Name: Wieloelektrodowe zapisy lawin neuronalnych w kulturach organotypowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Poznaj metodę wieloelektrodowych zapisów lawin neuronalnych w ko-kulturach organotypowych kory i śródmózgowia. Technika ta umożliwia badanie samoorganizacji aktywności neuronalnej i dynamiki stanu krytycznego w korze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane przez program Division of Intramural Research Program (DIRP) Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (National Institute of Mental Health), Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health).

<ol><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+are+diverse+and+precise+activity+patterns+that+are+stable+for+many+hours+in+cortical+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures.</a> J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted-U+profile+of+dopamine-NMDA-mediated+spontaneous+avalanche+recurrence+in+superficial+layers+of+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex.</a> J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+neuronal+avalanches+during+postnatal+cortex+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro.</a> J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).</li>
<li>Gireesh, E. D., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+organize+as+nested+theta-+and+beta%2Fgamma-oscillations+during+development+of+cortical+layer+2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).</li>
<li>Petermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+in+awake+monkeys+composed+of+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity in awake monkeys composed of neuronal avalanches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15921-15926 (2009).</li>
<li>Kinouchi, O., Copelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+dynamical+range+of+excitable+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Optimal dynamical range of excitable networks at criticality.</a> Nature Physics. 2, 348-351 (2006).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+imply+maximum+dynamic+range+in+cortical+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality.</a> J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+capacity+is+maximized+in+balanced+cortical+networks+with+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches.</a> J Neurosci. 5, 55-63 (2011).</li>
<li>Karpiak, V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+cultures+for+multi-electrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings.</a> Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).</li>
<li>Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+recording+in+neuronal+networks+with+substrate+integrated+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).</li>
<li>Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+film+microelectrode+array+for+monitoring+extracellular+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).</li>
<li>Egert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Atlas+of+Prenatal+Rat+Brain+Development%22">Atlas of Prenatal Rat Brain Development</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1995).</li>
<li>Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+distributions+in+empirical+data%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Power-law distributions in empirical data.</a> arXiv. , (2009).</li>
<li>Plenz, D., Thiagarajan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principles+of+neuronal+avalanches%3A+cell+assemblies+in+the+cortex%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?</a> Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).</li>
<li>Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).</li>
<li>Cäser, M., Schüz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+neurons+in+neocortical+slice+cultures.+A+light+and+electron+microscopic+study+on+in+situ+and+in+vitro+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hirnforsch%22%5BJournal%5D)">Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material.</a> J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cortex-striatum-mesencephalon+cultures%3A+the+nigro-striatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway.</a> Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up%27+and+%27down%27+states+in+striatal+medium+spiny+neurons+simultaneously+recorded+with+spontaneous+activity+in+fast-spiking+interneurons+studied+in+cortex-striatum-substantia+nigra+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Up' and 'down' states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures.</a> J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basal+ganglia+pacemaker+formed+by+the+subthalamic+nucleus+and+external+globus+pallidus+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments].</a> Nature. 400, 677-682 (1999).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

1. Kwestie techniczne:
<ol>
<li>Technika sterylna. Przygotowanie MEA oraz przygotowanie kultur odbywa się w całości wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych. W żadnym momencie procesu przygotowania i hodowli nie stosuje się antybiotyków, które wpływają na aktywność neuronalną.</li>
<li>Koagulacja osocze/trombiny i przyleganie tkanki do MEA. Przeżywalność tkanki na MEA wymaga starannego zbalansowania czasu potrzebnego na koagulację osocze/trombiny oraz czasu ekspozycji tkanki na atmosferę. Krótki czas koagulacji wiąże się z ryzykiem przedwczesnego odklejenia się przekrojów od MEA, natomiast przedłużona ekspozycja na atmosferę wywołuje degenerację tkanki. Ponieważ stężenie roztworu trombiny determinuje szybkość procesu koagulacji, jest to bardzo istotny parametr dla sukcesu przytwierdzenia zdrowych kultur do powierzchni MEA. Najlepsze wyniki uzyskujemy, stosując 1000 jednostek (1KU; 1 jednostka NIH = 0.324 ± 0.073 mg). Co ważne, niepełne wymieszanie roztworu osocze/trombiny prowadzi do przestrzennej niejednorodności koagulacji, co sprzyja pęknięciom warstwy osocza podczas hodowli. Takie „dziury” w osoczu poważnie wpływają na zdrowie kultury i powodują odklejenie się hodowli od mikroelektrod, co pogarsza jakość rejestracji elektrofizjologicznej. Praca z płytkami chłodzącymi podczas montażu MEA/tkanki spowalnia koagulację i pozwala na homogeniczne wymieszanie roztworu osocze/trombiny oraz prawidłowe ustawienie przekrojów tkanki. 
