Wieloelektrodowe zapisy lawin neuronalnych w kulturach organotypowych

Celem tego eksperymentu jest zbadanie samoorganizacji zdrowej aktywności mózgu w lawinach neuronalnych, co jest cechą charakterystyczną dynamiki stanów krytycznych w korze mózgowej. Osiąga się to poprzez połączenie warstwowego wycinka kory koronalnej z wycinkiem śródmózgowia, który dostarcza ważnych rozwojowo dopaminergicznych danych wejściowych do kory. W drugim etapie kokultura śródmózgowia kory mózgowia jest hodowana na matrycy wieloelektrodowej, co pozwala na wielomiejscową stymulację i rejestrację aktywności neuronalnej w kulturze.

Następnie pozwalamy kokulturze spłaszczyć, rozszerzyć się i przyczepić do powierzchni MEA w ciągu pierwszych jednego do dwóch tygodni w specjalnie zaprojektowanym inkubatorze, który cyklicznie przekształca kulturę poprzez ekspozycję na normalne powietrze i kulturę. Uzyskuje się wyniki płynów, które wskazują na spontaniczną samoorganizację czasoprzestrzennego potencjału lokalnego pola wybuchającego w lawiny neuronalne. Na podstawie nagrań MEA i analizy lawinowej offline, która identyfikuje prawo mocy w rozmiarach lawin.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak hodowle niepowiązane, jest jej aspekt systemowy, neuronaukowy. Możemy wspólnie hodować wiele regionów mózgu, a te wieloregionalne kultury tworzą organizację mózgu, która jest prawidłowa w dużych skalach, takich jak warstwy korowe i systemy projekcyjne. Zastosowania tej techniki wykraczają poza samo badanie lawin neuronowych.

Na przykład, możemy badać bodziec w odpowiedzi na poziomie sieci w precyzyjnie kontrolowanych warunkach in vitro. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ prawidłowe stosowanie mieszaniny trombiny w osoczu i pozycjonowanie tkanki na MEA są trudne do nauczenia. Kroki te wymagają odpowiedniego wyczucia czasu, odpowiedniego gradientu temperatury i unikania bezpośredniego dotykania delikatnej powierzchni MEA.

Aby przygotować sterylną, zamykaną szklaną komorę do nagrań, najpierw wytnij gwintowane szklane cylindry z teflonową plastikową nasadką, około dwóch milimetrów od spodu gwintu. Są one wymagane do bezpiecznego i szczelnego zamknięcia komory hodowlanej. Następnie wyczyść szklane pierścienie, spłukując je trzykrotnie wodą, a następnie gotuj przez pięć minut w 200-procentowym alkoholu etylowym.

Odłóż je na bok do wyschnięcia, roztwór krzemu jest wymagany do przymocowania szklanych pierścieni do powierzchni MEA. Użyj zestawu elastomerów silikonowych Cell Guard 180 4 i dokładnie wymieszaj 15 mililitrów części A i B. Następnie usiądźmy na 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Oddziel roztwór na jeden mililitr Eloqua i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Teraz przyklej szklany pierścień do MEA, biorąc jeden mililitr krzemu w temperaturze 23 stopni Celsjusza do strzykawki z igłą o małej średnicy i nakładając go na niepolerowaną powierzchnię cięcia szklanego pierścienia. Następnie wyśrodkuj szklany pierścień na MEA i nałóż dodatkową warstwę silikonu na zewnątrz pierścienia, aby uzyskać mocniejsze uszczelnienie.

Pozwól mu utwardzić się przez jedną do dwóch godzin w temperaturze około 60 stopni Celsjusza na gorącym talerzu. Następnie wysterylizuj komorę MEA i nakrętki komory pod okapem z przepływem blaszki, spłukując trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, a następnie trzykrotnie 70% alkoholem do ostatniego płukania. Pozostaw komorę na 10 minut w alkoholu.

Następnie wystawij komorę i wnętrze nasadki na działanie światła UV na 10 minut. Autoklaw w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 45 minut. Po wysterylizowaniu pozwól im wyschnąć.

Teraz pokryj powierzchnię MEA wewnątrz komory hodowlanej poli D lizyną. Nowe pomiary użyte w tym eksperymencie są raczej lipofilowe, stąd pokrywanie przez powtarzające się krople. Zasysanie roztworu z siatki elektrodowej.

Załóż nasadkę, aby uszczelnić komorę MEA do przechowywania i wykorzystania w przyszłości. Procedura ta daje wycinki kory i VTA dla około 12 kokultur i powinna być wykonywana w kapturze przepływowym blaszki w sterylnych warunkach przy użyciu zdrowych zwierząt od jednego do dwóch dni po urodzeniu, całkowity czas pobrania tkanek powinien być krótszy niż jedna godzina. Po dekapitacji rozpocznij usuwanie mózgu, wykonując najpierw dwa boczne nacięcia nożyczkami, aby usunąć skórę ze skóry głowy.

