Name: Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania całego mocowania soczewki oka myszy w celu wizualizacji i ilościowej analizy struktur komórkowych. Technika ta zachowuje trójwymiarową architekturę tkanek, umożliwiając dokładne badanie morfologii i funkcji soczewki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute Grant R01 EY032056 dla CC i R01 EY017724 dla VMF, a także przez National Institute of General Medical Sciences w ramach grantu numer P20GM139760. STI był wspierany przez NIH-NIGMS T32-GM133395 w ramach programu szkolenia przeddoktoranckiego Chemistry-Biology Interface oraz przez University of Delaware Graduate Scholars Award.

Preparation and Imaging of Murine Ocular Lens Whole Mounts

<ol><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+strain+on+mouse+eye+lens+capsule+and+cellular+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure.</a> Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).</li>
<li>Martin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arvcf+dependent+adherens+junction+stability+is+required+to+prevent+age-related+cortical+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 840129(2022).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li>
<li>Mekonnen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule+significantly+affects+the+viscoelastic+properties+of+the+lens+as+quantified+by+optical+coherence+elastography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086(2023).</li>
<li>Fincham, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+lens+capsule+in+the+accommodation+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Optical+Society%22%5BJournal%5D)">The function of the lens capsule in the accommodation of the eye.</a> Trans Optical Society. 30 (3), 101(1929).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Bassnett, S., Sikic, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+growth+process%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The lens growth process.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).</li>
<li>Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+full+lifespan+model+of+vertebrate+lens+growth%5BTitle%5D)+AND+%22R+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">A full lifespan model of vertebrate lens growth.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160695(2017).</li>
<li>Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+and+Src+regulate+equatorial+cell+morphogenesis+during+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development.</a> Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).</li>
<li>Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+polarity+protein+aPKClambda+is+required+for+eye+lens+formation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth.</a> Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).</li>
<li>Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+organization+of+the+mammalian+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial organization of the mammalian lens.</a> Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).</li>
<li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2011).</li>
<li>Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+cell+organization+in+crystalline+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fibre cell organization in crystalline lenses.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).</li>
<li>Cvekl, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+mechanisms+of+vertebrate+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development.</a> Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).</li>
<li>Vu, M. P., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunofluorescence+staining+of+bundles+and+single+fiber+cells+from+the+cortex+and+nucleus+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens.</a> J Vis Exp. (196), e65638(2023).</li>
<li>Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+IIA+regulates+the+precise+alignment+of+hexagonal+eye+lens+epithelial+cells+during+fiber+cell+formation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20(2023).</li>
<li>Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+staining+of+lenses+for+visualization+of+lens+epithelial+cell+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins.</a> MethodsX. 8, 101376(2021).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+Strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses.</a> J Vis Exp. (111), e53986(2016).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane protokoły umożliwiają wizualizację w wysokiej rozdzielczości przestrzennej obwodowych struktur i komórek soczewki w przednim i równikowym obszarze soczewki. W pracy przedstawiono metody wizualizacji struktur peryferyjnych soczewek przy użyciu nienaruszonych soczewek (aktywnych lub stałych), w których zachowana jest ogólna architektura soczewek 3D. Dodatkowo dostarczono proste metody morfometrycznej analizy ilościowej z wykorzystaniem publicznie dostępnego oprogramowania FIJI ImageJ. Metody wizualizacji i kwantyfikacji całego montażu były stosowane we wcześniejszych badaniach. Metody te pozwoliły nam zrozumieć reakcję torebki przedniej i komórek na zmianę kształtu soczewki lub starzenie się 2,4. Metody te zostały również wykorzystane do zbadania ekspansji komórek włókien równikowych spowodowanych zmianą kształtu soczewki lub starzeniem się 2,4 oraz do określenia roli NMIA w ustalaniu precyzyjnych sześciokątnych kształtów i organizacji komórek włókien obwodowych20.
