Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych
September 25th, 2023
Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.
U bakterii badanie dynamiki białek podziału komórkowego wymaga orientacji przestrzennej komórek. Na przykład w przypadku pierścienia Z, głównego składnika podziału komórek bakteryjnych, orientacja pionowa ma fundamentalne znaczenie dla zapisania całej struktury w płaszczyźnie XY. W tym filmie opracowujemy metodę osiągania tej szczególnej orientacji u nitkowatych sinic Anabaena.
Anabaena jest wielokomórkowym organizmem fotosyntetyzującym i dzieli z innymi bakteriami zdolność do wykorzystywania atmosferycznego diazotu jako źródła azotu. W przypadku braku tego pierwiastka Anabaena różnicuje komórki wyspecjalizowane w wiązaniu azotu. Dlatego stanowi doskonały model do analizy związku między podziałem komórkowym a wielokomórkowością.
Najpierw wybierz składnik diosomowy obecny w docelowym nitkowatym szczepie sinic. Do eksperymentu konieczne jest skonstruowanie nitkowatego mutanta sinicowego, który wyraża wybrany składnik diwisomowy połączony z białkiem fluorescencyjnym. W tym protokole używamy jako przykładu mutanta Anabaena, który wyraża FtsZ połączony z GFP.
Najpierw stwórz nową subkulturę mutanta z 10 mililitrami kultury w fazie stacjonarnej i 90 mililitrami płynnej pożywki. Następnie hoduj nową hodowlę komórkową w stałym świetle i w optymalnej temperaturze, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej. W naszym przykładzie mutant był hodowany w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni.
Teraz weź dwa mililitry kultury wzrostu i umieść ją w probówce wirówkowej. Wirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu sprawdź, czy wszystkie komórki znajdują się na dnie probówki.
Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć ponownego zawieszenia. Podgrzej 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w kuchence mikrofalowej. Ważne jest, aby robić to w krótkich odstępach czasu i sprawdzać roztwór, aż będzie całkowicie płynny.
Po stopieniu odstawić do wystygnięcia. Wziąć probówki wirówkowe z poprzedniego kroku, wyrzucić 1,9 mililitra supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, pipetując co najmniej trzy razy w górę i w dół. W swoim miejscu pracy umieść probówkę z komórkami, stopiony roztwór agarozy, jednomililitrową strzykawkę wyciętą w końcówce oraz skalpel z nowym i czystym ostrzem.
Następnie wymieszać komórki z 900 mikrolitrami 3% roztworu agarozy, pipetując co najmniej trzy razy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że roztwór agarozy nie jest zbyt gorący, ale pozostaje płynny. Dzięki temu unikamy uszkodzenia komórek podczas tego procesu.
Następny krok należy wykonać szybko i zanim roztwór agarozy się zżeluje. Ostrożnie zassaj matrycę agarozy do jednomililitrowej strzykawki. Ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas zasysania próbki.
Następnie należy inkubować próbkę, umieszczając strzykawkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie usunąć matrycę z komórkami za pomocą tłoka na czystej i płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela pokrój próbkę żelu na jak najcieńsze plasterki, zachowując integralność matrycy.
Następnie umieść próbki w odpowiednim szkiełku nakrywkowym, obok siebie. Jak pokazano na filmie, na tym etapie możesz użyć końcówki, aby pomóc w procesie obsługi próbki. W przypadku eksperymentów poklatkowych zaleca się użycie komory komórkowej przeznaczonej do analizy mikroskopowej.
W tym przypadku używamy okrągłych szkiełek nakrywkowych, które pasują do tego typu komór, jak widać na filmie. Na koniec, aby zapobiec odwodnieniu próbki, dodaj dodatkową objętość stopionego 3% roztworu agarozy do wnętrza komory. Przed obrazowaniem poczekaj, aż agaroza zostanie całkowicie zżelowana.
Teraz umieść komorę z komórkami w mikroskopie w celu obrazowania. Zaleca się korzystanie ze sprzętu z kontrolą temperatury i wilgotności. Wizualizuj próbkę w jasnym polu z maksymalnym powiększeniem i wyszukaj włókno zorientowane pionowo.
