Name: Samouczek analizy obliczeniowej dla chimerycznego małego niekodującego RNA: docelowe biblioteki sekwencjonowania RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj instalację i analizę danych sekwencjonowania RNA z wykorzystaniem pipeline'u SCRAP. Metoda umożliwia identyfikację interakcji miRNA z regionami intronowymi w badaniach bioinformatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Meffert za pomocne dyskusje, w tym BH Powellowi i WT Mills IV, za krytyczne opinie na temat opisu instalacji i realizacji rurociągu. Praca ta została wsparta nagrodą Fundacji Braude'a, programem uruchomienia funduszu badawczego komórek macierzystych w stanie Maryland, nagrodą Blaustein Endowment for Pain Research and Education oraz RO1MH129292 NINDS RO1NS103974 i NIMH dla M.K.M.

UWAGA: Protokół rozpocznie się od pobrania i zainstalowania oprogramowania wymaganego do analizy chimerycznych bibliotek sekwencjonowania RNA za pomocą SCRAP.
1. Instalacja
<ol>
	<li>Przed zainstalowaniem SCRAP zainstaluj zależności Git i Miniconda na maszynie, która ma być używana do analiz. Prawdopodobnie usługa Git jest już zainstalowana. Na przykład na platformie Mac OSX sprawdź to za pomocą narzędzia which git, aby zobaczyć, czy narzędzie "git" jest obecne i zainstalowane w tym katalogu. Sprawdź, czy Miniconda jest zainstalowana przy użyciu której kondy. Jeśli nic nie zostanie zwrócone, zainstaluj Minicondę. Miniconda wymaga 400 MB miejsca na dysku do zainstalowania.
	<ol>
		<li>Istnieje kilka metod instalacji Minicondy i różnią się one w zależności od platformy. Zapoznaj się z plikiem markdown PLATFORM-SETUP w repozytorium GitHub Meffert Lab [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md], gdzie znajdują się dalsze instrukcje dotyczące instalacji w systemach Windows, MacOS i Ubuntu. Dla użytkowników Linuksa Linux ma własnego domyślnego menedżera pakietów (apt). W przypadku specyficznym dla tego badania użyj polecenia brew install Miniconda, aby zainstalować Miniconda przy użyciu istniejącego menedżera pakietów, brew. 
		UWAGA: "Homebrew", określany jako "brew", to system zarządzania pakietami oprogramowania typu open source, który upraszcza instalację oprogramowania w systemie operacyjnym Apple, macOS.</li>
		<li>Jeśli conda jest instalowana po raz pierwszy, uruchom polecenie conda init dla konkretnej powłoki, która jest używana. W tym przykładzie tą używaną powłoką jest zsh. Następnie zamknij i ponownie otwórz skorupę. Jeśli conda została pomyślnie zainstalowana, zostanie wyświetlone środowisko podstawowe aktywowane w sesji terminalu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz źródło SCRAP i zainstaluj jego zależności.
	<ol>
		<li>Preferowaną metodą uzyskania źródła SCRAP jest użycie Git. Uzyskaj dostęp do tego, uruchamiając polecenie git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP w celu uzyskania najnowszej kopii kodu źródłowego.</li>
		<li>Zainstaluj mambę, ulepszony program do rozwiązywania pakietów dla conda, i zainstaluj wszystkie zależności dla SCRAP z SCRAP_environment.yml do własnego środowiska conda przy użyciu następujących poleceń: 
		conda install -n base conda-forge::mamba 
		mamba env create -f ZŁOM/SCRAP_environment.yml -n ZŁOM</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie uruchom instalację referencyjną dla programu SCRAP. Argumenty użyte w instalacji referencyjnej będą specyficzne dla organizmu, którego interakcje sncRNA-mRNA są analizowane. 
	bash ZŁOM/bin/Reference_Installation.sh -r pełny/ścieżka/do/ZŁOMU/ -m ma -g hg38 -s człowiek
	<ol>
		<li>Podaj katalog folderu źródłowego SCRAP do instalacji referencyjnej. Kroki instalacji zostaną następnie wykonane przy użyciu plików w folderach fasta i adnotacji. Podaj pełną ścieżkę bez żadnych skrótów. Zakończ ukośnikiem.</li>