Obrazowanie z pełnym mocowaniem pozwala na obrazowanie struktury soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej en face . W przedniej części soczewki obrazowanie z całego mocowania jest korzystne dla obrazowania z płaskim mocowaniem, zapobiegając uszkodzeniom, które mogą zmienić integralność struktury torebki i/lub morfologię komórek nabłonka. Dodatkowo zachowany jest interfejs między komórkami nabłonkowymi i włóknistymi. Metoda ta zapewnia przewagę nad wizualizacją przekrojów soczewki, ponieważ obrazowanie en face zapewnia większą rozdzielczość przestrzenną i umożliwia analizę obszaru komórki nabłonkowej i obszaru/kształtu jądra wybranego obszaru (tj. środkowego bocznego, jak pokazano tutaj) lub innych obszarów komórek. Co więcej, metody obrazowania pozwalają na ilościowe określenie cech morfologicznych w określonych punktach wzdłuż regionów równikowych soczewki, umożliwiając wizualizację sześciokątnych kształtów, południkowego upakowania komórek rzędowych, punktu podparcia i szerokości komórek włóknistych, co nie byłoby łatwo osiągalne za pomocą wycinków soczewek barwionych obrazowaniem ze względu na brak rozdzielczości przestrzennej i zniekształcenia tkanki, które mogą wystąpić podczas cięcia. 
Przedstawione protokoły pozwalają również na obrazowanie żywych soczewek w celu śledzenia określonych struktur i komórek soczewek w czasie. Protokół obrazowania soczewki na żywo odegrał zasadniczą rolę w poprzednim badaniu, w którym przeprowadzono analizę wielokrotnych pomiarów grubości torebki i obszaru komórek nabłonka z subpopulacji komórek z tej samej soczewki przed i po ucisku soczewki w celu wywołania spłaszczenia soczewki4. Stwierdzono, że kompresja soczewki indukowała zmniejszenie grubości torebki i zwiększenie powierzchni komórek nabłonka. Ze względu na znaczne różnice w grubości torebki i powierzchni komórek nabłonkowych między poszczególnymi soczewkami oraz wielkość wpływu kompresji soczewki na te parametry spowodowane kompresją soczewki, trudno byłoby wykryć różnice, gdyby zastosowano niezależny projekt pomiarowy (tj. porównując poszczególne soczewki nieściśnięte z pojedynczymi soczewkami skompresowanymi). Korzystając z metod obrazowania na żywo, przeprowadzono obrazowanie całościowe na żywych soczewkach myszy, które endogennie eksprymują LifeACT-GFP26 w celu wizualizacji F-aktyny w komórkach nabłonka22, co umożliwia śledzenie reorganizacji F-aktyny w żywych komórkach nabłonka.
Podczas gdy przedstawione protokoły zostały opracowane do obrazowania soczewek myszy i mogą być dostosowane do wizualizacji struktur soczewek u innych gatunków, protokoły barwienia do wizualizacji soczewek zarówno przednich, jak i równikowych struktur obwodowych w innych soczewkach gryzoni (szczur, świnka morska), a także w soczewkach innych ssaków (krowa, makak i człowiek; dane nie pokazane). Wizualizacja struktur w większych soczewkach wymaga dłuższego utrwalenia (4%PFA, na lodzie, 4 h), blokowania (1 h) i barwienia (przez noc, 4 °C). Warto zauważyć, że obrazowanie u różnych gatunków przeprowadzono tylko na soczewkach stałoogniskowych. Obrazowanie na żywo soczewek innych gatunków może być trudne, ponieważ protokół obrazowania na żywo wykorzystuje soczewki od myszy transgenicznych, które wykazują ekspresję białek fluorogennych. W związku z tym obrazowanie to może wykluczać obrazowanie soczewek innych gatunków, w których modyfikacje genetyczne nie są powszechne. Udało nam się jednak przeprowadzić wizualizację na żywo błon komórkowych nabłonka soczewek lub F-aktyny poprzez wstępne barwienie soczewek myszy za pomocą sondy lipofilowej, FM4-64 lub sondy wiążącej F-aktynę, odpowiednio SiR-Jasplakinolidu (SiR-aktyny) (nie pokazano). Możliwe jest użycie takich sond do obrazowania na żywo soczewek innych gatunków. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z takich sond, aby uniknąć efektów niezamierzonych; na przykład SiR-jasplakinolid może prowadzić do zmienionej dynamiki F-aktyny27. Innym ograniczeniem metod barwienia, zarówno na soczewkach na żywo, jak i stałoogniskowych, jest to, że takie sondy mają ograniczoną penetrację. Dlatego obrazowanie jest ograniczone do regionów peryferyjnych. Możliwe jest obrazowanie wewnętrznych obszarów (tj. komórek głębokich włókien) za pomocą soczewek transgenicznych myszy tdTomato4, które ponownie opierają się na transgenicznej ekspresji białek fluorogennych. Ekspresja musi być również wystarczająco wysoka, aby zapewnić jasne sygnały w głębokich komórkach światłowodowych. 
