroprzepływowych, które mogą być drogie i trudne do opracowania. Jako przykład użyliśmy tego protokołu do wizualizacji pierścienia Z w mutancie FtsZ-sfGFP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.</td><td>-</td><td>Jednorazowa medyczna plastikowa strzykawka z igłą o pojemności 1 ml zwykle używana do pompowania płynu lub płynu do wstrzykiwań, w tym eksperymencie służy do zasysania próbki i polimeryzacji.</td></tr><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A7816</td><td>Kamera komórkowa Attofluor to trwały i praktyczny uchwyt na szkiełko nakrywkowe przeznaczony do oglądania żywych próbek komórek w mikroskopach pionowych lub odwróconych.</td></tr><tr><td>Termocykler Axygen MaxyGene II z blokiem 96 dołków</td><td>CORNING</td><td>THERM-1001</td><td>Nowy termocykler MaxyGene II zwiększył prędkość i zaawansowane funkcje, zapewniając najwyższą wydajność, której oczekujesz od produktów marki Axygen. Unikalne, elastyczne programowanie. Szybki czas pracy. Ulepszony przepływ pracy w porównaniu z tradycyjnymi cyklerami gradientowymi. Prędkości narastania do 5&deg; C/sek. Regulowana podgrzewana pokrywa mieści paski, rurki i mikropłytki.</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe Fisherbrand: Circles</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12-546-2P</td><td>Wykonane z najlepszego optycznego szkła borokrzemianowego, o jednolitej grubości i rozmiarze. Okrągły kształt. Odporny na korozję.&nbsp;</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Promega</td><td>V3841</td><td>Agaroza, niska temperatura topnienia, klasa analityczna, jest idealna do zastosowań, które wymagają odzyskania nienaruszonych fragmentów DNA po elektroforezie żelowej.</td></tr><tr><td>Mikroskop LSM 880 firmy Zeiss Airyscan</td><td>Mikroskop</td><td></td> <td>Zeiss-Mikroskop Zeiss Airyscan LSM 880 to laserowy skaningowy mikroskop ogniskowy, który może uzyskiwać obrazy w granicach rozdzielczości (rozdzielczość boczna ~ 120 nm i rozdzielczość osiowa ~ 350 nm). Detektory są bardzo czułe, co umożliwia pozyskiwanie obrazów w superrozdzielczości z dużą prędkością.</td></tr><tr><td>Mikrocentr i iacute; fuga Fresco 17</td><td>ThermoFischer Scientific 75002402</td><td></td><td>Przyspiesz rutynowe procesy przygotowywania próbek do 17 000 i razy; g dzięki naszej standardowej mikrowirówce, dostępnej z chłodzeniem. Te mikrowirówki oferują wydajność, wszechstronność, bezpieczeństwo i wygodę w łatwym w użyciu, kompaktowym przyrządzie laboratoryjnym.</td></tr><tr><td>Mikroskop poklatkowy Nikon</td><td>Nikon-Laserowy</td><td></td> <td>skaningowy mikroskop konfokalny Nikon C2 jest idealnym mikroskopem do długotrwałego timelapse, ponieważ dzięki komorze inkubacyjnej możliwe jest utrzymanie próbek w optymalnych warunkach przez ponad 8 godzin.</td></tr><tr><td>Cienkie żyletki Schick Super Chromium</td><td></td><td>SKU: 401146</td><td>&nbsp; Cienkie żyletki służą do cięcia matrycy agarozowej, co pozwala nam uzyskać krążki z próbką przy zachowaniu integralności matrycy.</td></tr></tbody></table>

metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Vertical Immobilization Method for Time-Lapse Microscopy Analysis in Filamentous Cyanobacteria