		<li>Zapoznaj się z tabelami w README.md, aby uzyskać prawidłowe skróty gatunków miRbase. Aktualne genomy referencyjne można znaleźć na https://genome.ucsc.edu/ lub https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/. W tym przykładzie hg38 zostanie użyty do genomu myszy GRCm38.</li>
		<li>Obecnie uwzględnione gatunki do adnotacji to człowiek, mysz i robak. Wyświetl odpowiednie pliki species.annotation.bed w katalogu adnotacji w folderze źródłowym SCRAP. Jeśli pożądane jest użycie innego gatunku do analizy, należy dostarczyć plik annotation.bed, który jest zgodny z tym samym schematem nazewnictwa species.annotation.bed.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uruchamianie ZŁOMU
<ol>
	<li>Teraz, gdy zależności i SCRAP są zainstalowane, uruchom skrypt SCRAP.sh 
	bash ZŁOM/bin/SCRAP.sh -d pełny/ścieżka/do/CLASH_Human/ -a pełna/ścieżka/do/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p nie -f tak -r pełna/ścieżka/do/ZŁOMU/ -m ma -g hg38
	<ol>
		<li>Wyświetl całą ścieżkę do przykładowych katalogów bez żadnych skrótów. Sformatuj przykładowe katalogi z nazwą folderu dokładnie zgodną z nazwą przykładu, jak pokazano w Rysunek 1.</li>
		<li>Należy zauważyć, że podana ścieżka jest ścieżką do katalogu, który zawiera wszystkie foldery przykładowe, a nie ścieżką do pojedynczego folderu przykładowego lub przykładowego pliku (zapoznaj się z wierszem polecenia w kroku 2.1).</li>
		<li>Następnie wyświetl całą ścieżkę do pliku adaptera. Upewnij się, że przykładowe nazwy w pliku adaptera są zgodne z wcześniej wymienionymi nazwami folderów i nazwami plików (zapoznaj się z wierszem poleceń w kroku 2.1).</li>
		<li>Należy wskazać, czy próbki są sparowane i czy zostanie przeprowadzone filtrowanie pod kątem pre-miRNA i/lub tRNA. W razie potrzeby dodaj filtr do czyszczenia rRNA (patrz wiersz poleceń w kroku 2.1). 
		UWAGA: Użytkownicy mogą, ale nie muszą, zdecydować się na użycie tych filtrów w zależności od typów próbek i celów eksperymentu. W zależności od projektu eksperymentalnego, pre-miRNA, tRNA i rRNA mogą zużywać dostępną głębokość sekwencjonowania dla prawdziwych chimer sncRNA:target RNA, a użytkownicy mogą zastosować filtry, aby je wykluczyć. Jednak użytkownicy mogą chcieć uniknąć takiego filtrowania w pewnych okolicznościach (np. mapowanie celów sncRNA do genomu mitochondrialnego, który zawiera mitochondrialne rRNA).</li>
		<li>Następnie podaj całą ścieżkę do katalogu referencyjnego, skrót miRbase i skrót genomu referencyjnego (patrz wiersz poleceń w kroku 2.1). 
		UWAGA: Wykonanie skryptu może potrwać kilka godzin, w zależności od rozmiaru zestawu danych i procesora używanego komputera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wywołanie szczytu i adnotacja
<ol>
	<li>Po zakończeniu działania narzędzia SCRAP sprawdź, czy dane wyjściowe zawierają, między innymi, plik SAMPLE.aligned.unique.bam. Jest to plik binarny zawierający dopasowania docelowych RNA do genomu referencyjnego dostarczonego przez użytkownika.</li>
	<li>Teraz wykonaj wywołanie szczytowe, uruchamiając polecenie Peak_Calling.sh. 
	bash ZŁOM/bin/Peak_Calling.sh -d CLASH_Human/ -a CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f nie -r ZŁOM/ -m ma -g hg38 
	UWAGA: Wywoływanie pików jest cechą SCRAP, która została zaprojektowana, aby umożliwić naukowcom łatwą ocenę najbardziej niezawodnych i powtarzalnych oddziaływań małe niekodujące RNA: docelowe RNA w ich chimerycznych bibliotekach RNA. Ta funkcja, na przykład, może pomóc badaczom w identyfikowaniu interakcji, które mogą chcieć wybrać do dalszych badań. Krok 3.2.2 poniżej opisuje, w jaki sposób użytkownik ustawia kryteria, które mają być używane do definiowania rygorystyczności, z jaką wywoływany jest szczyt - obejmuje to liczbę unikalnych interakcji lub odczytów sekwencjonowania, które musiały wystąpić, aby szczyt został wywołany, a także liczbę bibliotek, w których ta konkretna interakcja musiała wystąpić.
	<ol>
		<li>Ponownie wyświetl pełne ścieżki do katalogu zawierającego przykładowe foldery i plik adaptera (zapoznaj się z wierszem poleceń w kroku 3.2).</li>