Niemniej jednak przedstawione protokoły umożliwiły skuteczną morfologiczną ocenę ilościową cech soczewek peryferyjnych 2,4,20. Metodologie kwantyfikacji są skuteczne i wykorzystują publicznie dostępne oprogramowanie FIJI ImageJ o otwartym kodzie źródłowym. Podczas gdy do identyfikacji obszarów zainteresowania wykorzystano ręczne narzędzia do śledzenia, możliwe jest zautomatyzowanie identyfikacji obszarów zainteresowania. Automatyzacja może być tak prosta, jak zastosowanie progów fluorescencyjnych w celu zwiększenia kontrastu do identyfikacji określonych struktur (tj. granic jąder) w oparciu o FIJI ImageJ lub bardziej złożonych algorytmów uczenia maszynowego do wykrywania różnic w kształcie komórek (tj. nieregularnych kształtów komórek nabłonka lub włókien). Bardziej złożona analiza może wymagać specjalistycznych wtyczek lub oprogramowania do obrazowania. Specjalistyczne wtyczki lub oprogramowanie mogą również pozwolić na uzyskanie wolumetrycznych pomiarów morfologicznych 3D z pozyskanych z-stosów. Ogólnie rzecz biorąc, podczas gdy opisane metody kwantyfikacji są łatwo dostępne, opłacalne i odpowiednie dla wielu użytecznych pomiarów wyników 2,4,20, platforma protokołu obrazowania, w połączeniu z zaawansowaną analizą oprogramowania, może zapewnić bogactwo dodatkowych pomiarów morfologicznych dla przyszłych badań.
Soczewka jest skomplikowaną tkanką biologiczną o wyspecjalizowanych funkcjach, które opierają się na zależnej od lokalizacji i głębokości geometrii komórek i związanych z nimi struktur. Wykorzystanie zademonstrowanych tutaj protokołów obrazowania i metod kwantyfikacji pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ustalane są struktury soczewek i złożona organizacja soczewki. Co więcej, protokoły obrazowania i metody kwantyfikacji pomogą określić zależności między strukturą a funkcjami soczewek.

Soczewka oczna to elastyczna, przezroczysta tkanka znajdująca się w przedniej części oka, która działa w celu precyzyjnego skupienia światła na siatkówce. Zdolność obiektywu do działania można częściowo przypisać jego skomplikowanej architekturze i organizacji1,2,3,4,5,6. Wokół tkanki soczewki znajduje się torebka, błona podstawna niezbędna do utrzymania struktury soczewki i właściwości biomechanicznych7,8,9. Sama soczewka jest całkowicie komórkowa, składa się z dwóch typów komórek: komórek nabłonkowych i włóknistych. Warstwa nabłonkowa składa się z monowarstwy prostopadłościennych komórek, które pokrywają przednią półkulę soczewki10. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się i migrują wzdłuż torebki soczewki w kierunku równika soczewki. Komórki nabłonka przedniego są spokojne i brukowe w przekroju poprzecznym, a w pobliżu równika soczewki komórki nabłonkowe namnażają się i zaczynają przechodzić proces różnicowania w nowe komórki włókniste11,12. Komórki nabłonka równikowego przekształcają się z losowo upakowanych komórek w zorganizowane rzędy południkowe z komórkami w kształcie sześciokąta. Sześciokątny kształt komórki jest zachowany po stronie podstawy tych różnicujących się komórek, podczas gdy strona wierzchołkowa zwęża się i zakotwicza w punkcie podparcia soczewki lub modiolus4,13,14,15. Gdy komórki nabłonka równikowego zaczynają wydłużać się w nowo powstałe komórki włókniste, wierzchołkowe końcówki komórek migrują wzdłuż wierzchołkowej powierzchni przednich komórek nabłonka w kierunku bieguna przedniego, podczas gdy końcówki podstawy poruszają się wzdłuż torebki soczewki w kierunku bieguna tylnego. Nowe generacje komórek włóknistych nakładają się na poprzednie generacje komórek, tworząc sferyczne powłoki włókien. Podczas procesu wydłużania i dojrzewania komórek włóknistych znacznie zmieniają swoją morfologię11,12,16. Te komórki światłowodowe stanowią większość masy soczewki11,12,16,17,18.
Mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do tworzenia skomplikowanych mikrostruktur soczewek, morfologii komórek i unikalnej organizacji komórek, nie są do końca znane. Co więcej, niejasny jest wpływ torebki soczewki i struktury komórkowej na ogólną funkcję soczewki (przezroczystość, zmiana kształtu soczewki). Jednak zależności te są wyjaśniane przy użyciu nowej metodologii obrazowania i ilościowych ocen cech strukturalnych i komórkowych soczewki2,4,19,20,21,22. Opracowano nowe protokoły obrazowania całych soczewek, które pozwalają na wizualizację torebki soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, komórek nabłonka i komórek włókien obwodowych. Obejmuje to metodologię ilościowego określania grubości kapsułki, wielkości komórki, wielkości jądra komórkowego i kolistości, południkowej kolejności rzędów, upakowania komórek włóknistych i szerokości komórek światłowodowych. Te metody wizualizacji i kwantyfikacji obrazu umożliwiają dogłębne badanie morfometryczne i mają przewagę nad innymi metodami wizualizacji (obrazowanie płaskich mocowań lub skrawków tkanek) poprzez zachowanie ogólnej struktury tkanki 3D. Metody te pozwoliły na przetestowanie nowych hipotez i umożliwią dalszy postęp w zrozumieniu rozwoju i funkcji komórek soczewki.
Do poniższych eksperymentów używamy myszy typu dzikiego i Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) w tle C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, obu płci. Myszy tdTomato pozwalają na wizualizację komórkowych błon plazmatycznych w żywych soczewkach poprzez ekspresję białka tdTomato połączonego z N-końcowymi 8 aminokwasami zmutowanego białka MARCKS, które celuje w błonę plazmatyczną poprzez N-końcową mirystylizację i wewnętrzne miejsca palmitoilacji cysteiny23. Używamy również NMIIAE1841K/E1841K mice24 uzyskanego pierwotnie od dr Roberta Adelsteina (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Jak opisano wcześniej20, myszy NMIIAE1841K/E1841K w tle FvBN/129SvEv/C57Bl6, które mają utratę białka pośredniego CP49 (zachowuje morfologię dojrzałych komórek włóknistych i biomechanikę całej soczewki), są krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego C57BL6/J. Przebadaliśmy potomstwo pod kątem obecności allelu CP49 typu dzikiego. 
