Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

U bakterii badanie dynamiki białek podziału komórkowego wymaga orientacji przestrzennej komórek. Na przykład w przypadku pierścienia Z, głównego składnika podziału komórek bakteryjnych, orientacja pionowa ma fundamentalne znaczenie dla zapisania całej struktury w płaszczyźnie XY. W tym filmie opracowujemy metodę osiągania tej szczególnej orientacji u nitkowatych sinic Anabaena.

Anabaena jest wielokomórkowym organizmem fotosyntetyzującym i dzieli z innymi bakteriami zdolność do wykorzystywania atmosferycznego diazotu jako źródła azotu. W przypadku braku tego pierwiastka Anabaena różnicuje komórki wyspecjalizowane w wiązaniu azotu. Dlatego stanowi doskonały model do analizy związku między podziałem komórkowym a wielokomórkowością.

Najpierw wybierz składnik diosomowy obecny w docelowym nitkowatym szczepie sinic. Do eksperymentu konieczne jest skonstruowanie nitkowatego mutanta sinicowego, który wyraża wybrany składnik diwisomowy połączony z białkiem fluorescencyjnym. W tym protokole używamy jako przykładu mutanta Anabaena, który wyraża FtsZ połączony z GFP.

Najpierw stwórz nową subkulturę mutanta z 10 mililitrami kultury w fazie stacjonarnej i 90 mililitrami płynnej pożywki. Następnie hoduj nową hodowlę komórkową w stałym świetle i w optymalnej temperaturze, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej. W naszym przykładzie mutant był hodowany w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni.

Teraz weź dwa mililitry kultury wzrostu i umieść ją w probówce wirówkowej. Wirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu sprawdź, czy wszystkie komórki znajdują się na dnie probówki.

Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć ponownego zawieszenia. Podgrzej 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w kuchence mikrofalowej. Ważne jest, aby robić to w krótkich odstępach czasu i sprawdzać roztwór, aż będzie całkowicie płynny.

Po stopieniu odstawić do wystygnięcia. Wziąć probówki wirówkowe z poprzedniego kroku, wyrzucić 1,9 mililitra supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, pipetując co najmniej trzy razy w górę i w dół. W swoim miejscu pracy umieść probówkę z komórkami, stopiony roztwór agarozy, jednomililitrową strzykawkę wyciętą w końcówce oraz skalpel z nowym i czystym ostrzem.

Następnie wymieszać komórki z 900 mikrolitrami 3% roztworu agarozy, pipetując co najmniej trzy razy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że roztwór agarozy nie jest zbyt gorący, ale pozostaje płynny. Dzięki temu unikamy uszkodzenia komórek podczas tego procesu.

Następny krok należy wykonać szybko i zanim roztwór agarozy się zżeluje. Ostrożnie zassaj matrycę agarozy do jednomililitrowej strzykawki. Ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas zasysania próbki.

Następnie należy inkubować próbkę, umieszczając strzykawkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie usunąć matrycę z komórkami za pomocą tłoka na czystej i płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela pokrój próbkę żelu na jak najcieńsze plasterki, zachowując integralność matrycy.

Następnie umieść próbki w odpowiednim szkiełku nakrywkowym, obok siebie. Jak pokazano na filmie, na tym etapie możesz użyć końcówki, aby pomóc w procesie obsługi próbki. W przypadku eksperymentów poklatkowych zaleca się użycie komory komórkowej przeznaczonej do analizy mikroskopowej.

W tym przypadku używamy okrągłych szkiełek nakrywkowych, które pasują do tego typu komór, jak widać na filmie. Na koniec, aby zapobiec odwodnieniu próbki, dodaj dodatkową objętość stopionego 3% roztworu agarozy do wnętrza komory. Przed obrazowaniem poczekaj, aż agaroza zostanie całkowicie zżelowana.

Teraz umieść komorę z komórkami w mikroskopie w celu obrazowania. Zaleca się korzystanie ze sprzętu z kontrolą temperatury i wilgotności. Wizualizuj próbkę w jasnym polu z maksymalnym powiększeniem i wyszukaj włókno zorientowane pionowo.

Interesujące Cię miejsce podziału można znaleźć za pomocą wstępnego skanowania za pomocą sygnału autofluorescencji wzdłuż płaszczyzny Z. W ten sposób wykorzystaj parametry swojego fluorescencyjnego markera białkowego, aby zwizualizować sygnał interesującego Cię białka w miejscu podziału. Teraz możesz wykonywać eksperymenty poklatkowe zgodnie z modelem biologicznym i białkiem, które Cię interesuje.

W tym przypadku możemy zobaczyć całą strukturę pierścienia Z w mutancie FtsZ-GFP, w płaszczyźnie XY. Dzięki naszej metodzie byliśmy w stanie zarejestrować dynamikę tych pierścieni w długim okresie czasu. Wreszcie, biorąc pod uwagę zmiany intensywności fluorescencji, dochodzimy do wniosku, że struktura ta jest bardzo dynamiczna w naszym modelu.

Metoda ta jest szybkim i niedrogim protokołem rejestracji dynamiki białka w miejscu podziału za pomocą mikroskopii konfokalnej stosowanej do złożonych morfologii jako nitkowatych sinic, przy użyciu Anabaena jako modelu.