		<li>Następnie ustaw minimalną liczbę odczytów sekwencjonowania wymaganą do wywołania piku (patrz wiersz poleceń w kroku 3.2).</li>
		<li>Ustaw minimalną liczbę odrębnych bibliotek sekwencjonowania, które muszą zawierać szczyt, aby można było je wywołać (patrz wiersz polecenia w kroku 3.2). 
		UWAGA: Wybór wartości zarówno dla ppkt 3.2.2, jak i 3.2.3 będzie zależał od charakteru sekwencjonowanych próbek oraz liczby próbek lub typów próbek. W tym przypadku wymagane są co najmniej 3 odczyty sekwencjonowania chimerycznego w próbce, aby wywołać pik, a pik musi być obsługiwany przez co najmniej 2 próbki. Badacz oceniający zestaw danych, w którym istnieje wiele replik biblioteki sekwencjonowania dla danego warunku, może na przykład zdecydować o wymaganiu obecności odczytów w większej liczbie bibliotek sekwencjonowania próbek.</li>
		<li>Należy wskazać, czy sncRNA z tej samej rodziny muszą przyczyniać się do tego samego piku. Na przykład, ponieważ miRNA z tej samej rodziny mają wspólne sekwencje nasienne, te miRNA mogą wiązać wspólne i nakładające się zestawy celów genowych; Użytkownik może chcieć zidentyfikować pełny wpływ rodziny na te cele, oceniając ich zbiorowe wartości szczytowe (patrz wiersz poleceń w kroku 3.2).</li>
		<li>Następnie wskaż pełną ścieżkę do katalogu referencyjnego, skrót miRBase i skrót genomu referencyjnego (patrz wiersz poleceń w kroku 3.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu wywoływania szczytowego uruchom polecenie peak annotation. 
	bash ZŁOM/bin/Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human/szczyty.bed -r ZŁOM/ -s człowiek
	<ol>
		<li>Podaje pełną ścieżkę do wynikowego pliku peaks.bed (lub peaks.family.bed) z wywołania szczytu, pełną ścieżkę do katalogu referencyjnego i żądane gatunki do adnotacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wizualizacja danych
UWAGA: Wszystkie kroki do analizy za pomocą SCRAP zostały zakończone. Do wizualizacji danych zalecanych jest kilka podejść:
<ol>
	<li>Scal wszystkie pliki .bam (binarny plik SAM), które będą pożądane do wizualizacji razem (scalanie samtools).</li>
	<li>Posortuj wynikowy scalony plik .bam (sortowanie samtools). Zawartość pliku jest sortowana wiersz po wierszu, tak aby samtools mógł się indeksować.</li>
	<li>Indeksowanie posortowanego pliku .bam (indeks samtools). Plik BAI (binarny indeks formatu samtools) jest generowany w celu umożliwienia wizualizacji w przeglądarce genomiki integracyjnej (IGV).</li>
	<li>Na koniec otwórz wynikowy posortowany plik .bam i zindeksowany plik .bai w IGV. 
	UWAGA: SncRNA: Docelowe interakcje RNA będące przedmiotem zainteresowania mogą być traktowane priorytetowo do obserwacji na wiele sposobów specyficznych dla badania. Jednym z ogólnych podejść początkowych jest ocena interakcji, dla których piki są wspierane przez najbardziej chimeryczne odczyty sekwencjonowania. Interesujące interakcje można również wizualizować za pomocą serwera WWW DuplexFold z pakietu RNAstructure, wprowadzając sekwencję zarówno dla sncRNA, jak i docelowego RNA z wykrytej interakcji11. Dla każdego piku chromosom (pierwsza kolumna) i współrzędne genomowe (początek: 1. kolumna, koniec: 2. kolumna) można znaleźć w pliku peaks.bed.species.annotation.txt wygenerowanym w adnotacji piku. W szczególności w przypadku miRNA, podczas gdy powtarzalne i funkcjonalne interakcje mogą nie mieć rozległego wiązania dopasowanego do nasion (np. interakcje mogą wykorzystywać wiązanie kompensacyjne 3'), obecność miejsc dopasowanych do nasion w pokrewnym motywie wiązania docelowego RNA może być jednak oceniona jako cecha potwierdzająca funkcjonalnie ważne wykryte interakcje4,12. Przetwarzanie danych pomocniczych może obejmować porównanie zróżnicowanego pokrycia odczytem między pikami w różnych warunkach biologicznych oraz potencjalną ocenę grupowania regulowanych genów w szlaki przy użyciu narzędzia do analizy szlaków.</li>
</ol>

