Name: Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka w celu badania ekspresji białek podczas rozwoju soczewki. Ta technika umożliwia szybkie i precyzyjne modyfikacje genetyczne in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (dla J.X.J) i F32DK134051 (dla F.M.A.) oraz grant Fundacji Welch: AQ-1507 (dla J.X.J.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Figury zostały częściowo stworzone przy użyciu Biorender.com.

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act) oraz wykonawczymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, zgodnie z zasadami zawartymi w przewodniku Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na University of Texas Health Science Center w San Antonio. Przegląd protokołu znajduje się na Rysunku 1; szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów użytych w tym protokole zawiera Tabela materiałów.
<img alt="Schemat mikroiniekcji soczewki kurczaka; klonowanie DNA, transfekcja, proces wektora wirusowego, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat eksperymentalny. 1. Pierwszym krokiem protokołu jest określenie konkretnego białka docelowego, identyfikacja powiązanych sekwencji genów oraz generowanie fragmentów DNA. 2. Klonowanie sekwencji genu do wektora retrowirusowego poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, 3. a następnie do wektora wirusowego. 4. Przygotowanie cząstek wirusowych o wysokim mianie przy użyciu komórek pakujących w celu ich zbioru i zagęszczenia. 5. Ostatnim krokiem, będącym głównym przedmiotem niniejszego protokołu, jest mikroiniekcja cząstek wirusowych RCAS(A) do światła soczewki kurczaka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1. Przygotowanie rekombinowanych retrowirusów o wysokim mianie
<ol>
	<li>Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu otrzymania fragmentów DNA docelowego białka 
	UWAGA: Celem tej sekcji jest amplifikacja sekwencji DNA odpowiadającej docelowemu białku soczewki. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
	<ol>
		<li>Zaprojektować startery do PCR, odpowiadające badanemu białku, aby otrzymać fragmenty DNA, których końce karboksylowe znajdują się w jednej ramce odczytu z sekwencją epitopu FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3') lub bez niej, kodonem stop oraz miejscem cięcia enzymu restrykcyjnego (np. EcoRI) obecnym w regionie polilinkera CLa12NCO, zgodnie ze specyfikacjami opisanymi w wcześniej opublikowanych protokołach, z sekwencjami dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych1,7,8,10,11.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję PCR10. Połączyć 100 pmol starterów sens i antysens z 0,5 µg cDNA koneksyny (np. Cx50, Cx43 lub kombinacji chimerycznych Cx50*43L) w wybranym buforze do reakcji PCR. Przeprowadzić 30 cykli, z których każdy składa się z 94 °C przez 1 min, 58 °C przez 1 min i 72 °C przez 1 min, a następnie końcową elongację przez 10 min w 72 °C.</li>
		<li>Wyizolować i oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania z żelu.</li>
		<li>Przetrawić oczyszczone produkty PCR przy użyciu wybranych enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonowanie insertów DNA do plazmidu adaptorowego 
	UWAGA: Wstawienie fragmentów DNA do wektora adaptorowego eliminuje konieczność stosowania komórek/wirusów pomocniczych w celu zwiększenia stabilności wektora RCAS(A)14. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
	<ol>
		<li>Subklonować fragmenty DNA do plazmidu adaptorowego Cla12NCO, wykorzystując reakcję ligacji lepko-końcowej. Wymieszać fragmenty PCR z enzymami restrykcyjnymi i Cla12NCO w stosunku 2-5:1. Przeprowadzić ligację i transformację DNA przy użyciu komórek kompetentnych.</li>
		<li>Wyizolować DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.</li>
		<li>Sekwencjonować DNA w celu potwierdzenia poprawności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonowanie do wirusowego wektora RCAS(A) 
	UWAGA: Fragmenty DNA są wstawiane do nośnika (retrowirus RCAS(A)) w celu stabilnej transdukcji genu do komórek w rozwijającym się zarodku kurczaka14,15. Więcej szczegółów znajduje się w7,8,15.