Podobnie, dodawanie medium do komory hodowlanej w postaci pojedynczych kropli w celu zanurzenia kultury już po 5 min koagulacji znacznie zmniejsza ryzyko odklejenia się tkanki z powodu napięcia powierzchniowego. Prawidłowo rozwinięta kultura spłaszczy się na MEA i lekko rozszerzy, wykazując zdrowy wzrost przez wiele tygodni, bez istotnych oznak niepełnego kontaktu tkanka-MEA lub degeneracji tkanki (np. Rys. 1D).</li> 
<li>Disekcja tkanki. Mikro-noże znacznie usprawniły nasz proces disekcji. Stosujemy dwustronne żyletki (Fine Science Tools – łamliwe ostrza skalpela – 100050-00), z których za pomocą szczypiec oddzielamy „ostrza” o szerokości ˜2 mm i mocujemy je w uchwycie do skalpela. Próbki tkanki są wycinane z przekroju koronarnego za pomocą gładkiego, pionowego i zdecydowanego ruchu ostrza, co znacznie redukuje stres mechaniczny wynikający z rozciągania tkanki, poprawiając tym samym ogólną kondycję kultury.</li>
<li>Chłodzenie tkanki. Prawidłowe chłodzenie przekrojów i sekcji tkankowych podczas przygotowania jest niezbędne dla sukcesu hodowli. Używamy specjalnie wykonanych płyt chłodzących zbudowanych z ogniw Peltiera przymocowanych od spodu do metalowej tarczy. Ciepło generowane przez ogniwo Peltiera jest odprowadzane poprzez perfuzję zimną wodą. Znacznie skraca to czas przygotowania i standaryzuje chłodzenie na każdym etapie procesu (Dold Labs &amp; Engineering. 131 Plantation Dr. Seguin, TX 78155; (830) 560-1471)).</li> 
<li>Warunki w inkubatorze. Specjalnie wykonany inkubator z precyzyjnymi warunkami kołysania wewnętrznego był kluczowy dla naszego sukcesu w hodowaniu przekrojów na MEA. Oparty na oryginalnym projekcie wewnętrznym firmy Multichannelsystems (obecnie niedostępnym w sprzedaży), wewnętrzne urządzenie do kołysania składa się z tacek przymocowanych do dwóch dużych kół bocznych. Silniki krokowe i sterowanie komputerowe pozwalają na precyzyjną trajektorię kołysania (kąt kołysania, prędkość kołysania oraz przerwy okresowe). Ostatecznie kultury przekrojów muszą być eksponowane na atmosferę i medium hodowlane w powolnej alternacji. Tradycyjne podejście polega na umieszczeniu kultur przekrojów w wąskich probówkach, które powoli obracają się wokół swojej najdłuższej osi. W tym przypadku powolna rotacja nie wywołuje stresu mechanicznego wynikającego z samego obrotu, a prędkość obrotowa jest wystarczająco wysoka, aby uzyskać optymalny cykl „karmienia/oddychania” o czasie trwania około 5 – 10 min. Znaczącym wyzwaniem jest bardziej kompaktowe wnętrze komory MEA, jej całkowita objętość wynosząca ˜2 cc oraz niewielka objętość medium hodowlanego wymaganego do kondycjonowania medium przez samą tkankę. Kluczowe dla przeżywalności kultury okazało się kołysanie MEA pod kątem ±˜70° (czas cyklu: ˜200 s), zwalnianie prędkości kołysania w momencie przejścia kultury między fazą ciekłą a atmosferą oraz zatrzymywanie kołysania w skrajnych kątach w celu wydłużenia ekspozycji na atmosferę.</li>
