Dynamiczna wieloparametrowa ocena funkcji płytek krwi za pomocą biosensora pojemnościowego

Projektujemy test do oceny funkcji płytek krwi w warunkach fizjologicznych, aby rozwiązać problem ograniczeń obecnych testów poprzez aktywację płytek krwi w półsztywnym mikrośrodowisku za pomocą czujnika pojemności membrany. Test mierzy liczbę płytek krwi, siłę stymulacji i szlaki aktywacji. Narzędzie to oferuje kompleksowe podejście do badania mechanizmów płytek krwi podczas hemostazy.

Nasz protokół może ocenić wiele parametrów płytek krwi w jednym teście w warunkach fizjologicznych. Skupimy się na ulepszeniu tego protokołu i opracowaniu innych czujników oceny hemostazy. Zacznij od użycia standardowego oprogramowania do tworzenia układów CAD, aby zaprojektować układ zespołu membranowego układu pojemnościowego (MCC) dla czterocalowego podłoża z płytki krzemowej do procesu mikrofabrykacji, jak opisano w manuskrypcie.

W celu biofunkcjonalizacji wyczyść elektrodę czujnikową TMCC za pomocą plazmy tlenowej przez 45 sekund przy mocy 100 watów. Dodaj jeden roztwór Do Decanal w 200-procentowym etanolu do studzienki na próbkę na TMCC. Umieść TMCC w pojemniku wypełnionym suchym azotem.

Zamknij pojemnik i owiń go parafilmem na 24 do 48 godzin. Po dwóch dniach spłucz złotą powierzchnię TMCC wodą dejonizowaną i 200-procentowym etanolem. Wysuszyć TMCC gazowym azotem w temperaturze pokojowej.

Dodaj ludzki roztwór fibronektyny w PBS do dołka próbki TMCC i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do ośmiu godzin. Do konfiguracji czujnika pojemnościowego należy użyć miernika LCR z mikropozycjonerami i sondami igłowymi, aby nawiązać kontakt elektryczny z czujnikiem. Zastosuj plastikowe uchwyty wydrukowane w 3D, aby bezpiecznie umieścić TMCC i BMCC.

Upewnij się, że dolne urządzenie jest wyposażone w ograniczniki na osi XY, aby precyzyjnie wyrównać TMCC nad BMCC, tworząc kondensator. Zastosuj sygnał sinusoidalny o napięciu 0,5 V przy 100 kilohercach z częstotliwością próbkowania ośmiu herców. Aby uzyskać skoncentrowane osocze bogatopłytkowe (CPRP), należy odwirować próbki krwi ludzkiej.

Przenieść CPRP do sterylnego pojemnika i przeprowadzić liczenie płytek krwi. W przypadku badań nad inhibitorami należy inkubować CPRP z predefiniowanym stężeniem aspiryny w buforze Tyrode'a. W celu przeprowadzenia testu czynnościowego płytek krwi zmontuj TMCC i BMCC w uchwytach wydrukowanych w 3D.

Mierzyć pojemność wyjściową zmontowanych MCC przez pięć minut, a następnie dodać 45 mikrolitrów CPRP do dołka próbki w TMCC i odczekać 30 minut, aby płytki krwi przylgnęły do elektrody pokrytej fibronektyną w TMCC. Następnie usuń 30 mikrolitrów CPRP z dołka na próbkę, nie naruszając przylegających płytek krwi i uzupełnij studzienkę buforem Tyrode. Po ostatnim przemyciu dodać 10 mikrolitrów roztworu agonisty o pożądanym stężeniu i równoważyć próbkę przez 80 minut.

Zmierz maksymalną zmianę pojemności po 30 minutach przyczepności, aby określić przyczepność delta C. W fazie aktywacji zmierz maksymalną zmianę pojemności, określaną jako aktywacja delta C. Oblicz nachylenie krzywej pojemności między 200 a 300 sekund po aktywacji, aby określić aktywację S.

Wykonaj analizę statystyczną przy użyciu analizy wariancji z testem pooperacyjnym Tukeya, aby porównać wyniki między grupami. Użyj właściwości dopasowania Shapiro-Wilk do przetestowania rozkładu normalnego. Roztwór CPRP z wcześniej określoną liczbą płytek krwi wykazał liniowy spadek pojemności podczas adhezji.

Po aktywacji trombiny zaobserwowano wykładniczy spadek w stanie ustalonym. Wartości adhezji Delta C wykazały silną korelację z liczbą płytek krwi w całym zakresie liczby płytek krwi, ze znacznym zmniejszeniem przy stężeniu aspiryny 1,3 milimola. Tempo wykładniczego zmniejszania pojemności po stymulacji płytek krwi zwiększało się wraz z koncentracją komórek.

Wielkość utraty pojemności również rosła wraz ze wzrostem stężeń, wykazując wyraźną tendencję wzrostową aktywacji delta C. Podobną tendencję zaobserwowano w przypadku aktywacji S i liczby płytek krwi. Wraz ze wzrostem dawki aspiryny, pojemność, aktywacja delta C i aktywacja S wykazywały tendencje spadkowe.

Zaobserwowano statystycznie istotną różnicę w aktywacji S między wysokimi i średnimi dawkami, natomiast nie stwierdzono istotnej różnicy w aktywacji delta C. Sygnały pojemnościowe dla próbek CPRP aktywowanych trombiną wykazały, że zmniejszenie pojemności stawało się wyraźniejsze wraz ze wzrostem stężenia trombiny. Zarówno aktywacja delta C, jak i aktywacja S wykazywały statystycznie istotny trend w odniesieniu do poziomów trombiny.