Usuń, a następnie rozetnij czaszkę za pomocą cienkich nożyczek do oczu, wykonując jedno strzałkowe cięcie linii środkowej na jednym nacięciu koronalnym na połączeniu kory móżdżku. Odwróć wszystkie cztery klapy czaszki, aby odsłonić mózg. Następnie zaostrzoną szpatułką przeciąć czołowo opuszkę węchową.

Następnie przesuwaj szpatułkę co kwartał pod mózgiem. Delikatnie wyjmij mózg z czaszki i pozwól mu wsunąć się w chłodne spojrzenie. Rozwiązanie do szybkiego chłodzenia i tymczasowego przechowywania.

Powtórz powyższą procedurę dla dwóch kolejnych mózgów. Aby uzyskać tkankę VTA, przenieś mózgi na sterylną, suchą szalkę Petriego. Za pomocą małej szpatułki usuń nadmiar płynu, delikatnie przesuwając każdy mózg na boki na około jeden centymetr.

Następnie użyj żyletki, aby usunąć pień mózgu, wykonując pionowe cięcie koronalne na poziomie móżdżku. Teraz przyklej blok agaru do dysku montażowego, aby mechanicznie ustabilizować mózgi podczas procedury krojenia. Następnie umieść cienką linię super kleju, kilka milimetrów przed blokiem agaru na dysku, ale unikaj dotykania agaru przez klej za pomocą małej szpatułki.

Przenieś i zamontuj każdy biegun czołowy mózgu w dół. Upewnij się, że przednie biegunki są przyklejone do tarczy montażowej i że brzuszne boki dotykają agaru bez pozostałości kleju. Zapewnia to odpowiednią stabilizację mechaniczną podczas krojenia i łatwe zdejmowanie pokrojonych plastrów.

Następnie ostrożnie zanurz i zabezpiecz dysk montażowy z zamontowanymi mózgami w tacy vibram wypełnionej schłodzonym roztworem spojrzenia. Następnie, za pomocą starannie oczyszczonej żyletki, naciętych na 400 mikrometrów odcinków czołowych śródmózgowia o najwyższej częstotliwości wibracji i stosunkowo niskiej prędkości naprzód za pomocą odwróconej pipety do makaronu z bańką ssącą, zbierz i przenieś plastry zawierające VTA na szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów wypełnione sterylnym schłodzonym roztworem spojrzenia dla sekcji korowych. Powtórz poprzednie kroki krojenia, ale zastosuj pionowe cięcie między korą a móżdżkiem i zamontuj cztery mózgi biegunem czołowym do góry.

Zbierz około trzech wycinków koronalnych o grubości 350 mikrometrów, zaczynając od poziomu prążkowia. Teraz za pomocą mikronoża wykonanego ze złamanych żyletek, wypreparuj około dwóch milimetrowych odcinków koronalnych kory czołowej i obszarów śródmózgowia zawierających VTA pod mikroskopem stereoskopowym. Zbierz część tkanki oddzielnie do małych naczyń wypełnionych schłodzonym roztworem do spojrzenia.

Aby rozpocząć montaż tkanki w komorze MEA, najpierw należy umieścić MEA w temperaturze pokojowej pod mikroskopem stereoskopowym z ustawioną ostrością na matrycy elektrod. Następnie wyśrodkuj kroplę plazmy o pojemności 25 mikrolitrów na czystej, bezpyłowej i sterylnej matrycy elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń korę i sekcję VTA do kropli osocza.

Teraz umieść MEA na płycie chłodzącej i ponownie ustaw ostrość view. Pozostaw do ostygnięcia przez około 15 sekund przed dodaniem 25 mikrolitrów trombiny do kropli osocza. Następnie, używając końcówki pipety trombinowej, ostrożnie rozprowadzić mieszaninę trombiny z osoczem małymi okrężnymi ruchami w poprzek MEA.

Uważaj, aby nie dotykać bezpośrednio kruchego układu elektrod. Następnie delikatnie umieść korę na matrycy z brzegiem grzbietowym wzdłuż drugiego rzędu elektrod matrycy. W ten sposób rozwijające się warstwy powierzchowne ostatecznie pokryją pozostałą część tablicy.

Następnie umieść VTA w pobliżu brzusznej granicy przekroju kory. Teraz zakryj i luźno zamknij komorę MEA, aby utrzymać wysoką wilgotność. Pozostaw zespół kultur MEA na około sześć minut w okapie w temperaturze pokojowej, aby umożliwić trombinę w osoczu, koagulację, uniesienie.