</ol>
2. Wiek rozwojowy kultur kory do badania lawin neuronalnych
Ostre skrawki kory szczura są powszechnie pobierane w 0–1 dniu po urodzeniu (PND 0 – 1) i hodowane przez wiele tygodni na MEA. Wczesne badania wyraźnie wykazały, że hodowle pojedynczych skrawków kory po kilku tygodniach in vitro zachowują warstwową strukturę z identyfikowalnymi typami komórek, które można łatwo porównać z klasami komórek in vivo 18,18-21. Warstwowa organizacja w tym systemie in vitro była wygodnie wykorzystywana do badania unerwienia kory przez wzgórze podczas rozwoju 22-24, a także do stymulacji struktur podkorowych, takich jak prążkowie 25,26. W rzeczywistości specyficzność tworzenia połączeń neuronalnych w obrębie i pomiędzy regionami mózgu pozwala na konstruowanie złożonych systemów in vitro, które odtwarzają liczne, szczegółowe systemy projekcyjne, np. obwody kora-jądra podstawne 27-30.
Po 4–6 tygodniach in vitro pojedyncze skrawki kory 31 oraz skrawki kory w ko-kulturze ze striatum 26 lub wzgórzem 32 wykazują spontaniczne stany up i down, typowe dla warunków in vivo u szczura znieczulonego uretanem 33. Precyzyjna organizacja czasowa tych stanów up nosi znamiona zagnieżdżonych oscylacji θ i γ, co świadczy o elektrofizjologicznie dojrzałej sieci neuronów piramidalnych i szybko odpalających interneuronów GABAergicznych 31. Co istotne, w przypadku braku stymulacji receptorów dopaminy D2, dojrzewanie parwalbuminowo-dodatnich interneuronów korowych w kulturach skrawków kory jest opóźnione o około 2 tygodnie 34. Zgodnie z tymi wynikami, przebieg rozwojowy zagnieżdżonych oscylacji θ, β i γ odpowiada przebiegowi in vivo, gdy skrawki kory są w ko-kulturze z polem brzuszno-przyśrodkowym (VTA), które zawiera neurony dopaminergiczne rzutujące do kory 6.
Badania te wskazują, że podczas badania lawin neuronalnych, które w kluczowy sposób zależą od dojrzałego szybkiego hamowania GABAergicznego i występują w powierzchownych warstwach kory 2,4, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapewnić odpowiednie dojrzewanie tkanki korowej. Chociaż lawiny neuronalne pojawiają się w pojedynczych kulturach kory w czasie od 2 do 5 tygodni 4, to w przypadku potrzeby zachowania przebiegu rozwojowego zgodnego z rozwojem in vivo, skrawki kory wymagają odpowiedniej stymulacji receptorów dopaminowych, np. poprzez współhodowlę skrawków kory z VTA 6.