	<ol>
		<li>Przetrawić wektor Cla12NCO zawierający badany fragment DNA enzymem ClaI (1 jednostka na 1 µg DNA) i wyizolować fragmenty z żelu.</li>
		<li>Subklonować fragmenty DNA do zlinearyzowanego enzymem ClaI plazmidu RCAS(A). Użyć enzymu restrykcyjnego SalI, aby odróżnić miejsce cięcia ClaI w plazmidzie RCAS(A).</li>
		<li>Potwierdzić poprawną orientację wstawionych fragmentów w konstruktach poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi ClaI i SalI.</li>
		<li>Wyizolować DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja fibroblastów embrionalnych kurczaka (CEF) i pozyskiwanie RCAS(A) 
	UWAGA: Komórki pakujące wirusa, CEFs, są wykorzystywane do otrzymywania/pozyskiwania pożywek hodowlanych zawierających cząsteczki wirusowe15,16. Więcej szczegółów znajduje się w7,8,15.
	<ol>
		<li>Transfekować komórki CEF rekombinowanymi konstruktami DNA retrowirusowego, używając czynnika transfekcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę western blot przetransfekowanych komórek, aby zbadać ekspresję badanego białka.</li>
		<li>Gdy przetransfekowane komórki osiągną konfluencję, rozpocząć zbieranie znadpływu pożywki, poddać go odpowiedniemu przetwarzaniu/filtrowaniu (aby usunąć resztki komórkowe za pomocą filtra 0,22 µm) i przechowywać w -80 °C do czasu zagęszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zagęszczanie i miareczkowanie zapasów wirusowych 
	​UWAGA: Osad oraz duże objętości pożywek pochodzących z komórek zawierających cząsteczki wirusowe muszą zostać przefiltrowane. Dodatkowo należy przeprowadzić test miana wirusa, aby określić siłę wirusa względem komórek gospodarza. Więcej szczegółów znajduje się w6,7,8,15.
	<ol>
		<li>Rozmrozić pożywki hodowlane zawierające wiriony.</li>
		<li>Wirować pożywki hodowlane przy 72 000 × g przez 2 h w 4 °C.</li>
		<li>Zlać znadpływ i resuspender osad wirusowy w pozostałej (~50 µL) pożywce, a następnie przechowywać w -80 °C do czasu użycia, w aliquotach zapasów wirusowych o objętości ~10 µL.</li>
		<li>W celu miareczkowania, używając komórek QT-6 lub CEF, transfekować komórki seryjnymi rozcieńczeniami zapasów wirusowych.</li>
		<li>Po osiągnięciu konfluencji utrwalić komórki za pomocą 4% formaldehydu.</li>
		<li>Przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne na wirusowe białka gag lub histochemiczne na fosfatazę alkaliczną, aby uzyskać miano, definiowane jako jednostki tworzące kolonie (CFU) na mililitr (CFU/mL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat sprzętu do równowagi statycznej: A) konfiguracja testera mechanicznego; B) szafa magazynowa; C) mikroskop i stacja badawcza do analizy materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Instrumenty i konfiguracja do mikroiniekcji do soczewki kurczaka. (A) Manualny pionowy wyprawiacz mikroelektrod i mikropipet P-30. (1) wstawka przedstawiająca proces wyprawiania szklanej mikropipety. (B) (2) Inkubator do jaj. Inkubacja jaja kurzego przez ~65-68 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C do osiągnięcia stadium 18 (z zamkniętym, pustym światłem centralnym) w celu iniekcji retrowirusa. (C) Układ do mikroiniekcji. (3) sprzęt oświetleniowy, (4) Pico-Injector, (5) mikroskop sekcyjny, (6) mikromanipulator Drummond, (7) komputer/kamera do wizualizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Mikroiniekcja do soczewki kurczaka
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Przygotowanie szklanych mikropipet do mikroiniekcji17 
		UWAGA: Do wykonania szklanych mikropipet z ostrym końcem i średnicą zewnętrzną (OD) ~11 µm do mikroiniekcji wykorzystuje się kapilary szklane. Układ przedstawiono na Rysunku 2A.
		<ol>
			<li>Przymocuj kapilarę z borokrzemianowego szkła do zacisków z gumową podkładką w ręcznym pionowym wyciągaczu do mikropipet.</li>
			<li>Ustaw temperaturę grzania (HEAT 1) na 950 °C i przeprowadź wstępne wyciąganie w celu uzyskania cieńszej i bardziej plastycznej kapilary szklanej.</li>
			<li>Ustaw temperaturę grzania (HEAT 2) na 790 °C i przeprowadź wtórne wyciąganie w celu wytworzenia końcowych mikropipet.</li>
			<li>Za pomocą szlifierki do mikropipet zaostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej (OD) ~11 µm.</li>
			<li>Na potrzeby przyszłych eksperymentów przechowuj szklane mikropipety w uchwycie z gąbki wewnątrz szklanego słoika.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja zapłodnionych jaj do 18. stadium rozwoju 
		UWAGA: Podczas rozwoju soczewki, w ok. 65-68 h rozwoju embrionalnego, soczewka oddziela się od ektodermy i tworzy zamknięty pęcherzyk z centralnym światłem; iniekcja do tego pustego światła soczewki umożliwia ograniczenie ekspresji do proliferujących komórek soczewki7,8,18.
