Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka
1 września 2023
Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.
Przedstawiona metodyka mikroiniekcji retrowirusa RCAS do embrionalnej soczewki kurczaka ma służyć jako narzędzie do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, retrowirus ptaków kompetentny do replikacji RCAS zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów.
Istnieje znaczny potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju soczewek, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do dalszego odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma. Aby rozpocząć, przymocuj kapilarnę ze szkła borokrzemianowego do gumowych, wyściełanych klipsów w ręcznym pionowym ściągaczu do mikropipet. Ustaw temperaturę grzania ściągacza do mikropipet na 950 stopni Celsjusza i wykonaj wstępne wyciąganie, aby uzyskać cieńszą i bardziej miękką szklaną kapilarę.
Następnie ustaw temperaturę grzania na 790 stopni Celsjusza i wykonaj wtórne ciągnięcie, aby wyprodukować końcowe mikropipety. Za pomocą młynka do mikropipet ostrożnie naostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej 11 mikrometrów. Następnie umieść mikropipety w gąbczastej podkładce zaciskowej wewnątrz szklanego słoika.
Wysiaduj zapłodnione jaja kurze do stadium rozwoju 18 w wilgotnym inkubatorze na biegunach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dokładnie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem. Po rozwinięciu wyjmij jaja z inkubatora.
Spryskaj jajka 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść jajko na uchwycie na jajka większym końcem skierowanym do góry. Za pomocą ostrych kleszczy zębatych ostrożnie postukaj w większy koniec skorupki jajka, aby utworzyć otwór o średnicy dwóch centymetrów.
Następnie usuń fragmenty skorupki jajka. Umieść komórkę jajową na stoliku mikroskopu preparacyjnego i zlokalizuj zarodek. Następnie za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych i nożyczek odetnij błonę owodniową pokrywającą górną część zarodka.
Następnie umieść 60-milimetrową szalkę Petriego nad otworem jajka. Na początek rozmrozić zapas RCAS(A)retrovirus na lodzie. Aby uniknąć zatkania mikropipety, odwirować roztwór o sile 10 000 G przez 10 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki, utrzymując roztwory na lodzie.
Umieścić rozciągnięty parafilm laboratoryjny na naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 35 na 10 milimetrów i dodać jeden mikrolitr sterylnego PBS do parafilmu. Podłączyć przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego picowtryskiwacza. Naciśnij przycisk Fill Mode (Tryb napełniania), aby napełnić PBS do mikropipety, a następnie naciśnij przycisk Inject Mode (Tryb wstrzykiwania), aby przetestować przydzielony jeden mikrolitr cieczy.
Umieść drugi kawałek rozciągniętego parafilmu laboratoryjnego na nowej naczyniu do hodowli komórkowej i dodaj jeden mikrolitr szybko zabarwionego na zielono materiału wirusowego do folii. Opuść końcówkę mikropipety do materiału wirusowego i naciśnij przycisk Tryb napełniania, aby napełnić mikropipetę jednym mikrolitrem materiału wirusowego. Pod mikroskopem preparacyjnym opuścić napełnioną mikropipetę podłączoną do automatycznego wstrzykiwacza do docelowego obszaru soczewki zarodka kurzego.
Następnie wyreguluj źródło światła, aby zapewnić wyraźny view pęcherzyka soczewki. Po upewnieniu się, że mikropipeta znajduje się we właściwym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij od pięciu do 40 nanolitrów materiału wirusowego. Po wstrzyknięciu należy odczekać 45 sekund przed delikatnym wyjęciem mikropipety.
Następnie sprawdź udaną mikroiniekcję, badając barwnik Fast Green w pustym świetle soczewki bez wycieków. Po badaniu uszczelnij otwór skorupki jajka taśmą klejącą i umieść jaja w wilgotnym inkubatorze statycznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Badanie to przedstawia ocenę histologiczną pętli chimerycznej koneksyny 50 i 43 poprzez immunofluorescencję.
Stosując znakowanie antyflagowe, odróżniono koneksyny egzogenne od endogennych. W badaniu oceniono również interakcję między wewnątrzkomórkową domeną pętli koneksyny 50 i akwaporyny zero.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę mikroiniekcji oka embrionalnego kurczaka retrowirusem RCAS, służącą jako narzędzie do badania in situ funkcji i ekspresji białek podczas rozwoju oka. Ta metoda oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi technikami, takimi jak modele transgeniczne, pozwalając na szybkie i dostosowywalne ekspresję egzogennych białek in vivo.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Rozwijanie oka
- Techniki transferu genów
- Badania patologiczne (np. zaćma)
Tło
- Znaczenie badania różnicowania oka i komunikacji komórkowej
- Ograniczenia istniejących metod, takich jak modele transgeniczne i kultury ex vivo
- Potencjał eksploracji celów terapeutycznych dla chorób związanych z okiem
Stosowane metody
- Mikroiniekcja szczepu wirusowego do zarodków kurczaka
- Zastosowanie retrowirusa RCAS(A)
- Technologia mikropipet i mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Udana ekspresja egzogennych białek w komórkach włókien soczewkowych
- Ocenianie dostarczenia szczepu wirusowego i ocena histologiczna
- Wizualizacja interakcji koneksyn za pomocą immunofluorescencji
Wnioski
- Badanie potwierdza skuteczność retrowirusa RCAS w badaniach in vivo rozwoju oka.
- Ta metodologia poprawia rozumienie biologii oka i potencjalnych strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microinjection of recombinant RCAS(A) retrovirus into embryonic chicken lens enables rapid, targeted gene delivery for in situ protein function studies during lens development. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the early discovery stage, particularly for lens biology and disease modeling. The method's specificity and efficiency position it as a valuable tool for portfolio triage and target validation in ocular research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein function and pathway involvement in lens development.
- Supports biological de-risking by confining gene transfer to proliferative lens fiber cells.
- Facilitates functional target validation without reliance on tissue-specific promoters.
- Improves predictive confidence for advancing lens-related therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated embryonic lens systems for downstream phenotypic or mechanistic assays.
- Enables reproducible, quantitative assessment of exogenous protein expression in situ.
- Supports assay standardization by restricting gene delivery to defined cell populations.
- Provides a scalable platform for evaluating candidate gene effects in a developmentally relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying lens pathologies such as cataracts.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of lens-specific targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into lens cell interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection method integrates at the early discovery and target validation stages, bridging basic mechanistic studies with preclinical model development for ocular research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in lens development and disease.
- Screening: Provides assay-ready embryonic lens systems with controlled gene expression.
- Analytics: Enables quantitative immunofluorescence and histological readouts for comparing protein function.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant models for cataract and lens disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a customizable, reusable platform for diverse gene function studies in avian ocular systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lens biology research.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible gene delivery to embryonic lens tissue.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of ocular targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lens-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic manipulation and microinjection techniques.
- Needs access to micropipette pullers, grinders, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization.
- Practical limitations include technical skill requirements and model specificity to avian lens development.