In Vivo RNA: RNA Interactions Using the SCRAP Bioinformatics Pipeline

<ol><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+noncoding+RNAs+of+local+translation%2C+injury+responses%2C+and+pain+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain+%28Cambridge%2C+Mass.%29%22%5BJournal%5D)">Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system.</a> Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119(2023).</li>
<li>Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+expanding+universe+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the expanding universe of small RNAs.</a> Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+beyond+the+seed+supports+microRNA+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity.</a> Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).</li>
<li>Grosswendt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+identification+of+miRNA%3Atarget+site+interactions+by+different+types+of+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions.</a> Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).</li>
<li>Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCRAP%3A+a+bioinformatic+pipeline+for+the+analysis+of+small+chimeric+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data.</a> RNA. 29 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+human+miRNA+interactome+by+CLASH+reveals+frequent+noncanonical+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding.</a> Cell. 153 (3), 654-665 (2013).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Bjerke, G. A., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+directly+captured+microRNA+targets+reveals+the+impact+of+microRNAs+on+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome.</a> RNA. 26 (3), 306-323 (2020).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-target+chimeras+reveal+miRNA+3%E2%80%B2-end+pairing+as+a+major+determinant+of+Argonaute+target+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity.</a> Nature Communications. 6 (1), 8864(2015).</li>
<li>Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyb%3A+a+bioinformatics+pipeline+for+the+analysis+of+CLASH+%28crosslinking%2C+ligation+and+sequencing+of+hybrids%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data.</a> Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół dotyczący wykorzystania potoku SCRAP do analizy interakcji sncRNA:target RNA ma na celu pomóc badaczom, którzy rozpoczynają analizę obliczeniową. Oczekuje się, że ukończenie samouczka poprowadzi badaczy z doświadczeniem obliczeniowym na poziomie podstawowym lub wyższym przez kroki wymagane do instalacji i użytkowania tego potoku i jego aplikacji do analizy danych uzyskanych z chimerycznych bibliotek sekwencjonowania RNA. Kroki kluczowe dla ukończenia tego protokołu obejmują poprawną instalację referencyjną i...