		<ol>
			<li>Inkubuj zapłodnione jaja kurze przez ~65-68 h w nawilżanym inkubatorze kołyszącym w temperaturze 37 °C (Rysunek 2B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwieranie jaja kurzego 
	UWAGA: Krok ten opisuje identyfikację i odsłonięcie embrionu do mikroiniekcji. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
	<ol>
		<li>Dokładnie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem.</li>
		<li>Wyjmij jaja z inkubatora, obficie spryskaj je 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>Umieść jajo na uchwycie, szerszym końcem skierowanym do góry.</li>
		<li>Używając pęsety z ostrymi ząbkami, wykonaj otwór o średnicy ~2 cm na szerszym końcu jaja, ostrożnie stukając w skorupkę i usuwając jej fragmenty (Rysunek 3A).</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zlokalizuj embrion.</li>
		<li>Po zlokalizowaniu embrionu i soczewki pisklęcia, użyj mikroskopu stereoskopowego, precyzyjnej pęsety i nożyczek, aby wyciąć błonę owodni bezpośrednio pokrywającą górną część embrionu (Rysunek 3B). 
		UWAGA: Nie wycinaj zbyt szeroko (tylko tyle, aby odsłonić embrion na obszarze ~0,5 cm x 0,5 cm), w przeciwnym razie embriony mogą zatonąć w masie żółtka; unikaj również, jeśli to możliwe, dotykania naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Przykryj otwór w jajze szalką Petriego o średnicy 60 mm w przygotowaniu do kolejnych kroków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroiniekcja stężonego roztworu wirusowego 
	UWAGA: Cząstki wirusowe zawierające fragmenty DNA docelowego białka do transdukcji są wprowadzane do komórek wewnątrz światła soczewki. Układ przedstawiono na Rysunku 2C. Więcej szczegółów znajduje się w6,7,8.
	<ol>
		<li>Odmroź zapasy wirusowe na lodzie.</li>
		<li>W celu wizualizacji roztworu wirusowego podczas iniekcji, dodaj 1 µL 10x Fast green do jednej fiolki z roztworem wirusowym zawierającej 10 µL.</li>
		<li>Aby upewnić się, że nie ma dużych grudek nierozpuszczonego materiału, które mogłyby zapchać szklaną mikropipetę, wirowarkuj roztwory przez 10 s przy 10 000 × g w temperaturze 4 °C, aby osadzić „duże grudki”, a następnie przenieś nadsącz do nowych probówek, cały czas utrzymując roztwory na lodzie.</li>
		<li>Na szalce hodowlanej 35 mm x 10 mm rozciągnij laboratoryjną parafinię i nanieś na nią 1 µL sterylnego roztworu soli fizjologicznej (PBS) (niejałowiona, strona przykryta uznawana jest za „czystą”).</li>
		<li>Podłącz przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego piko-injektora.</li>
		<li>Naciśnij fill mode, aby zaciągnąć sterylną sól fizjologiczną (PBS) do szklanej mikropipety, a następnie użyj inject mode, aby przetestować odmierzoną 1 µL cieczy.</li>
		<li>Rozciągnij drugą warstwę laboratoryjnej parafinii na powierzchni nowej szalki hodowlanej 35 mm x 10 mm i nanieś na nią 1 µL roztworów wirusowych zabarwionych Fast green.</li>
		<li>Zanurz końcówkę mikropipety w roztworze wirusowym i naciśnij fill-model, aby zaciągnąć do szklanej mikropipety ~1 µL roztworu wirusowego. 
