Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Naszym celem jest określenie mechanizmów molekularnych, które ustanawiają skomplikowaną architekturę soczewek oraz tego, jak ta ugruntowana architektura reguluje funkcję soczewki w zakresie przezroczystości i zmiany kształtu soczewki. Aby posunąć naprzód badania w naszej dziedzinie, stosujemy nowe metody obrazowania, które pozwalają nam na wizualizację cech soczewki z wysoką rozdzielczością przestrzenną, a to z kolei pozwala na ilościową analizę obrazu struktur soczewki i cech komórkowych. Obrazowanie z mocowaniem hormonalnym jest korzystniejsze w porównaniu z wizualizacją skrawków tkanek lub procedurami montażu płaskiego, ponieważ umożliwia zachowanie całej struktury tkanki 3D.

Pozwala nam to na przeprowadzenie dogłębnego badania morfometrycznego i kwantyfikację natywnej struktury soczewki. Soczewka jest zintegrowaną tkanką biologiczną o wyspecjalizowanych funkcjach, które opierają się na zależnej od lokalizacji i głębokości geometrii komórek i powiązanych z nimi struktur. Wykorzystanie zademonstrowanych protokołów obrazowania i metod kwantyfikacji pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ustalane są struktury soczewek i złożona organizacja soczewki.

Rozpocznij procedurę od stworzenia wgłębień unieruchamiających w agarozie. Aby to zrobić, podgrzej i wymieszaj 2% agarozę w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż roztwór się upłynni. Odpipetować 250 mikrolitrów skroplonej agarozy do naczynia ze szklanym dnem.

I za pomocą elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego spłaszcz agarozę na naczyniu. Gdy agaroza ostygnie i całkowicie zastygnie, użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie za pomocą trzymilimetrowego dziurkacza do biopsji utwórz otwór w agarozie na środku naczynia.

Za pomocą delikatnej chusteczki roboczej usuń nadmiar agarozy. Przechowuj pleśń agarozową uwodnioną PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przed zamontowaniem izolowanej soczewki okularowej Mirion należy dodać dwa mililitry odpowiedniego podłoża do przygotowanej formy agarozowej w zależności od rodzaju soczewki.

Za pomocą kleszczyków do zarodków delikatnie przenieś żywą soczewkę fix store do wgłębienia w agarozie. Następnie umieść naczynie na odwróconym stoliku mikroskopowym. Upewnij się, że soczewka znajduje się w przedniej części skierowanej w stronę obiektywu, wizualizując barwienie jąder.

Jeśli nie zaobserwuje się żadnych jąder, użyj zakrzywionych kleszczyków, aby delikatnie obrócić soczewkę o około 180 stopni, tak aby przedni obszar był skierowany w stronę obiektywu. Następnie przystąp do pozyskiwania obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby wyświetlić kapsułki z soczewkami, uzyskaj obrazy stosu Z za pomocą obiektywu 40X o rozmiarze kroku 0,3 mikrona.

Uzyskaj pierwszy obraz przed powierzchnią torebki soczewki wskazywaną przez barwienie WGA i ostatni obraz po wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka. Aby uwidocznić komórki nabłonkowe, należy uzyskać obrazy stosu Z za pomocą obiektywu 63X o rozmiarze kroku 0,3 mikrona. Rozpocznij całe przygotowanie mocowania soczewki stałej od utworzenia unieruchamiających klinów agarozowych.

Aby to zrobić, weź naczynie ze szklanym dnem i wlej do niego około pięciu do sześciu mililitrów stopionej 2% agarozy w PBS. Poczekaj, aż agaroza zastygnie. Następnie za pomocą ostrego ostrza utwórz trójkątne wgłębienie w zestalonej agarozie.

Usuń ćwiartkę agarozy i dodaj jeden mililitr PBS do naczynia. Odessać resztki agarozy pozostawione po krojeniu. Utwórz wiele klinów w jednym naczyniu, aby w razie potrzeby dopasować je do wielu soczewek.

Aby przechowywać formę, dodaj do niej jeden mililitr PBS przed utrzymaniem jej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść soczewkę w klinu agarozy zawierającym jeden mililitr PBS. Ustaw soczewkę tak, aby obszar równikowy był skierowany w dół na szkło mikroskopu, gdy jest umieszczony nad obiektywem konfokalnym.

Umieść naczynie na stoliku mikroskopu. Aby potwierdzić, że obszar równikowy jest ostry, wizualizuj jądra, upewniając się, że są wyrównane w rzędach. Sprawdź również nieregularnie upakowane i ukształtowane komórki nabłonka równikowego oraz precyzyjnie wyrównane i sześciokątne komórki rzędu meridianów, na które wskazuje afekt i barwienie na błonach komórkowych.

Losowe upakowanie jąder w polu widzenia wskazuje, że soczewka jest skierowana do przodu. Jeśli nie można zaobserwować jąder, prawdopodobnie oznacza to, że tylna strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. W takich przypadkach użyj zakrzywionej pęsety, aby obrócić soczewkę, aż do zaobserwowania precyzyjnie ustawionych jąder na równiku soczewki.