Małe niekodujące RNA są dokładnie badane pod kątem ich potranskrypcyjnej roli w koordynowaniu ekspresji z zestawów genów w różnych procesach, takich jak różnicowanie i rozwój, przetwarzanie sygnałów i choroby1,2,3. Możliwość dokładnego określenia docelowych transkryptów małych niekodujących RNA (sncRNA) regulatorowych genowo, w tym mikroRNA (miRNA), ma znaczenie dla badań biologii RNA zarówno na poziomie podstawowym, jak i translacyjnym. Algorytmy bioinformatyczne, które wykorzystują przewidywaną komplementarność między sekwencją nasienną miRNA a jej potencjalnymi celami, były często wykorzystywane do przewidywania interakcji miRNA-target RNA. Chociaż te algorytmy bioinformatyczne odniosły sukces, mogą również zawierać zarówno wyniki fałszywie dodatnie, jak i fałszywie ujemne, co zostało omówione w innym miejscu4,5,6. Ostatnio zaprojektowano i wdrożono kilka podejść biochemicznych, które umożliwiają jednoznaczne i półilościowe określenie in vivo oddziaływań sncRNA:target RNA poprzez sieciowanie in vivo i wynikające z tego włączenie etapu ligacji w celu fizycznego przyłączenia sncRNA do celu, aby utworzyć pojedynczy chimeryczny RNA4,5,7,8,9,10. Późniejsze przygotowanie bibliotek sekwencjonowania z chimerycznych RNA pozwala na ocenę oddziaływań sncRNA:target RNA poprzez obliczeniowe przetwarzanie danych sekwencjonowania. Ten film zawiera samouczek dotyczący instalacji i korzystania z potoku obliczeniowego określanego jako mały chimeryczny potok analizy RNA (SCRAP), który został zaprojektowany, aby umożliwić solidną i powtarzalną analizę interakcji sncRNA:target RNA z chimerycznych bibliotek sekwencjonowania RNA6.
Celem tego samouczka jest pomoc badaczom w unikaniu nadmiernego polegania na czysto predykcyjnych algorytmach bioinformatycznych poprzez obniżenie barier w analizie danych generowanych za pomocą metod biochemicznych dostarczających chimerycznych odczytów molekularnych interakcji sncRNA:docelowe RNA. Ten samouczek zawiera praktyczne kroki i wskazówki, które pomogą początkującym naukowcom obliczeniowym przejść przez korzystanie z potoku SCRAP, opracowanego do analizy danych sekwencjonowania chimerycznego RNA, które mogą być generowane przez kilka istniejących protokołów biochemicznych, w tym sieciowanie, ligację i sekwencjonowanie hybryd (CLASH) oraz kowalencyjną ligację endogennych RNA związanych z argonautą - sieciowanie i immunoprecypitacja (CLEAR-CLIP)7,9.
Użycie SCRAP oferuje kilka zalet do analizy danych sekwencjonowania chimerycznego RNA, w porównaniu z innymi potokami obliczeniowymi6. Jedną z istotnych zalet jest obszerna adnotacja i włączenie wezwań do dobrze obsługiwanych i rutynowo aktualizowanych skryptów bioinformatycznych w ramach rurociągu, w porównaniu z alternatywnymi potokami, które często polegają na niestandardowych i/lub nieobsługiwanych skryptach dla kroków w rurociągu. Ta funkcja nadaje stabilność SCRAP, dzięki czemu badacze powinni zapoznać się z potokiem i włączyć jego użycie do swojego przepływu pracy. Wykazano również, że SCRAP przewyższa alternatywne potoki w wywoływaniu pików interakcji sncRNA:target RNA i ma funkcjonalność międzyplatformową, jak szczegółowo opisano we wcześniejszej publikacji6.
Pod koniec tego poradnika użytkownicy będą mogli (i) znać wymagania platformy dla SCRAP i instalować potoki SCRAP, (ii) instalować genomy referencyjne i ustawiać parametry wiersza poleceń dla SCRAP, oraz (iii) zrozumieć kryteria wywoływania szczytów oraz wykonywać wywołania szczytowe i adnotacje szczytowe.
Ten film opisze w praktycznych szczegółach, jak badacze badający biologię RNA mogą zainstalować i optymalnie wykorzystać potok obliczeniowy, SCRAP, do analizy interakcji sncRNA z docelowymi RNA, takimi jak informacyjne RNA, w chimerycznych danych sekwencjonowania RNA, uzyskanych za pomocą jednego z omawianych biochemicznych podejść do przygotowania biblioteki sekwencjonowania.
SCRAP to narzędzie wiersza poleceń. Ogólnie rzecz biorąc, postępując zgodnie z poniższym przewodnikiem, użytkownik będzie musiał (i) pobrać i zainstalować SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP), (ii) zainstalować genomy referencyjne i uruchomić SCRAP oraz (iii) wykonać wywołanie i adnotację szczytu.
Więcej szczegółów na temat kroków obliczeniowych w tej procedurze można znaleźć na stronie https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. W tym artykule przedstawiono konfigurację i podstawowe informacje, które umożliwią badaczom z podstawowymi umiejętnościami obliczeniowymi instalację, optymalizację i używanie SCRAP w zestawach danych biblioteki sekwencjonowania chimerycznego RNA.