		UWAGA: Aby zapobiec wysychaniu, podczas każdej przerwy w procedurze umieszczaj końcówkę wypełnionej mikropipety w sterylnej soli fizjologicznej (PBS).</li>
		<li>Przy pomocy mikroskopu stereoskopowego wprowadź wypełnioną szklaną mikropipetę, podłączoną do automatycznego injektora, do docelowego obszaru światła soczewki embrionu.</li>
		<li>Dostosuj źródło światła, aby zapewnić wyraźną wizualizację obrysu pęcherzyka soczewki. 
		UWAGA: Do iniekcji zazwyczaj wykorzystuje się światło prawej soczewki (skierowanej w górę), a lewą (skierowaną w dół) pozostawia się nienaruszoną jako kontrolę kontralateralną.</li>
		<li>Po upewnieniu się, że mikropipeta znajduje się w prawidłowym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij 5-40 nL roztworu wirusowego (Rysunek 3C). 
		UWAGA: Praktyka jest niezbędna dla optymalnego rozmieszczenia iniekcji.</li>
		<li>Odczekaj ~45 s, a następnie ostrożnie wyjmij szklaną mikropipetę.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego sprawdź powodzenie mikroiniekcji do światła soczewki, obserwując barwnik Fast Green, który powinien pozostać w pustym świetle soczewki bez żadnych wycieków.</li>
		<li>Po zakończeniu procedury iniekcji zaklej otwór w skorupce jaja taśmą klejącą.</li>
		<li>Przenieś embrion z powrotem do nawilżanego inkubatora w temperaturze 37 °C, bez ruchu obrotowego, aż do osiągnięcia pożądanego wieku embrionalnego do dyssekcji soczewki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat operacji oka z wstawieniem soczewki i konfiguracją badania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65727/65727fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie i schemat mikroiniekcji u kurczęcia. (A) Otwieranie jaja kurzego. (B) Przecinanie błony owodniowej. (C) Schemat mikroiniekcji do światła soczewki kurczęcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65727/65727fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

<ol><li>Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+potent+embryonic+chick+lens+model+for+studying+congenital+cataracts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo.</a> Communications Biology. 4 (1), 325(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-Crystallins+of+the+chicken+lens%3A+remnants+of+an+ancient+vertebrate+gene+family+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds.</a> The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).</li>
<li>Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+development.+I.+Role+of+the+lens+in+eye+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Lens development. I. Role of the lens in eye growth.</a> Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).</li>
<li>McKeehan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+portions+of+the+chick+lens+without+contact+with+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup.</a> The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).</li>
<li>Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+effect+of+BAFF+on+chicken+B+cell+development+revealed+by+RCAS+retroviral+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo.</a> Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).</li>
<li>Fekete, D. M., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+encoding+alkaline+phosphatase+reveal+spatial+restriction+of+viral+gene+expression%2Ftransduction+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).</li>
<li>Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+retroviruses+to+express+connexins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of retroviruses to express connexins.</a> Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).</li>
<li>Jiang, J. X., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+of+connexins+in+embryonic+chick+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+autofluorescent+proteins+reveals+a+novel+protein+permeable+pathway+between+cells+in+the+lens+core%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core.</a> Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).</li>
<li>Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+0+enhances+gap+junction+coupling+via+its+cell+adhesion+function+and+interaction+with+connexin+50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50.</a> Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+extracellular+domain+of+connexin+50+is+important+for+in+cell+adhesion%2C+lens+differentiation%2C+and+adhesion+molecule+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+gene+expression+and+protein+targeting+in+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).</li>
<li>Shestopalov, V. I., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organization+of+primary+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organization of primary lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).</li>
<li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li>
<li>Yan, R. T., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+RCAS+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer RCAS retrovirus.</a> Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).</li>
<li>Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+macrophage+activation+in+immune-privileged+lens+through+CSF-1+protein+intravitreal+injection+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+and+regulatory+status+of+food%2C+drug+and+cosmetics+colour+additives+exempt+from+certification%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification.</a> Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).</li>
<li>Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+differentiation+by+chicken+lens+epithelium+in+in+vitro+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture.</a> Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).</li>
<li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).</li>
<li>Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomicrographic+evaluation+of+drug-induced+cataracts+in+cultured+embryonic+chick+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens.</a> Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).</li>
<li>Musil, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+embryonic+chick+lens+cells+as+a+model+system+to+study+lens+gap+junctions+and+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).</li>
<li>West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+the+lens+epithelial+explant+system+to+study+lens+differentiation+and+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).</li>
<li>Upreti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+explants+treated+with+vitreous+humor+undergo+alterations+in+chromatin+landscape+with+concurrent+activation+of+genes+associated+with+fiber+cell+differentiation+and+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response.</a> Cells. 12 (3), 501(2023).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).</li>
<li>Briskin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+retroviral+transgenes+are+highly+expressed+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biologica%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Ten eksperymentalny model daje możliwość ekspresji białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania w nienaruszonej soczewce, co prowadzi do zbadania funkcjonalnego znaczenia tych białek w strukturze i funkcji soczewki. Model mikroiniekcji embrionalnych piskląt jest częściowo oparty na pracy Fekete et. al.6 i był dalej rozwijany przez Jiang et. al.8 i został wykorzystany jako środek do wprowadzania zarówno plazmidów wirusowych, jak i czynników, takich jak agoniści, małe...