Interesujące Cię miejsce podziału można znaleźć za pomocą wstępnego skanowania za pomocą sygnału autofluorescencji wzdłuż płaszczyzny Z. W ten sposób wykorzystaj parametry swojego fluorescencyjnego markera białkowego, aby zwizualizować sygnał interesującego Cię białka w miejscu podziału. Teraz możesz wykonywać eksperymenty poklatkowe zgodnie z modelem biologicznym i białkiem, które Cię interesuje.
W tym przypadku możemy zobaczyć całą strukturę pierścienia Z w mutancie FtsZ-GFP, w płaszczyźnie XY. Dzięki naszej metodzie byliśmy w stanie zarejestrować dynamikę tych pierścieni w długim okresie czasu. Wreszcie, biorąc pod uwagę zmiany intensywności fluorescencji, dochodzimy do wniosku, że struktura ta jest bardzo dynamiczna w naszym modelu.
Metoda ta jest szybkim i niedrogim protokołem rejestracji dynamiki białka w miejscu podziału za pomocą mikroskopii konfokalnej stosowanej do złożonych morfologii jako nitkowatych sinic, przy użyciu Anabaena jako modelu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia innowacyjną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w orientacji pionowej, umożliwiającą szczegółowe obserwowanie białek podziału komórkowego, w szczególności struktury pierścienia Z. Stosując sinicę Anabaena jako model, metoda wykazuje, jak skutecznie zastosować fluorescencyjne markery do badania dynamiki w złożonych wielokomórkowych formach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Podział komórki
- Biologia sinic
- Mikroskopia fluorescencyjna
Tło
- Anabaena to wielokomórkowe organizmy fotosyntetyzujące, zdolne do wiązania azotu.
- Zrozumienie dynamiki białek w sinicach może przyczynić się do poznania mechanizmów podziału komórki i wielokomórkowości.
- Orientacja przestrzenna w obrazowaniu jest kluczowa dla uchwycenia pełnych struktur takich jak pierścień Z.
Stosowane metody
- Fluorescencyjne oznaczanie białka FtsZ, składnika dywizomu
- Modelowy system nitkowatych sinic (Anabaena)
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania
Główne wyniki
- Dynamika struktury pierścienia Z została skutecznie zwizualizowana w płaszczyźnie XY.
- Metoda wykazała wysoką rozdzielczość czasową i umożliwiła ciągłą obserwację zachowania białek.
- Wyniki potwierdziły dynamiczny charakter pierścienia Z podczas podziału komórki.
Wnioski
- Ta metoda ułatwia badanie dynamiki białek w nitkowatych organizmach i zapewnia ramy obowiązujące dla różnych gatunków nitkowatych.
- Wyniki wnoszą wkład do szerszej wiedzy w dziedzinie biologii komórki i metodologii mikroskopicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse imaging of protein dynamics in complex bacterial systems is critical for de-risking early discovery and validating division-related targets. The vertical immobilization method for filamentous cyanobacteria enables direct visualization of Z-ring assembly and dynamics, supporting predictive confidence in mechanistic studies. This capability strengthens the translational bridge from basic cell biology to applied microbial engineering and synthetic biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell division protein dynamics in multicellular bacterial models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing FtsZ Z-ring formation and behavior in vivo.
- Facilitates functional validation of division-related targets in genetically engineered strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, vertically oriented biological samples for quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample orientation and imaging conditions.
- Enables robust, time-lapse readouts for screening division-modulating compounds in complex morphologies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant or industrially relevant multicellular bacterial systems.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical microbial engineering applications.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for biotechnological use.
Pipeline & Workflow Integration
This vertical immobilization protocol fits at the interface of early discovery and assay development, enabling high-content imaging from target validation through preclinical microbial model evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on division protein function and spatial organization in multicellular bacteria.
- Screening: Delivers standardized, reproducible sample preparation for quantitative imaging assays.
- Analytics: Provides time-resolved, quantitative fluorescence measurements of protein dynamics at division sites.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical microbial engineering and synthetic biology workflows.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, low-cost method adaptable to diverse filamentous bacterial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in division protein function and target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for microbial engineering and synthetic biology initiatives.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of division-targeted interventions and engineered strains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and fluorescent protein engineering.
- Needs access to temperature- and humidity-controlled imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various filamentous bacterial models with appropriate genetic tools.
- Sample orientation and handling are critical for reproducible, high-content imaging outputs.