<table><tbody><tr><td>Genomes</td><td>UCSC Przeglądarka genomu</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://genome.ucsc.edu/ lub https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/</td></tr> <tr><td>Linux</td>, <td>Linux</td><td>, Ubuntu 20.04 lub 22.04 LTS, zalecane</td><td></td></tr><tr>,<td>Mac,</td><td>Apple,</td><td>Mac OSX (>11)</td><td></td></tr><tr><td>Konfiguracja platformy</td><td>: GitHub</td>, <td>nie dotyczy</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md]</td></tr><tr><td>Potok ZŁOMU</td><td>GitHub</td><td>N/A</td><td>https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP</td></tr><tr><td>Powłoka Unix</td><td>System operacyjny</td><td>Unix bash >=5.0</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka Unix</td><td>System operacyjny Unix</td><td>zsh (zalecane 5.9)</td><td></td></tr><tr><td>Windows</td><td></td><td>Windows WSL Ubuntu 20.04 lub 22.04 LTS</td><td></td></tr></tbody></table>

samouczek analizy obliczeniowej dla chimerycznego małego niekodującego rna: docelowe biblioteki sekwencjonowania rna

Computational Analysis Tutorial for Chimeric Small Noncoding RNA: Target RNA Sequencing Libraries

Zrozumienie in vivo interakcji regulacyjnych genów małych niekodujących RNA (sncRNA), takich jak mikroRNA (miRNA), z ich docelowymi RNA, zostało w ostatnich latach rozwinięte dzięki metodom biochemicznym, które wykorzystują sieciowanie, a następnie ligację do wychwytywania interakcji sncRNA:docelowe RNA poprzez tworzenie chimerycznych RNA i późniejsze biblioteki sekwencjonowania. Podczas gdy zestawy danych z chimerycznego sekwencjonowania RNA dostarczają danych wejściowych obejmujących cały genom i są znacznie mniej niejednoznaczne niż oprogramowanie do przewidywania miRNA, przekształcenie tych danych w znaczące i użyteczne informacje wymaga dodatkowych analiz i może zniechęcić badaczy pozbawionych zaplecza obliczeniowego. Ten raport zawiera samouczek, który ma pomóc początkującym biologom obliczeniowym w instalowaniu i stosowaniu najnowszego narzędzia programowego typu open source: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Przedstawiono wymagania dotyczące platformy, aktualizacje oraz wyjaśnienie kroków potoku i manipulowania kluczowymi zmiennymi wejściowymi użytkownika. Zmniejszenie bariery dla biologów w uzyskiwaniu wglądu w chimeryczne podejścia do sekwencjonowania RNA może potencjalnie stać się trampoliną do opartych na odkryciach badań nad interakcjami regulatorowymi sncRNA: docelowe RNA w wielu kontekstach biologicznych.

