Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi
8 listopada 2024
Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.
Zakres tych badań polega na ocenie funkcji płytek krwi w warunkach fizjologicznych. W szczególności badamy funkcję płytek krwi za pomocą urządzeń mikroprzepływowych i powierzchni biologicznych. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie odpowiedzieć na pytania związane z dysfunkcją płytek krwi i resuscytacją hemostatyczną do zastosowań w medycynie transfuzjologicznej.
Obecne testy funkcji płytek krwi często testują zdolność płytek krwi do agregacji w odpowiedzi na określonego agonistę z wyboru. Metody wykrywania mogą obejmować transmisję światła lub impedancję elektryczną, a testy te mogą wykorzystywać próbki procesowe i są testowane w stagnacji. Stosując to podejście mikroprzepływowe do badania funkcji płytek krwi, włączamy dynamikę płynów, aby dodać znaczenie fizjologiczne.
Dynamika płynów odgrywa kluczową rolę w mechanizmach biologicznych zaangażowanych w funkcję płytek krwi podczas hemostazy. U pacjentów z krwawieniem jesteśmy szczególnie zaniepokojeni funkcją płytek krwi i interwencjami terapeutycznymi, które mogą poprawić tę funkcję w celu uzyskania lepszych wyników. Korzystając z tego podejścia do badania funkcji płytek krwi, jesteśmy w stanie śledzić wkład różnych populacji płytek krwi w eksperymencie i odblokować sposób oceny opcji terapeutycznych w przypadku urazów i innych stanów krwotocznych.
Na początek wlej bazę z elastomeru silikonowego do naczynia wagowego. Dodaj utwardzacz silikonowy w stosunku dziesięć do jednego i dokładnie wymieszaj mieszaninę, aby zapewnić prawidłowe usieciowanie łańcuchów polimeru silikonowego. Umieść formę wzorcową na szalce Petriego i równomiernie wylej nieutwardzony PDMS na formę.
Następnie umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki z mieszaniny. Aby zakończyć utwardzanie PDMS, umieść formę w piekarniku ustawionym na 70 stopni Celsjusza na 90 minut. Po całkowitym utwardzeniu PDMS użyj żyletki lub skalpela, aby wyciąć odlew mikroprzepływowy.
Wybij otwory na krawędziach kanałów. Teraz umieść szkiełko podstawowe i odlew mikroprzepływowy wytrawioną stroną do góry w urządzeniu do czyszczenia plazmowego. Uruchom pompę próżniową i uszczelnij komorę.
Następnie ustaw myjkę plazmową na wysokie ustawienie i pozostaw ustawienie w odkurzaczu na 30 sekund. Następnie wyłącz odkurzacz plazmowy i zwolnij odkurzacz. Aby związać odlew oczyszczony plazmowo i szkiełko podstawowe, delikatnie dociśnij do siebie boki czyszczarki plazmowej skierowane do góry.
Umieść urządzenie mikroprzepływowe w piekarniku lub na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aby sfinalizować proces wiązania. Teraz pokryj komorę mikroprzepływową odczynnikiem kolagenu fibrylarnego koni typu pierwszego przez wyznaczony wylot do wyznaczonego wlotu. Przechowuj urządzenie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku, aby zapobiec parowaniu powlekanego kolagenu w kanale.
Po godzinie przepłucz urządzenie PBS w kierunku przeciwnym do powłoki, aby wypłukać roztwór kolagenu. Na początek inkubuj cytrynowaną krew pełną z fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem CD41, używając wybranego fluoroforu. Barwić krew przez 30 minut na bujaku nutującym.
Następnie włącz mikroskop i powiązane oprogramowanie. Ustawić poziom pompy strzykawkowej za pomocą stolika mikroskopowego i wyregulować ustawienia pompy strzykawkowej zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Następnie umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu i przyklej jego krawędzie do stolika, aby zapobiec ruchowi.
Teraz podłącz rurkę o średnicy jednej szesnastej cala do złącza kolankowego, a następnie do 10-mililitrowej strzykawki ze złączem o średnicy wewnętrznej jednej szesnastej cala. Napełnij 10-mililitrową strzykawkę sterylnym PBS i podłącz ją do pompy strzykawkowej. Następnie włóż złącze kolankowe do wylotu urządzenia mikroprzepływowego.
Przygotuj przewody dopływowe o długości około 10 centymetrów ze złączem kolankowym na jednym końcu i nacięciem kątowym na drugim końcu. Teraz podłącz złącze kolanka wlotowego do wlotu urządzenia i umieść przewód dolotowy w probówce do mikrowirówki na odpady umieszczonej na kątowym uchwycie. Użyj 10-krotnej soczewki obiektywowej, aby ustawić ostrość na krawędziach kanału urządzenia mikroprzepływowego.