W międzyczasie powtórz procedurę, aby przygotować trzy kolejne kultury. Następnie małymi kropelkami ostrożnie dodaj 600 mikrolitrów pożywki hodowlanej do komór hodowlanych, używając strzykawki o pojemności jednej cm3 z igłą o wymiarach 25 na pięć ósmych. Następnie szczelnie zamknij komorę MEA i umieść zestaw kultur MEA na kołyszącej się tacy do przechowywania wewnątrz inkubatora.

Po dwóch dniach, in vitro, dodaj 10 mikrolitrów inhibitora mitozy. Następnie odświeżyć pożywkę hodowlaną o 60% po czterech dniach in vitro, a następnie co cztery dni. Podczas normalnego wzrostu kultura znacznie się spłaszczy i nieznacznie rozszerzy grzbietowo.

Ze względu na rozwój powierzchownych warstw korowych, zdrową kulturę identyfikuje się po nieprzezroczystej, szarawej tkance w jasnym polu. I odwrotnie, jasne, odbijające światło pęcherzyki, charakterystyczne dla martwych komórek zwyrodnieniowych około 10 do 12 dni po przygotowaniu kultur, są gotowe do rejestracji i stymulacji. Aby rozpocząć sesję nagraniową, MEA jest przenoszony z kieszeni pamięci do głównego stopnia nagrywającego.

Aby zarejestrować potencjał pola lokalnego lub LFP, należy użyć filtra pasmowoprzepustowego od jednego do 200 herców. Aktywność wielojednostkową można również badać za pomocą filtra pasmowoprzepustowego od 300 do 3000 herców. Zdrowa spontaniczna aktywność ma tendencję do występowania w wybuchach o różnej wielkości i czasie trwania.

Aby zbadać związek między LFP a aktywnością jednostek, możemy obliczyć średnie LFP wywołane skokiem. W przypadku tych kultur kory mózgowej ujemne odchylenia LFP są skorelowane z impulsami neuronalnymi w celu zarejestrowania aktywności wywołanej bodźcem. Po pierwsze, przebieg czasowy i amplituda bodźców są określane za pomocą oprogramowania, które steruje generatorem bodźców.

Użytecznym paradygmatem stymulacji jest pojedynczy wstrząs o kontrolowanym ładunku z bipolarnym przebiegiem prostokątnym. Następnie wybierana jest elektroda, która będzie używana do dostarczania bodźców. Typowe reakcje LFP wywołane bodźcem wydają się podobne do spontanicznych wybuchów aktywności.

Obwody wygaszające odłączają wzmacniacze podczas stymulacji, aby zmniejszyć artefakty bodźca i zapobiec nasyceniu wzmacniacza. Elektroda stymulacyjna potrzebuje kilku sekund, aby dojść do siebie po stymulacji, a zatem nie może być używana do rejestrowania aktywności odpowiedzi. Na MEA ma tendencję do pojawiania się w skupiskach czasoprzestrzennych z aktywnością na jednej elektrodzie, której często towarzyszy aktywność w innych miejscach.

Jednocześnie, typowe przebiegi LFP w takich okresach aktywności są tutaj pokazane poprzez przekreślenie trzech klastrów występujących w odstępie kilku sekund dla każdej gromady. Ujemne odchylenia LFP można zobaczyć na kilku elektrodach w ciągu jednej sekundy podczas wyodrębniania pików NLFP, które przekraczają próg wielu ujemnych sd, aktywność w postaci czasów szczytowych NLFP jest wygodnie wizualizowana w Rasta, w którym kolumny kropek reprezentują blisko zbieżny NPS na różnych elektrodach. Organizacja czasoprzestrzenna tej działalności jest dość złożona.

Kolumny, które wydają się mniej lub bardziej jednorodne przy niskiej rozdzielczości czasowej, składają się z oddzielnych klastrów przy wyższej rozdzielczości czasowej i tak dalej. Powstawanie klastrów kosmicznych, GEOTEMPORAL i LFP jest silnie zorganizowane w sieci korowe. Mówiąc dokładniej, organizacja jest skalowana w wariancie lawin neuronalnych.

Pokazuje się to, obliczając prawdopodobieństwo rozmiarów klastrów przy danej rozdzielczości czasowej. Tutaj klastry składają się z NL FPS, które występują w tych samych lub kolejnych przedziałach czasowych, gdy rozmiar takiego klastra jest wyrażony w całkowitej liczbie NFPS na klaster lub zintegrowanych amplitudach NLFP na klaster, rozkłady wielkości klastra ujawniają prawo potęgowe z wykładnikiem bliskim minus 1,5. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie preparować tkankę mózgową i hodować kultury na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania samoorganizacji aktywności neuronalnej.

Metody te zostały również wykorzystane do zbadania związku między spontaniczną aktywnością a aktywnością wywołaną bodźcem w sieciach korowych.