Wyniki dla par sncRNA:RNA docelowe wykryte za pomocą zmodyfikowanej wersji metody SCRAP (SCRAP wersja 2.0, w której zaimplementowano modyfikacje służące do filtrowania rRNA) w wcześniej opublikowanych zbiorach danych z sekwencjonowania przygotowanych metodą CLEAR-CLIP9 przedstawiono na Rysunek 2 i Tabela 1Użytkownicy mogą zauważyć spadek względnej frakcji oddziaływań miRNA z regionami intronowymi, który następuje po wyizolowaniu oddziaływań o wysokim ...

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący instalację i wykorzystanie potoku bioinformatycznego do analizy danych sekwencjonowania chimerycznego RNA używanych w badaniach in vivo interakcji RNA:RNA.

Samouczek analizy obliczeniowej dla chimerycznego małego niekodującego RNA: docelowe biblioteki sekwencjonowania RNA

An understanding of the in vivo gene regulatory interactions of small noncoding RNAs (sncRNAs), such as microRNAs (miRNAs), with their target RNAs has ...

Protokół ten obejmuje instalację i praktyczne kroki korzystania z potoku obliczeniowego przeznaczonego do analizy danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z chimerycznego niekodującego RNA, docelowych interakcji RNA. Strategia molekularna tworzenia chimerycznych RNA jest stosunkowo nowym osiągnięciem, które ma zalety w porównaniu z wcześniejszymi bioinformatycznymi narzędziami predykcyjnymi w jednoznacznym zrozumieniu krajobrazu interakcji niekodującego RNA w całym genomie. Dane sekwencjonowania wygenerowane w wyniku wysokoprzepustowego sekwencjonowania chimerycznych RNA mogą stanowić wyzwanie analityczne dla nowych użytkowników tej strategii.Ustanowiliśmy wieloplatformowy potok obliczeniowy o otwartym kodzie źródłowym, który jest wysoce opatrzony adnotacjami, aby umożliwić użytkownikom na poziomie podstawowym analizowanie danych z eksperymentów z sekwencjonowaniem chimerycznego niekodującego RNA, docelowego RNA. W przyszłych eksperymentach Meffert-Lab planuje wykorzystać analizę obliczeniową za pomocą SCRAP na zestawach danych wygenerowanych w wyniku naszych trwających badań oraz do regulacji posttranskrypcyjnej w układzie nerwowym ssaków, a także utrzymać aktualizację SCRAP na naszym GitHubie. Przed rozpoczęciem instalacji SCRAP na platformie Mac OS X wykonaj polecenie, które git, w terminalu, aby potwierdzić istnienie Git.Aby sprawdzić instalację Miniconda, wpisz which conda w terminalu. Aby zainstalować Miniconda, zapoznaj się z plikiem markdown platformy SETUP w repozytorium GitHub Meffert-Lab, aby uzyskać instrukcje dotyczące instalacji w systemach Windows, MacOS i Ubuntu. W przypadku systemów Mac, korzystając z Menedżera pakietów Home Brew, użyj polecenia, brew install miniconda, aby zainstalować Miniconda.Aby zainstalować Conda, uruchom, conda init, określając używaną powłokę, a następnie zamknij i ponownie otwórz powłokę. Pomyślna instalacja powoduje wyświetlenie środowiska podstawowego aktywowanego w sesji terminalu. Następnie uruchom wskazany klon git, aby uzyskać najnowszą kopię kodu źródłowego SCRAP.Zainstaluj Mambę, ulepszony program do rozwiązywania pakietów dla Conda. Za pomocą następującego polecenia zainstaluj wszystkie zależności dla SCRAP z SCRAP_environment. yml do własnego środowiska Conda.Następnie należy użyć wskazanego skryptu bash specyficznego dla organizmu, którego oddziaływania sncRNA, mRNA są analizowane pod kątem SCRAP. Podaj katalog folderu źródłowego