Obrazowanie konfokalne zostało wykonane na laserowo-skaningowym konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym z powiększeniem 20x (NA = 0.8, odległość robocza = 0.55mm, 1x zoom), 40x (NA = 1.3 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.2mm, 1x zoom) lub 63x (NA = 1.4 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.19mm, 1x zoom) powiększeniem. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu rozmiaru otworka, który jest wyznacznikiem grubości przekroju optycznego, do 1 jednostki Airy'ego (wynikowe grubości optyczne są podane w legendach rycin). Obrazy zostały przetworzone na oprogramowaniu Zen Software. Obrazy zostały wyeksportowane do formatu .tif, a następnie zaimportowane do oprogramowania FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

<table><tbody><tr><td>3 mm Dziurkacz do biopsji</td><td>Acuderm Inc</td><td>NC9084780</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-102GP</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwgrzybiczy/antybiotykowy</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)</td><td>Prometheus</td><td>25-529</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne chusteczki do zadań</td><td>Kimwipe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem ( Fluorodish)</td><td>World Precision International</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MatTek Imaging</td><td>Dish MatTek Life Sciences</td><td>P35G-1.5-14</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>100503-917</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GenClone</td><td>25-507B</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka fenolowa wolna od czerwieni 199</td><td>Gibco</td><td>11043023</td><td></td></tr><tr><td>Rodamino-falloidyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>00027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>WGA-640</td><td>Biotium</td><td>CF 640R</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

Soczewka oczna to przezroczysta, elastyczna tkanka, która zmienia swój kształt, aby skupić światło z różnych odległości na siatkówce. Oprócz błony podstawnej otaczającej narząd, zwanej torebką, soczewka jest całkowicie komórkowa składająca się z monowarstwy komórek nabłonkowych na przedniej półkuli i dużej masy komórek włókien soczewki. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się w strefie kiełkowania na równiku soczewki, a komórki nabłonka równikowego migrują, wydłużają się i różnicują w nowo powstałe komórki włókniste. Komórki nabłonka równikowego znacznie zmieniają morfologię od losowo upakowanych komórek w kształcie kostki brukowej w wyrównane komórki w kształcie sześciokąta tworzące rzędy południkowe. Nowo utworzone komórki włókien soczewkowych zachowują sześciokątny kształt komórki i wydłużają się w kierunku przedniego i tylnego bieguna, tworząc nową powłokę komórek, które są nakładane na poprzednie generacje włókien. Niewiele wiadomo na temat mechanizmów, które napędzają niezwykłą morfogenezę komórek nabłonka soczewki do komórek włóknistych. Aby lepiej zrozumieć strukturę, rozwój i funkcję soczewki, opracowano nowe protokoły obrazowania do obrazowania struktur peryferyjnych przy użyciu całych mocowań soczewek ocznych. Tutaj pokazano metody ilościowego określania grubości kapsułki, obszaru komórki nabłonkowej, obszaru i kształtu jądra komórki, południkowej kolejności komórek rzędowych i upakowania oraz szerokości komórek włókien. Pomiary te są niezbędne do wyjaśnienia zmian komórkowych, które zachodzą podczas wzrostu soczewki przez całe życie i zrozumienia zmian zachodzących wraz z wiekiem lub patologią.

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

Naszym celem jest określenie mechanizmów molekularnych, które ustanawiają skomplikowaną architekturę soczewek oraz tego, jak ta ugruntowana architektura reguluje funkcję soczewki w zakresie przezroczystości i zmiany kształtu soczewki. Aby posunąć naprzód badania w naszej dziedzinie, stosujemy nowe metody obrazowania, które pozwalają nam na wizualizację cech soczewki z wysoką rozdzielczością przestrzenną, a to z kolei pozwala na ilościową analizę obrazu struktur soczewki i cech komórkowych. Obrazowanie z mocowaniem hormonalnym jest korzystniejsze w porównaniu z wizualizacją skrawków tkanek lub procedurami montażu płaskiego, ponieważ umożliwia zachowanie całej struktury tkanki 3D.Pozwala nam to na przeprowadzenie dogłębnego badania morfometrycznego i kwantyfikację natywnej struktury soczewki. Soczewka jest zintegrowaną tkanką biologiczną o wyspecjalizowanych funkcjach, które