Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

Przedstawiona metodyka mikroiniekcji retrowirusa RCAS do embrionalnej soczewki kurczaka ma służyć jako narzędzie do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, retrowirus ptaków kompetentny do replikacji RCAS zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów.

Istnieje znaczny potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju soczewek, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do dalszego odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma. Aby rozpocząć, przymocuj kapilarnę ze szkła borokrzemianowego do gumowych, wyściełanych klipsów w ręcznym pionowym ściągaczu do mikropipet. Ustaw temperaturę grzania ściągacza do mikropipet na 950 stopni Celsjusza i wykonaj wstępne wyciąganie, aby uzyskać cieńszą i bardziej miękką szklaną kapilarę.

Następnie ustaw temperaturę grzania na 790 stopni Celsjusza i wykonaj wtórne ciągnięcie, aby wyprodukować końcowe mikropipety. Za pomocą młynka do mikropipet ostrożnie naostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej 11 mikrometrów. Następnie umieść mikropipety w gąbczastej podkładce zaciskowej wewnątrz szklanego słoika.

Wysiaduj zapłodnione jaja kurze do stadium rozwoju 18 w wilgotnym inkubatorze na biegunach o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dokładnie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem. Po rozwinięciu wyjmij jaja z inkubatora.

Spryskaj jajka 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie umieść jajko na uchwycie na jajka większym końcem skierowanym do góry. Za pomocą ostrych kleszczy zębatych ostrożnie postukaj w większy koniec skorupki jajka, aby utworzyć otwór o średnicy dwóch centymetrów.

Następnie usuń fragmenty skorupki jajka. Umieść komórkę jajową na stoliku mikroskopu preparacyjnego i zlokalizuj zarodek. Następnie za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych i nożyczek odetnij błonę owodniową pokrywającą górną część zarodka.

Następnie umieść 60-milimetrową szalkę Petriego nad otworem jajka. Na początek rozmrozić zapas RCAS(A)retrovirus na lodzie. Aby uniknąć zatkania mikropipety, odwirować roztwór o sile 10 000 G przez 10 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki, utrzymując roztwory na lodzie.

Umieścić rozciągnięty parafilm laboratoryjny na naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 35 na 10 milimetrów i dodać jeden mikrolitr sterylnego PBS do parafilmu. Podłączyć przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego picowtryskiwacza. Naciśnij przycisk Fill Mode (Tryb napełniania), aby napełnić PBS do mikropipety, a następnie naciśnij przycisk Inject Mode (Tryb wstrzykiwania), aby przetestować przydzielony jeden mikrolitr cieczy.

Umieść drugi kawałek rozciągniętego parafilmu laboratoryjnego na nowej naczyniu do hodowli komórkowej i dodaj jeden mikrolitr szybko zabarwionego na zielono materiału wirusowego do folii. Opuść końcówkę mikropipety do materiału wirusowego i naciśnij przycisk Tryb napełniania, aby napełnić mikropipetę jednym mikrolitrem materiału wirusowego. Pod mikroskopem preparacyjnym opuścić napełnioną mikropipetę podłączoną do automatycznego wstrzykiwacza do docelowego obszaru soczewki zarodka kurzego.

Następnie wyreguluj źródło światła, aby zapewnić wyraźny view pęcherzyka soczewki. Po upewnieniu się, że mikropipeta znajduje się we właściwym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij od pięciu do 40 nanolitrów materiału wirusowego. Po wstrzyknięciu należy odczekać 45 sekund przed delikatnym wyjęciem mikropipety.

Następnie sprawdź udaną mikroiniekcję, badając barwnik Fast Green w pustym świetle soczewki bez wycieków. Po badaniu uszczelnij otwór skorupki jajka taśmą klejącą i umieść jaja w wilgotnym inkubatorze statycznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Badanie to przedstawia ocenę histologiczną pętli chimerycznej koneksyny 50 i 43 poprzez immunofluorescencję.

Stosując znakowanie antyflagowe, odróżniono koneksyny egzogenne od endogennych. W badaniu oceniono również interakcję między wewnątrzkomórkową domeną pętli koneksyny 50 i akwaporyny zero.