<table><tbody><tr><td>Zintegrowana planarna macierz wieloelektrodowa</td><td><a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Multi Channel System MCS GmbH</a></td><td>&lt;a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/2030ir-ito-wo.html"&gt;20/30iR-ITO-w/o&lt;/a&gt;</td><td>Elektrody z azotku tytanu (TiN) (średnica 30 mm) mają dużą powierzchnię, co skutkuje niską impedancją (~1,5 k&amp;#937; przy 1 kHz) oraz doskonałe rejestracje szerokopasmowe (bez -&amp;#8211; bez pierścienia)</td></tr><tr><td>Szkło komory</td><td>www.aceglass.com</td><td>7620-32</td><td>Szklany cylinder z gwintowaniem</td></tr><tr><td>Zakrętka komory</td><td>www.aceglass.com</td><td>7622-114</td><td>Plastikowa nakrętka z wkładką teflonową</td></tr><tr><td>Sylgard 184 </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYLG184</td><td>Dwuskładnikowy elastomer silikonowy</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5mg</td><td>&amp;#947;naświetlony promieniami gamma, liofilizowany proszek, przetestowany na hodowlach komórkowych. Przed użyciem zrekonstytuować w 5 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G979-500 mL</td><td>przefiltrowane sterylnie i przetestowane w hodowli</td></tr><tr><td>osocze kurze </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3266-5mL</td><td>Liofilizowane, przed użyciem zrekonstytuować w 5 ml wody dejonizowanej.</td></tr><tr><td>trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T634-1KU</td><td>z osocza bydlęcego, w formie liofilizowanego proszku.</td></tr><tr><td>surowica konia </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H138-10ml</td><td>stado dawców, nieaktywny termicznie, przetestowany pod kątem hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe Eagle (Basal Medium Eagle)</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>1x, 50 ml - (+) Earle&amp;rsquo;sole L-glutaminy),</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;buforowany roztwór soli fizjologicznej </td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td>50 ml - (+) magnez, (+) wapń, z czerwienią fenolową)</td></tr><tr><td>Szkiełka z komorką</td><td>Lab-Tek</td><td>177429</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U303</td><td></td></tr><tr><td>cytozyna ARA-C&amp;#946;-D-arabinofuranozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C645</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracyl&amp;rsquo;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Kora mózgowa wykazuje aktywność spontaniczną, nawet w przypadku braku konkretnego sygnału wejściowego lub wyjścia ruchowego. Podczas rozwoju aktywność ta jest istotna dla migracji i różnicowania typów komórek kory oraz tworzenia połączeń neuronalnych1. U dojrzałego zwierzęcia trwająca aktywność odzwierciedla przeszły i obecny stan organizmu, w który płynnie integrowane są bodźce sensoryczne w celu zaplanowania przyszłych działań. Zatem jasne zrozumienie organizacji trwającej, czyli spontanicznej aktywności, jest warunkiem wstępnym do zrozumienia funkcji kory mózgowej.
Liczne techniki rejestracji wykazały, że trwająca aktywność w korze składa się z wielu neuronów, których indywidualna aktywność przejściowo sumuje się w większe zdarzenia, które można wykryć w lokalnym potencjale polowym (LFP) za pomocą mikroelektrod zewnątrzkomórkowych, lub w elektroencefalogramie (EEG), magnetoencefalogramie (MEG) oraz w sygnale BOLD z funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (fMRI). LFP jest obecnie preferowaną metodą badania aktywności populacji neuronów z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w skali mezoskopowej (kilka tysięcy neuronów). W mikroelektrodzie zewnątrzkomórkowej lokalnie zsynchronizowana aktywność przestrzennie sąsiadujących neuronów skutkuje szybkimi odchyleniami w LFP sięgającymi kilkuset mikrowoltów. Przy użyciu macierzy mikroelektrod organizację takich odchyleń można wygodnie monitorować w przestrzeni i czasie.
Lawiny neuronalne opisują skalowo-niezmienną organizacji czasoprzestrzenną trwającej aktywności neuronalnej w mózgu2,3. Występują one specyficznie w warstwach powierzchownych kory, co ustalono in vitro4,5, in vivo u znieczulonego szczura6 oraz u budzącej się małpy7. Co istotne, zarówno badania teoretyczne, jak i empiryczne2,8-10 sugerują, że lawiny neuronalne wskazują na precyzyjnie zrównoważoną dynamikę stanu krytycznego kory, która optymalizuje transfer i przetwarzanie informacji.
W celu zbadania mechanizmów powstawania, utrzymywania i regulacji lawin neuronalnych, preparaty in vitro są niezwykle korzystne, ponieważ umożliwiają stabilną rejestrację aktywności lawin w ściśle kontrolowanych warunkach. Niniejszy protokół opisuje sposób badania lawin neuronalnych in vitro poprzez wykorzystanie rozwoju warstw powierzchownych w organotypowych kulturach kory, tj. kulturach plastrów, hodowanych na planarnych, zintegrowanych macierzach mikroelektrod (MEA; patrz również 11-14).