opierają się na zależnej od lokalizacji i głębokości geometrii komórek i powiązanych z nimi struktur. Wykorzystanie zademonstrowanych protokołów obrazowania i metod kwantyfikacji pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ustalane są struktury soczewek i złożona organizacja soczewki.Rozpocznij procedurę od stworzenia wgłębień unieruchamiających w agarozie. Aby to zrobić, podgrzej i wymieszaj 2% agarozę w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż roztwór się upłynni. Odpipetować 250 mikrolitrów skroplonej agarozy do naczynia ze szklanym dnem.I za pomocą elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego spłaszcz agarozę na naczyniu. Gdy agaroza ostygnie i całkowicie zastygnie, użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie za pomocą trzymilimetrowego dziurkacza do biopsji utwórz otwór w agarozie na środku naczynia.Za pomocą delikatnej chusteczki roboczej usuń nadmiar agarozy. Przechowuj pleśń agarozową uwodnioną PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przed zamontowaniem izolowanej soczewki okularowej Mirion należy dodać dwa mililitry odpowiedniego podłoża do przygotowanej formy agarozowej w zależności od rodzaju soczewki.Za pomocą kleszczyków do zarodków delikatnie przenieś żywą soczewkę fix store do wgłębienia w agarozie. Następnie umieść naczynie na odwróconym stoliku mikroskopowym. Upewnij się, że soczewka znajduje się w przedniej części skierowanej w stronę obiektywu, wizualizując barwienie jąder.Jeśli nie zaobserwuje się żadnych jąder, użyj zakrzywionych kleszczyków, aby delikatnie obrócić soczewkę o około 180 stopni, tak aby przedni obszar był skierowany w stronę obiektywu. Następnie przystąp do pozyskiwania obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby wyświetlić kapsułki z soczewkami, uzyskaj obrazy stosu Z za pomocą obiektywu 40X o rozmiarze kroku 0,3 mikrona.Uzyskaj pierwszy obraz przed powierzchnią torebki soczewki wskazywaną przez barwienie WGA i ostatni obraz po wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka. Aby uwidocznić komórki nabłonkowe, należy uzyskać obrazy stosu Z za pomocą obiektywu 63X o rozmiarze kroku 0,3 mikrona. Rozpocznij całe przygotowanie mocowania soczewki stałej od utworzenia unieruchamiających klinów agarozowych.Aby to zrobić, weź naczynie ze szklanym dnem i wlej do niego około pięciu do sześciu mililitrów stopionej 2% agarozy w PBS. Poczekaj, aż agaroza zastygnie. Następnie za pomocą ostrego ostrza utwórz trójkątne wgłębienie w zestalonej agarozie.Usuń ćwiartkę agarozy i dodaj jeden mililitr PBS do naczynia. Odessać resztki agarozy pozostawione po krojeniu. Utwórz wiele klinów w jednym naczyniu, aby w razie potrzeby dopasować je do wielu soczewek.Aby przechowywać formę, dodaj do niej jeden mililitr PBS przed utrzymaniem jej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść soczewkę w klinu agarozy zawierającym jeden mililitr PBS. Ustaw soczewkę tak, aby obszar równikowy był skierowany w dół na szkło mikroskopu, gdy jest umieszczony nad obiektywem konfokalnym.Umieść naczynie na stoliku mikroskopu. Aby potwierdzić, że obszar równikowy jest ostry, wizualizuj jądra, upewniając się, że są wyrównane w rzędach. Sprawdź również nieregularnie upakowane i ukształtowane komórki nabłonka równikowego oraz precyzyjnie wyrównane i sześciokątne komórki rzędu meridianów, na które wskazuje afekt i barwienie na błonach komórkowych.Losowe upakowanie jąder w polu widzenia wskazuje, że soczewka jest skierowana do przodu. Jeśli nie można zaobserwować jąder, prawdopodobnie oznacza to, że tylna strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. W takich przypadkach użyj zakrzywionej pęsety, aby obrócić soczewkę, aż do zaobserwowania precyzyjnie ustawionych jąder na równiku soczewki.

whole-mount-imaging-to-visualize-quantify-peripheral-lens-structure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.

Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Ten protokół opisuje metody przygotowania obwodowych, dojrzałych i jądrowych komórek włókien kryształka oka do barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania złożonych wnikania komórki w komórkę oraz architekturę błony.

Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Poznaj metodę obrazowania całego mocowania soczewki oka myszy w celu wizualizacji i ilościowej analizy struktur komórkowych. Technika ta zachowuje trójwymiarową architekturę tkanek, umożliwiając dokładne badanie morfologii i funkcji soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Przeglądaj więcej filmów