Celem tego protokołu jest opisanie metodologii mikroiniekcji embrionalnej soczewki kurczaka RCAS(A) (kompetentnego replikacyjnie mięsaka ptaka/białaczki A). Wykazano, że skuteczne dostarczanie retrowirusowe w embrionalnej soczewce kurczaka jest obiecującym narzędziem do badania in vivo mechanizmu molekularnego i struktury i funkcji białek soczewki w prawidłowej fizjologii soczewki, stanach patologicznych i rozwoju. Co więcej, ten eksperymentalny model może zostać wykorzystany do identyfikacji celów terapeutycznych i badań przesiewowych leków w przypadku schorzeń takich jak zaćma wrodzona u ludzi. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma na celu określenie niezbędnych kroków do opracowania konfigurowalnej platformy do badania białek soczewek.
Embrionalne pisklęta (Gallus domesticus), ze względu na podobieństwo w budowie i funkcji soczewki do soczewki ludzkiej, są dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki1,2,3,4. Zastosowanie kompetentnego do replikacji retrowirusa ptaków RCAS(A) zostało uznane za wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Warto zauważyć, że ma unikalną zdolność do ograniczania docelowego transferu genów do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki, wykorzystując unikalne ramy czasowe rozwoju embrionalnego, w których obecność pustego światła soczewki pozwala na mikroiniekcję in situ RCAS(A) do miejsca ograniczonego w celu ekspresji białek egzogennych w proliferacyjnych komórkach włókien soczewki<klasa sup = "xref">5, 6,7,8.
Procedura mikroiniekcji zarodków piskląt, opisana szczegółowo tutaj, jest pierwotnie częściowo oparta na pracy Fekete et. al.6 i dalej rozwijana przez Jiang et. al.8 i została wykorzystana jako sposób na wprowadzenie zarówno wirusowych, jak i niewirusowych plazmidów do soczewki embrionalnych piskląt1,9,10,11,12,13. Ogólnie rzecz biorąc, poprzednie prace pokazują potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr</td><td>Corning</td><td>431118</td><td>Do usuwania zanieczyszczeń komórkowych z pożywki</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Naczynie hodowlane</td><td>FisherScientific</td><td>50-202-030</td><td>Do stosowania podczas mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Fisherbrand</td><td>13-100-676</td><td>Roztwór do wirowania</td></tr><tr><td>w dół Konstrukty</td><td>GENEWIZ-Do</td><td></td> <td>generowania konstruktów</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>AmScope</td><td>SM-4TZ-144A Wizualizacja</td><td>soczewki do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>starterów DNA PCR</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> <td>DNA-Generacja starterów: Cx50 z delecją wewnątrzkomórkową (IL) (reszty 1&ndash; 97 oraz 149&ndash; 400) oraz wektor Cla12NCO uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antysens, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs Cx43 (reszty 98&ndash; 150) i Cx46 (pozostałości 98&ndash; 166) były&nbsp; otrzymany z następującymi parami starterów: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antysens, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, odpowiednio Szablon konstrukcji Cla12NCO-Cx43 uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antysens, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs Cx50 (pozostałości 98&ndash; 148) lub Cx46 (pozostałości 98&ndash; 166) zostały sklonowane przy użyciu konstrukcji Cla12NCO-Cx50 i Cla12NCO-Cx46 jako szablonów z następującą parą starterów: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antysens, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, odpowiednio</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II Automatyczny wtryskiwacz nanolitrowy</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Pipeta do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Podwójne światła na gęsiej szyi Oświetlacz mikroskopu</td><td>AmScope</td><td>LED-50WY</td><td>Oświetlenie do wizualizacji</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td> <td>Invitrogen</td><td></td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Uchwyt na jaja</td> <td>-</td><td></td> <td>Domowe styropianowe pierścienie o średnicy 2 cali i wysokości pół cala</td></tr><tr><td>Inkubator jaj</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.