SCRAP i wykonaj kroki instalacji, używając plików w folderach fasta i adnotacji. Upewnij się, że ścieżka katalogu jest kompletna i kończy się ukośnikiem.Zapoznaj się z tabelami w pliku readme. md w celu uzyskania prawidłowych skrótów gatunków opartych na Mir. Aby uzyskać zaktualizowany genom referencyjny, użyj przeglądarki genomu UCSC lub NCBI Genome Data Hub.Sprawdź odpowiednie species.annotation. bed files w katalogu adnotacji w folderze źródłowym SCRAP. Jeśli zachodzi potrzeba przeanalizowania innego gatunku, należy dostarczyć wskazany plik.Po zainstalowaniu zależności i SCRAP należy użyć wskazanego skryptu, aby zainicjować analizę SCRAP z określoną strukturą poleceń. Wyświetl pełną ścieżkę do przykładowych katalogów bez żadnego skrótu i sformatuj przykładowe katalogi z nazwą folderu zgodną z nazwą przykładu. Podkreśl, że podana ścieżka prowadzi do katalogu zawierającego wszystkie przykładowe foldery, a nie do pojedynczego przykładowego folderu lub pliku.Następnie wyświetl całą ścieżkę do pliku adaptera. Sprawdź, czy przykładowe nazwy w pliku adaptera są zgodne z wcześniej wymienionymi nazwami folderów i nazwami plików. Określ typ próbki, sparowany koniec lub pojedynczy koniec, i określ wybór filtrów RNA dla pre miRNA, tRNA i opcjonalnie czyszczenia RNA.Wymień całą ścieżkę do katalogu referencyjnego, skrót miRBazy i skrót genomu referencyjnego. Po uruchomieniu SCRAP użyj wskazanego polecenia skryptu, aby wykonać Peak_Calling. Wyświetla listę pełnych ścieżek do katalogu zawierającego przykładowe foldery i plik karty.Następnie zdefiniuj kryteria Peak_Calling, w tym minimalną liczbę odczytów sekwencjonowania oraz liczbę odrębnych bibliotek sekwencjonowania potrzebnych do rozpoznania szczytu. Należy wskazać, czy do pików muszą przyczyniać się sncRNA z tej samej rodziny, co jest istotne dla miRNA, które mają wspólne sekwencje nasienne i mogą wiązać się z nakładającymi się celami genów. Następnie wskaż pełną ścieżkę do katalogu referencyjnego, skrót miRBase i skrót genomu referencyjnego.Po Peak_Calling uruchom skrypt Peak_Annotation. Podaj pełną ścieżkę do wynikowych szczytów. łóżko od Peak_Calling do katalogu referencyjnego i żądanego gatunku do adnotacji.Użyj scalania samtools, aby scalić wszystkie żądane pliki BAM, aby ułatwić połączoną wizualizację. Następnie użyj sortowania samtools do sortowania scalonych wierszy po wierszu. Plik BAM.Indeksowanie posortowanego. Plik BAM przy użyciu indeksu Samtools, generując binarny plik indeksu w formacie Samtools, wymagany dla narzędzi do wizualizacji genomu. Na koniec w przeglądarce Integrative Genomics Viewer otwórz posortowane.bam i indeksowane. według pliku. Zastosowanie zmodyfikowanej wersji SCRAP do wcześniej opublikowanych zestawów danych sekwencjonowania ujawniło spadek interakcji miRNA z regionami intronów.Zmniejszenie zaobserwowano po wyizolowaniu interakcji o wysokim poziomie ufności za pomocą Peak_Calling za pomocą SCRAP.

computational-analysis-tutorial-for-chimeric-small-noncoding-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Poznaj instalację i analizę danych sekwencjonowania RNA z wykorzystaniem pipeline'u SCRAP. Metoda umożliwia identyfikację interakcji miRNA z regionami intronowymi w badaniach bioinformatycznych.

Samouczek analizy obliczeniowej dla chimerycznego małego niekodującego RNA: docelowe biblioteki sekwencjonowania RNA

Przeglądaj więcej filmów