Głównym wydarzeniem w podziale komórek bakteryjnych jest proces septacji, w którym kluczowym elementem jest białko FtsZ. FtsZ polimeryzuje, tworząc strukturę podobną do pierścienia (pierścień Z) w środku komórki, która służy jako rusztowanie dla innych białek podziałowych. Mikroskopia superrozdzielcza w modelach bakteryjnych Escherichia coli i Bacillus subtilis wykazała, że pierścień Z jest nieciągły, podczas gdy badania obrazowania żywych komórek wykazały, że FtsZ porusza się wzdłuż pierścienia za pomocą mechanizmu znanego jako bieżnia. Aby zbadać dynamikę FtsZ in vivo, konieczne jest specjalne umieszczenie komórek w pozycji pionowej do zobrazowania całej struktury pierścienia w płaszczyźnie XY. W przypadku obrazowania FtsZ u wielokomórkowych sinic, takich jak Anabaena sp. PCC7120, utrzymanie włókien w pozycji pionowej jest trudne ze względu na rozmiar komórek i długość włókien. W tym artykule opisujemy metodę, która pozwala na pionową immobilizację filamentów Anabaena sp. PCC 7120 za pomocą agarozy o niskiej temperaturze topnienia i strzykawek, w celu zarejestrowania pierścienia Z w mutancie wykazującym ekspresję białka fuzyjnego FtsZ-sfGFP. Metoda ta jest szybkim i niedrogim sposobem rejestrowania dynamiki białka w miejscu podziału za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja pierścienia Z w Anabaena sp. z wykorzystaniem metody immobilizacji pionowej 
Aby badać dynamikę komponentów pierścienia Z w bakteriach, konieczne jest pozyskanie obrazów komórek zorientowanych pionowo. W tej pozycji możliwe jest zwizualizowanie pierścienia Z oraz głównych białek dywisomu w celu monitorowania dynamiki białek za pomocą mikroskopii time-lapse. Klasyczne przygotowanie próbek bakterii nie sprawdza się w przypadku nitkowatych sinic. W przypadku Anabaena sp. ni...

Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.

Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

A main event in bacterial cell division is the septation process, where the protein FtsZ is the key element. FtsZ polymerizes forming a ring-like ...