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Kora jest aktywna spontanicznie, nawet w przypadku braku konkretnego dopływu sygnałów wejściowych lub wyjścia motorycznego. Podczas rozwoju aktywność ta jest istotna dla...

Celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie samoorganizacji aktywności zdrowego mózgu w lawiny neuronalne, będące znakiem rozpoznawczym dynamiki stanu krytycznego w korze mózgowej. Osiąga się to poprzez połączenie koronalnego skrawka warstwowej kory wraz ze skrawkiem śródmózgowia, który dostarcza kora mózgowa istotnych rozwojowo sygnałów dopaminergicznych. W drugim kroku kokultura kory i śródmózgowia jest hodowana na matrycy wieloelektrodowej, co umożliwia wielopunktową stymulację i rejestrację aktywności neuronalnej w kulturze.Następnie, w ciągu pierwszych jednego do dwóch tygodni, pozwalamy kokulturze spłaszczyć się, rozprzestrzenić i przytwierdzić do powierzchni MEA w inkubatorze wykonanym na specjalne zamówienie, który poddaje kulturę cyklicznej ekspozycji na normalne powietrze i pożywkę. Uzyskane wyniki płynów wykazują spontaniczną samoorganizację czasowo-przestrzennych serii lokalnych potencjałów polowych w lawiny neuronalne. Opiera się to na rejestracjach MEA oraz analizie lawin w trybie offline, która identyfikuje prawo potęgowe w rozmiarach lawin.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kultury dysocjowane, jest jej systemowy aspekt neuronaukowy. Możemy współhodować wiele obszarów mózgu, a te wieloobszarowe kultury tworzą organizację mózgu poprawną w dużych skalach, takich jak warstwy kory i systemy projekcyjne. Zastosowania tej techniki wykraczają poza samo badanie lawin neuronowych.Na przykład możemy badać odpowiedź na bodziec na poziomie sieci w precyzyjnie kontrolowanych warunkach in vitro. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ prawidłowe zastosowanie mieszaniny osocza i trombiny oraz rozmieszczenie tkanki na MEA są trudne do opanowania. Kroki te wymagają odpowiedniego wyczucia czasu, właściwego gradientu temperatury oraz unikania bezpośredniego dotykania delikatnej powierzchni MEA.Aby przygotować sterylną, szczelną szklaną komorę do rejestracji, należy najpierw odciąć gwintowane cylindry szklane z teflonową zakrętką, około dwóch milimetrów od dołu gwintu. Są one niezbędne do bezpiecznego i szczelnego zamknięcia komory hodowlanej. Następnie należy oczyścić szklane pierścienie, płucząc je trzykrotnie wodą, a następnie gotując przez pięć minut w czystym etylu alkoholowym o stężeniu 200 proof.Odstawić je do wyschnięcia. Do przymocowania szklanych pierścieni do powierzchni MEA wymagany jest roztwór silikonowy. Należy użyć zestawu elastomeru silikonowego Cell Guard 180 4 i dokładnie wymieszać 15 ml komponentów A i B. Następnie pozostawić mieszaninę na 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.Rozdziel roztwór na próbki o objętości 1 mL w probówkach Eloqua i przechowuj w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Następnie przyklej szklany pierścień do MEA, pobierając 1 mL silikonu o temperaturze 23 °C do strzykawki z igłą o małym rozmiarze i nakładając go na niepolerowaną powierzchnię cięcia szklanego pierścienia. Potem wycentruj szklany pierścień na MEA i nałóż dodatkową warstwę silikonu wokół zewnętrznej krawędzi pierścienia, aby zapewnić szczelniejsze uszczelnienie.Pozostawić do utwardzenia przez jedną do dwóch godzin w temperaturze około 60 °C na płycie grzejnej. Następnie wysterylizować komorę MEA oraz nakrętki komory w komorze z laminarnym przepływem