Następnie zagruntuj linie za pomocą PBS. Ręcznie przesunąć pompę strzykawkową, aby oczyścić kanał z wszelkich PDMS lub zanieczyszczeń. Sprawdź w pobliżu wlotu i wylotu kanału, czy nie ma żadnych przeszkód.
Teraz otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazu lub utwórz nową procedurę przechwytywania obrazu dla obrazów szeregów czasowych rejestrowanych co jedną do dwóch sekund z jasnym kanałem pola i kanałami fluorescencyjnymi odpowiadającymi przeciwciałom CD41 w próbce krwi. Pobrać przefiltrowaną próbkę krwi z cytrynianu i wymieszać ją, pipetując w górę i w dół tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieścić próbkę na ustawionym pod kątem uchwycie mikrowirówki.
Następnie umieść przewód wlotowy w próbce krwi i rozpocznij nagrywanie przechwytywania obrazu. Powoli wyjąć strzykawkę, aby wypełnić martwą objętość w rurce. Gdy krew dotrze do kanału, natychmiast naciśnij przycisk Play na pompie strzykawkowej, aby wznowić przepływ z żądaną szybkością.
Eksperyment należy przeprowadzać do momentu, gdy płytki krwi całkowicie zamkną obszar zwężenia urządzenia mikroprzepływowego lub do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego, który zwykle wynosi 10 minut. Po zakończeniu eksperymentu przerwij przechwytywanie obrazu i zatrzymaj pompę strzykawkową. Na koniec zapisz przechwycony obraz w odpowiedniej pamięci.
Przegląd
To badanie bada funkcję płytek krwi w warunkach fizjologicznych za pomocą urządzeń mikrofluidycznych. Badanie ma na celu rozwiązanie problemów z dysfunkcją płytek i resuscytacją hemostatyczną, szczególnie w kontekście medycyny transfuzyjnej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Funkcja płytek
- Mikrofluidyka
- Medycyna transfuzyjna
Tło
- Funkcja płytek jest krytyczna dla hemostazy.
- Obecne testy często brak fizjologicznej istotności.
- Urządzenia mikrofluidyczne mogą symulować warunki przepływu krwi.
- Rozumienie dysfunkcji płytek jest niezbędne w opiece nad urazami.
Cel badania
- Ocenić funkcję płytek w warunkach przepływu.
- Modelowanie resuscytacji hemostatycznej przy użyciu mikrofluidyki.
- Poprawa obecnych testów funkcji płytek.
Zastosowanie metod
- Urządzenia mikrofluidyczne do symulacji przepływu krwi.
- Biologiczne powierzchnie do badań interakcji płytek.
- Ocena agregacji płytek w odpowiedzi na agonisty.
- Wykorzystanie dynamiki płynów dla fizjologicznej istotności.
Główne wyniki
- Podejście mikrofluidyczne zapewnia wgląd w zachowanie płytek.
- Ulepszone zrozumienie dysfunkcji płytek.
- Potencjalne zastosowania w medycynie transfuzyjnej.
- Ulepszone modelowanie resuscytacji hemostatycznej.
Wnioski
- Urządzenia mikrofluidyczne są skuteczne w badaniu funkcji płytek.
- To podejście oferuje bardziej fizjologicznie istotną ocenę.
- Wyniki mogą prowadzić do lepszych strategii transfuzji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microfluidic assessment of platelet function introduces physiologically relevant flow and substrate conditions, enabling more predictive evaluation of thrombosis and hemostasis mechanisms. This approach addresses the limitations of static assays by modeling arterial shear and localized thrombus formation, supporting translational research in trauma and transfusion medicine. The method enhances predictive confidence for therapeutic strategy development in volume-limited and clinically complex samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of platelet function under physiologic shear, clarifying mechanistic pathways in hemostasis.
- Supports biological de-risking by modeling clinically relevant flow conditions and substrate interactions.
- Facilitates functional target validation for antiplatelet and pro-hemostatic agents.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic platforms for quantitative, reproducible platelet function assays.
- Standardizes assessment of platelet aggregation and thrombus formation under controlled flow.
- Enables reliable evaluation of pharmacological inhibitors and transfusion products in a scalable format.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro platelet function testing with disease-relevant trauma and transfusion scenarios.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by modeling patient and animal samples.
- Provides predictive de-risking for therapeutic interventions targeting coagulopathy.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling physiologically relevant platelet function testing across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on platelet dysfunction and therapeutic modulation under flow.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound and product evaluation.
- Analytics: Provides time-resolved imaging and quantitative thrombus formation metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with trauma-induced coagulopathy and transfusion medicine needs.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable microfluidic assay platform adaptable to diverse sample types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in platelet function studies.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation for hemostasis-targeted programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates and transfusion strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, platelet biology, and quantitative imaging analysis.
- Demands access to microfabrication, fluorescence microscopy, and flow control instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- Adaptable to small-volume clinical and preclinical samples, supporting translational flexibility.
- Dependent on maintaining physiologic flow and substrate conditions for assay fidelity.