U bakterii badanie dynamiki białek podziału komórkowego wymaga orientacji przestrzennej komórek. Na przykład w przypadku pierścienia Z, głównego składnika podziału komórek bakteryjnych, orientacja pionowa ma fundamentalne znaczenie dla zapisania całej struktury w płaszczyźnie XY. W tym filmie opracowujemy metodę osiągania tej szczególnej orientacji u nitkowatych sinic Anabaena.Anabaena jest wielokomórkowym organizmem fotosyntetyzującym i dzieli z innymi bakteriami zdolność do wykorzystywania atmosferycznego diazotu jako źródła azotu. W przypadku braku tego pierwiastka Anabaena różnicuje komórki wyspecjalizowane w wiązaniu azotu. Dlatego stanowi doskonały model do analizy związku między podziałem komórkowym a wielokomórkowością.Najpierw wybierz składnik diosomowy obecny w docelowym nitkowatym szczepie sinic. Do eksperymentu konieczne jest skonstruowanie nitkowatego mutanta sinicowego, który wyraża wybrany składnik diwisomowy połączony z białkiem fluorescencyjnym. W tym protokole używamy jako przykładu mutanta Anabaena, który wyraża FtsZ połączony z GFP.Najpierw stwórz nową subkulturę mutanta z 10 mililitrami kultury w fazie stacjonarnej i 90 mililitrami płynnej pożywki. Następnie hoduj nową hodowlę komórkową w stałym świetle i w optymalnej temperaturze, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej. W naszym przykładzie mutant był hodowany w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni.Teraz weź dwa mililitry kultury wzrostu i umieść ją w probówce wirówkowej. Wirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu sprawdź, czy wszystkie komórki znajdują się na dnie probówki.Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć ponownego zawieszenia. Podgrzej 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w kuchence mikrofalowej. Ważne jest, aby robić to w krótkich odstępach czasu i sprawdzać roztwór, aż będzie całkowicie płynny.Po stopieniu odstawić do wystygnięcia. Wziąć probówki wirówkowe z poprzedniego kroku, wyrzucić 1,9 mililitra supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, pipetując co najmniej trzy razy w górę i w dół. W swoim miejscu pracy umieść probówkę z komórkami, stopiony roztwór agarozy, jednomililitrową strzykawkę wyciętą w końcówce oraz skalpel z nowym i czystym ostrzem.Następnie wymieszać komórki z 900 mikrolitrami 3% roztworu agarozy, pipetując co najmniej trzy razy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że roztwór agarozy nie jest zbyt gorący, ale pozostaje płynny. Dzięki temu unikamy uszkodzenia komórek podczas tego procesu.Następny krok należy wykonać szybko i zanim roztwór agarozy się zżeluje. Ostrożnie zassaj matrycę agarozy do jednomililitrowej strzykawki. Ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas zasysania próbki.Następnie należy inkubować próbkę, umieszczając strzykawkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie usunąć matrycę z komórkami za pomocą tłoka na czystej i płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela pokrój próbkę żelu na jak najcieńsze plasterki, zachowując integralność matrycy.Następnie umieść próbki w odpowiednim szkiełku nakrywkowym, obok siebie. Jak pokazano na filmie, na tym etapie możesz użyć końcówki, aby pomóc w procesie obsługi próbki. W przypadku eksperymentów poklatkowych zaleca się użycie komory komórkowej przeznaczonej do analizy mikroskopowej.W tym przypadku używamy okrągłych szkiełek nakrywkowych, które pasują do tego typu komór, jak widać na filmie. Na koniec, aby zapobiec odwodnieniu próbki, dodaj dodatkową objętość stopionego 3% roztworu agarozy do wnętrza komory. Przed obrazowaniem poczekaj, aż agaroza zostanie całkowicie zżelowana.Teraz umieść komorę z komórkami w mikroskopie w celu obrazowania. Zaleca się korzystanie ze sprzętu z kontrolą temperatury i wilgotności. Wizualizuj próbkę w jasnym polu z maksymalnym powiększeniem i wyszukaj włókno zorientowane pionowo.Interesujące Cię miejsce podziału można znaleźć za pomocą wstępnego skanowania za pomocą sygnału autofluorescencji wzdłuż płaszczyzny Z. W ten sposób wykorzystaj parametry swojego fluorescencyjnego markera białkowego, aby zwizualizować sygnał interesującego Cię białka w miejscu podziału. Teraz możesz wykonywać eksperymenty poklatkowe zgodnie z modelem biologicznym i białkiem, które Cię interesuje.W tym przypadku możemy zobaczyć całą strukturę pierścienia Z w mutancie FtsZ-GFP, w płaszczyźnie XY. Dzięki naszej metodzie byliśmy w stanie zarejestrować dynamikę tych pierścieni w długim okresie czasu. Wreszcie, biorąc pod uwagę zmiany intensywności fluorescencji, dochodzimy do wniosku, że struktura ta jest bardzo dynamiczna w naszym modelu.Metoda ta jest szybkim i niedrogim protokołem rejestracji dynamiki białka w miejscu podziału za pomocą mikroskopii konfokalnej stosowanej do złożonych morfologii jako nitkowatych sinic, przy użyciu Anabaena jako modelu.

vertical-immobilization-method-for-time-lapse-microscopy-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i...

Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Źródło: Weber, N. i wsp., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia skoncentrowany test oparty na diodach LED do badania fototaksji u sinic nitkowatych. Bakterie migrują w kierunku źródła światła, tworząc gęstą akumulację w oświetlonym środku, która jest wizualizowana i określana ilościowo poprzez analizę intensywności pikseli przechwyconego obrazu.

Test fototaksji sinic nitkowatych przy użyciu skupionego oświetlenia świetlnego

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Prezentowany tutaj jest protokół, który opisuje monitorowanie pełnego cyklu życia drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z podkładką agarozową i naczyniami do obrazowania komórek.

Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Poznaj metodę immobilizacji pionowej do analizy dynamiki białek podziału komórkowego u sinic nitkowatych Anabaena. Technika umożliwia szczegółowe obserwacje struktury Z-ring w płaszczyźnie XY przy użyciu mikroskopii poklatkowej.

Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Przeglądaj więcej filmów