powietrza, płucząc je trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie trzykrotnie 70% alkoholem, pozostawiając go przy ostatnim płukaniu. Pozostawić komorę w alkoholu na 10 minut.Następnie poddaj wnętrze komory oraz zakrętki działaniu światła UV przez 10 minut. Sterylizuj w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 45 minut. Po sterylizacji pozostaw je do wyschnięcia.Następnie pokryj powierzchnię MEA wewnątrz komory hodowlanej poli-D-lizyną. Nowe MEA użyte w tym eksperymencie są dość lipofilne, dlatego należy je pokrywać metodą wielokrotnego nakładania kropli. Po każdym nakładaniu odessaj roztwór z siatki elektrod.Załóż zakrętkę, aby uszczelnić komorę MEA na czas przechowywania i przyszłego użycia. Procedura ta pozwala na uzyskanie przekrojów kory oraz VTA dla około 12 kokultur i powinna być przeprowadzana wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, z wykorzystaniem zdrowych zwierząt w pierwszym lub drugim dniu po urodzeniu; całkowity czas pobierania tkanek nie powinien przekraczać jednej godziny. Po dekapitacji rozpocznij usuwanie mózgu, wykonując najpierw dwa boczne cięcia nożyczkami w celu usunięcia skóry ze skalpu.Usunąć tkanki, a następnie rozciąć czaszkę za pomocą precyzyjnych nożyczek okularowych, wykonując jedno cięcie wzdłuż linii pośrodkowej sagi oraz jedno cięcie wieńcowe na połączeniu kory z móżdżkiem. Odchylić wszystkie cztery płaty czaszki, aby odsłonić mózg. Następnie za pomocą zaostrzonej szpatułki przeciąć czołowo opuszki węchowe.Następnie przesuwaj szpachelkę w odstępach co jedną czwartą obwodu pod mózg. Delikatnie unieś mózg z czaszki i pozwól mu zsunąć się do schłodzonego roztworu gazowego w celu szybkiego schłodzenia i tymczasowego przechowywania.Powtórz powyższą procedurę dla dwóch kolejnych mózgów. Aby uzyskać tkankę VTA, przenieś mózgi na sterylną, suchą szalkę Petriego. Za pomocą małej szpatułki usuń nadmiar płynu, delikatnie przesuwając każdy mózg w bok o około jeden centymetr.Następnie za pomocą żyletki usuń pień mózgu, wykonując pionowe cięcie w płaszczyźnie czołowej na poziomie móżdżku. Teraz przyklej blok agaru do dysku montażowego w celu stabilizacji mechanicznej mózgów podczas procedury krojenia. Następnie za pomocą małej szpatułki nanieś cienką linię superglue na dysk, kilka milimetrów przed blokiem agaru, unikając kontaktu kleju z agarem.Przenieść i zamocuj każdy mózg stroną bieguna czołowego do dołu. Upewnij się, że bieguny czołowe są przyklejone do dysku montażowego, a strony brzuszne dotykają agaru bez żadnych pozostałości kleju. Zapewnia to odpowiednią stabilizację mechaniczną podczas krojenia i łatwe zdejmowanie wyciętych plastrów.Następnie ostrożnie zanurz i zamocuj dysk montażowy z zamocowanymi mózgami w tacy wibracyjnej wypełnionej schłodzonym roztworem gaze. Następnie, używając starannie oczyszczonego ostrza żyletki, wykonaj coronalne przekroje śródmózgowia o grubości 400 µm przy najwyższej częstotliwości wibracji i stosunkowo niskiej prędkości przesuwu; za pomocą odwróconej pipety Pasteura z gruszką ssącą zbierz i przenieś plastry zawierające VTA do szalek Petriego o wymiarach 35 × 10 mm wypełnionych sterylnym schłodzonym roztworem gaze do przekrojów korowych. Powtórz poprzednie kroki krojenia, ale wykonaj cięcie pionowe pomiędzy korą a móżdżkiem i zamocuj cztery mózgi biegunem czołowym skierowanym do góry.Pobrać około trzech przekrojów czołowych o grubości 350 mikrometrów, zaczynając od poziomu prążkowia. Następnie, używając mikronoża wykonanego z odłamków żyletek, wyciąć pod