</td><td>1502</td><td>Do inkubacji zapłodnionych jaj</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fisher scientific</td><td>F99-10</td><td>Do wizualizacji iniekcji zapasów wirusowych</td></tr><tr><td>Zapłodnione białe jaja kurze leghorn</td><td>Texas A& M University</td><td>N/A</td><td>Preferowany model zwierzęcy do mikroiniekcji (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Laboratoria</td><td></td> hyklonowe <td>Do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG sprzężone z fluoresceiną</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-095-003</td><td>Do anty-FLAG&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FisherScientific</td><td>22-327379</td><td>Do przenoszenia rzeczy i izolacja</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Szklana mikropipeta do mikroiniekcji (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm, długość 10 cm)</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>L3000001</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>Ręczny pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>Aby uzyskać szklaną mikropipetę o odpowiednim rozmiarze</td></tr><tr><td>Probówki</td> <td>do mikrowirówekFisherScientific</td><td>02-682-004</td><td>Roztwór do rozpuszczania</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Do barwienia</td></tr><tr><td>obrazowego Parafilmu</td><td>FisherScientific</td><td>03-448-254</td><td>Roztwór do umieszczania</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pico-Injector</td><td>Aparat Harvard</td><td>PLI-100</td><td>Do precyzyjnego dostarczania małych objętości cieczy przez mikropipety poprzez zastosowanie regulowanego ciśnienia przez cyfrowo ustawiony okres czasu</td></tr><tr><td>królik anty-piskląt AQP0</td><td>Self generated-Jiang</td><td></td> <td>JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Klonowanie molekularne i charakterystyka funkcjonalna koneksyny światłowodowej soczewki pisklątej 45.6. Komórka Mol Biol. 1994 marzec; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.</td></tr><tr><td>królicze przeciwciało anty-FLAG</td><td>Rockland Immunichemicals</td><td>600-401-383</td><td>Do barwienia FLAG</td></tr><tr><td>IgG anty-króliczej sprzężonej z rodaminą&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-295-003</td><td>Do anty-AQP0&nbsp; 1:500</td></tr><tr><td>Podkładka zaciskowa z gąbką</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td>Do przechowywania szklanej mikropipety</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa rcas(a) do soczewki embrionalnej kurczaka

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embrionalny kurczak (Gallus domesticus) jest dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki, ze względu na jego wysoki stopień podobieństwa do soczewki ludzkiej. RCAS(A) jest kompetentnym do replikacji retrowirusem kurczaka, który infekuje dzielące się komórki, co służy jako potężne narzędzie do badania ekspresji i funkcji in situ białek typu dzikiego i zmutowanych podczas rozwoju soczewki poprzez mikrowstrzyknięcie do pustego światła pęcherzyka soczewki we wczesnych stadiach rozwoju, ograniczając jego działanie do otaczających proliferujących komórek soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, zastosowanie retrowirusa ptaków zdolnego do replikacji RCAS(A) zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. W szczególności ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki. W tym artykule pokrótce omówimy etapy potrzebne do przygotowania rekombinowanego retrowirusa RCAS(A), przedstawimy szczegółowy, kompleksowy przegląd procedury mikroiniekcji oraz przedstawimy przykładowe wyniki techniki.

Po określeniu specyficznego białka docelowego i identyfikacji powiązanej sekwencji genu (lub genów), ogólne podejście eksperymentalne obejmuje klonowanie sekwencji genu (lub genów) do retrowirusowego wektora RCAS(A) poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, a następnie do wektora wirusowego. Po drugie, przy użyciu komórek pakujących przygotowuje się cząstki wirusowe o wysokim mianie w celu zbioru i zagęszczenia wirionów. Te dwa pierwsze główne etapy zostały w znacznym stopniu opisane, a reprezentatywne wyniki p...

Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Przedstawiona metodyka mikroiniekcji retrowirusa RCAS do embrionalnej soczewki kurczaka ma służyć jako narzędzie do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, retrowirus ptaków kompetentny do replikacji RCAS zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów.Istnieje znaczny potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju soczewek, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do dalszego odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma. Aby rozpocząć, przymocuj kapilarnę ze szkła borokrzemianowego do gumowych, wyściełanych klipsów w ręcznym pionowym ściągaczu do mikropipet. Ustaw temperaturę grzania ściągacza do mikropipet na 950 stopni Celsjusza i wykonaj wstępne wyciąganie, aby uzyskać cieńszą i bardziej miękką szklaną kapilarę.Następnie ustaw temperaturę grzania na 790 stopni Celsjusza i wykonaj wtórne ciągnięcie, aby wyprodukować końcowe mikropipety. Za pomocą młynka do mikropipet ostrożnie naostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej 11 mikrometrów. Następnie umieść mikropipety w gąbczastej podkładce zaciskowej wewnątrz szklanego słoika.Wysiaduj zapłodnione jaja kurze do stadium rozwoju 18 w wilgotnym inkubatorze na biegunach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dokładnie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem. Po rozwinięciu wyjmij jaja z inkubatora.Spryskaj jajka 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść jajko na uchwycie na jajka większym końcem skierowanym do góry. Za pomocą ostrych kleszczy zębatych ostrożnie postukaj w większy koniec skorupki jajka, aby utworzyć otwór o średnicy dwóch centymetrów.Następnie usuń fragmenty skorupki jajka. Umieść komórkę jajową na stoliku mikroskopu preparacyjnego i zlokalizuj zarodek. Następnie za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych i nożyczek odetnij błonę owodniową pokrywającą górną część zarodka.Następnie umieść 60-milimetrową szalkę Petriego nad otworem jajka. Na początek rozmrozić zapas RCAS(A)retrovirus na lodzie. Aby uniknąć zatkania mikropipety, odwirować roztwór o sile 10 000 G przez 10 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki, utrzymując roztwory na lodzie.Umieścić rozciągnięty parafilm laboratoryjny na naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 35 na 10 milimetrów i dodać jeden mikrolitr sterylnego PBS do parafilmu. Podłączyć przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego picowtryskiwacza. Naciśnij przycisk Fill Mode (Tryb napełniania), aby napełnić PBS do mikropipety, a następnie naciśnij przycisk Inject Mode (Tryb wstrzykiwania), aby przetestować przydzielony jeden mikrolitr cieczy.Umieść drugi kawałek rozciągniętego parafilmu laboratoryjnego na nowej naczyniu do hodowli komórkowej i dodaj jeden mikrolitr szybko zabarwionego na zielono materiału wirusowego do folii. Opuść końcówkę mikropipety do materiału wirusowego i naciśnij przycisk Tryb napełniania, aby napełnić mikropipetę jednym mikrolitrem materiału wirusowego. Pod mikroskopem preparacyjnym opuścić napełnioną mikropipetę podłączoną do automatycznego wstrzykiwacza do docelowego obszaru soczewki zarodka kurzego.Następnie wyreguluj źródło światła, aby zapewnić wyraźny view pęcherzyka soczewki. Po upewnieniu się, że mikropipeta znajduje się we właściwym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij od pięciu do 40 nanolitrów materiału wirusowego. Po wstrzyknięciu należy odczekać 45 sekund przed delikatnym wyjęciem mikropipety.Następnie sprawdź udaną mikroiniekcję, badając barwnik Fast Green w pustym świetle soczewki bez wycieków. Po badaniu uszczelnij otwór skorupki jajka taśmą klejącą i umieść jaja w wilgotnym inkubatorze statycznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Badanie to przedstawia ocenę histologiczną pętli chimerycznej koneksyny 50 i 43 poprzez immunofluorescencję.Stosując znakowanie antyflagowe, odróżniono koneksyny egzogenne od endogennych. W badaniu oceniono również interakcję między wewnątrzkomórkową domeną pętli koneksyny 50 i akwaporyny zero.

microinjection-recombinant-rcas-retrovirus-into-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.

Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Opisujemy metodę uzyskiwania pierwotnych kultur fotoreceptorów czopków z siatkówki zarodków kurczaków i jej wykorzystanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Poznaj metodę mikroiniekcji rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka w celu badania ekspresji białek podczas rozwoju soczewki. Ta technika umożliwia szybkie i precyzyjne modyfikacje genetyczne in vivo.

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

Przeglądaj więcej filmów