mikroskopem stereoskopowym przekroje czołowe kory przedczołowej oraz obszarów śródmózgowia zawierających VTA o szerokości około dwóch milimetrów. Pobrać sekcje tkanki osobno do małych naczyń wypełnionych schłodzonym roztworem gaze.Aby rozpocząć montaż tkanki w pierwszej pozycji komory MEA, należy ustawić MEA w temperaturze pokojowej pod mikroskopem stereoskopowym, ustawiając ostrość na matrycę elektrod. Następnie należy nanieść kroplę 25 µL osocza na czystą, wolną od kurzu i sterylną matrycę elektrod. Za pomocą małej szpatułki należy ostrożnie wsunąć przekrój kory i VTA do kropli osocza.Następnie umieść MEA na płytce chłodzącej i ponownie ustaw ostrość obrazu. Pozostaw próbkę do schłodzenia na około 15 sekund, a następnie dodaj 25 µL trombiny do kropli plazmy. Używając końcówki pipety z trombiną, ostrożnie rozprowadź mieszaninę plazmy z trombiną po powierzchni MEA, wykonując małe, koliste ruchy.Należy uważać, aby nie dotykać bezpośrednio kruchej matrycy elektrod. Następnie delikatnie umieść korę na matrycy tak, aby jej grzbietowa krawędź biegła wzdłuż drugiego rzędu elektrod. W ten sposób rozwijające się warstwy powierzchowne z czasem pokryją pozostałą część matrycy.Następnie umieść VTA obok brzusznej krawędzi przekroju kory. Teraz nałóż pokrywkę i luźno zamknij komorę MEA, aby utrzymać wysoką wilgotność. Pozostaw zestaw kultury MEA na około sześć minut wewnątrz dygestorium w temperaturze pokojowej, aby umożliwić działanie trombiny osoczowej i koagulację.W międzyczasie powtórz procedurę, aby przygotować trzy kolejne kultury. Następnie, w formie małych kropli, ostrożnie dodaj 600 µL pożywki do komór hodowlanych, używając strzykawki 1 cc z igłą o rozmiarze 25 G i długości 5/8 cala. Następnie szczelnie zamknij komorę MEA i umieść zestaw hodowlany MEA na kołyszącej tacy do przechowywania wewnątrz inkubatora.Po dwóch dniach in vitro należy dodać 10 µL inhibitora mitozy. Następnie, w czwartym dniu in vitro oraz co cztery dni w dalszej kolejności, należy odświeżyć pożywkę hodowlaną w 60%. Podczas normalnego wzrostu hodowla ulegnie znacznemu spłaszczeniu i lekko rozszerzy się w kierunku grzbietowym.Ze względu na rozwój powierzchownych warstw kory, zdrowa hodowla jest rozpoznawana po nieprzezroczystej szarej tkance w oświetleniu w jasnym polu. Z kolei jasne, odblaskowe pęcherzyki, charakterystyczne dla obumarłych komórek degenerujących się około 10 do 12 dni po przygotowaniu hodowli, sygnalizują gotowość do rejestracji i stymulacji. Aby rozpocząć sesję rejestracji, MEA zostaje przeniesiona z tacy do przechowywania do głowicy rejestrującej.Aby zarejestrować lokalny potencjał polowy (LFP), należy zastosować filtr pasmowoprzepustowy w zakresie od 1 do 200 hertz. Aktywność wielojednostkową można również badać, używając filtra pasmowoprzepustowego od 300 do 3000 hertz. Zdrowa aktywność spontaniczna ma tendencję do występowania w seriach o zróżnicowanej wielkości i czasie trwania.Aby zbadać zależność między LFP a aktywnością jednostek, możemy obliczyć średnie LFP wyzwalane impulsami (spike triggered averages). W przypadku tych kultur kory ujemne odchylenia LFP korelują z impulsowaniem neuronalnym podczas rejestracji aktywności wywołanej bodźcem. Najpierw, za pomocą oprogramowania sterującego generatorem bodźców, określa się przebieg czasowy i amplitudę bodźców.Przydatnym paradygmatem stymulacji jest pojedynczy wstrząs o kontrolowanym ładunku i neutralnym ładunku z bipolarnym przebiegiem prostokątnym. Następnie wybiera się elektrodę, która zostanie wykorzystana do dostarczenia bodźców. Typowe odpowiedzi LFP wywołane bodźcami przypominają serie aktywności spontanicznej.Układy blokujące odłączają wzmacniacze podczas stymulacji, aby zredukować artefakty stymulacyjne i zapobiec nasyceniu wzmacniaczy. Elektroda stymulująca wymaga kilku sekund na regenerację po stymulacji, przez co nie może być wykorzystana do rejestracji aktywności odpowiedzi. Na MEA tendencje te przejawiają się w postaci klastrów spacjoczasowych z aktywnością w jednej elektrodzie, często towarzyszącą aktywności w innych miejscach.Jednocześnie przedstawiono tutaj typowe przebiegi LFP podczas takich okresów aktywności poprzez nałożenie na siebie trzech klastrów występujących w odstępach kilku sekund dla każdego klastra. Ujemne odchylenia LFP są widoczne na kilku elektrodach w oknie jednej sekundy; podczas wyodrębniania szczytów NLFP przekraczających próg wielokrotności ujemnego odchylenia standardowego (sd), aktywność w formie czasów wystąpienia szczytów NLFP jest wygodnie wizualizowana na wykresie typu raster, w którym kolumny kropek reprezentują niemal jednoczesne NPS na różnych elektrodach. Organizacja czasoprzestrzenna tej aktywności jest dość złożona.Kolumny, które w niskiej rozdzielczości czasowej wydają się w większym lub mniejszym stopniu jednorodne, składają się z oddzielnych klastrów w wyższej rozdzielczości czasowej i tak dalej. Powstawanie klastrów przestrzennych, GEOTEMPORAL oraz LFP jest wysoce zorganizowane w sieciach korowych. Bardziej szczegółowo, organizacja ta jest niezależna od skali w przypadku lawin neuronalnych.Zostało to zademonstrowane poprzez obliczenie prawdopodobieństwa wystąpienia rozmiarów klastrów przy danej rozdzielczości czasowej Delta T. W tym przypadku klastry składają się z NL FPS występujących w tych samych lub kolejnych przedziałach czasowych; gdy rozmiar takiego klastra jest wyrażony jako całkowita liczba NFPS na klaster lub zintegrowane amplitudy NLFP na klaster, rozkłady rozmiarów klastrów wykazują prawo potęgowe z wykładnikiem bliskim -1,5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak starannie przeprowadzić dysekcję tkanki mózgowej i hodować kultury na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania samoorganizacji aktywności neuronalnej.Metody te zostały wykorzystane również do badania zależności między aktywnością spontaniczną a aktywnością wywołaną bodźcem w sieciach korowych.

multi-electrode-array-recordings-neuronal-avalanches-organotypic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nagrania z wieloelektrodowych tablic zawierające lawiny neuronowe w hodowlach organotypowych

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Wszczepianie zorganizowanych układów mikroprzewodów do użycia w jednojednostkowych zapisach elektrofizjologicznych stanowi szereg wyzwań technicznych. Opisano również metody wykonywania tej techniki i niezbędny sprzęt. Omówiono również korzystne wykorzystanie zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrywania z różnych podregionów neuronowych o wysokiej selektywności przestrzennej.

Procedura wszczepiania zorganizowanych układów mikroprzewodów do nagrań pojedynczych jednostek u obudzonych, zachowujących się zwierząt

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę wieloelektrodowych zapisów lawin neuronalnych w ko-kulturach organotypowych kory i śródmózgowia. Technika ta umożliwia badanie samoorganizacji aktywności neuronalnej i dynamiki stanu krytycznego w korze.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Przeglądaj więcej filmów