Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Zakres tych badań polega na ocenie funkcji płytek krwi w warunkach fizjologicznych. W szczególności badamy funkcję płytek krwi za pomocą urządzeń mikroprzepływowych i powierzchni biologicznych. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie odpowiedzieć na pytania związane z dysfunkcją płytek krwi i resuscytacją hemostatyczną do zastosowań w medycynie transfuzjologicznej.

Obecne testy funkcji płytek krwi często testują zdolność płytek krwi do agregacji w odpowiedzi na określonego agonistę z wyboru. Metody wykrywania mogą obejmować transmisję światła lub impedancję elektryczną, a testy te mogą wykorzystywać próbki procesowe i są testowane w stagnacji. Stosując to podejście mikroprzepływowe do badania funkcji płytek krwi, włączamy dynamikę płynów, aby dodać znaczenie fizjologiczne.

Dynamika płynów odgrywa kluczową rolę w mechanizmach biologicznych zaangażowanych w funkcję płytek krwi podczas hemostazy. U pacjentów z krwawieniem jesteśmy szczególnie zaniepokojeni funkcją płytek krwi i interwencjami terapeutycznymi, które mogą poprawić tę funkcję w celu uzyskania lepszych wyników. Korzystając z tego podejścia do badania funkcji płytek krwi, jesteśmy w stanie śledzić wkład różnych populacji płytek krwi w eksperymencie i odblokować sposób oceny opcji terapeutycznych w przypadku urazów i innych stanów krwotocznych.

Na początek wlej bazę z elastomeru silikonowego do naczynia wagowego. Dodaj utwardzacz silikonowy w stosunku dziesięć do jednego i dokładnie wymieszaj mieszaninę, aby zapewnić prawidłowe usieciowanie łańcuchów polimeru silikonowego. Umieść formę wzorcową na szalce Petriego i równomiernie wylej nieutwardzony PDMS na formę.

Następnie umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki z mieszaniny. Aby zakończyć utwardzanie PDMS, umieść formę w piekarniku ustawionym na 70 stopni Celsjusza na 90 minut. Po całkowitym utwardzeniu PDMS użyj żyletki lub skalpela, aby wyciąć odlew mikroprzepływowy.

Wybij otwory na krawędziach kanałów. Teraz umieść szkiełko podstawowe i odlew mikroprzepływowy wytrawioną stroną do góry w urządzeniu do czyszczenia plazmowego. Uruchom pompę próżniową i uszczelnij komorę.

Następnie ustaw myjkę plazmową na wysokie ustawienie i pozostaw ustawienie w odkurzaczu na 30 sekund. Następnie wyłącz odkurzacz plazmowy i zwolnij odkurzacz. Aby związać odlew oczyszczony plazmowo i szkiełko podstawowe, delikatnie dociśnij do siebie boki czyszczarki plazmowej skierowane do góry.

Umieść urządzenie mikroprzepływowe w piekarniku lub na płycie grzejnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aby sfinalizować proces wiązania. Teraz pokryj komorę mikroprzepływową odczynnikiem kolagenu fibrylarnego koni typu pierwszego przez wyznaczony wylot do wyznaczonego wlotu. Przechowuj urządzenie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku, aby zapobiec parowaniu powlekanego kolagenu w kanale.

Po godzinie przepłucz urządzenie PBS w kierunku przeciwnym do powłoki, aby wypłukać roztwór kolagenu. Na początek inkubuj cytrynowaną krew pełną z fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem CD41, używając wybranego fluoroforu. Barwić krew przez 30 minut na bujaku nutującym.

Następnie włącz mikroskop i powiązane oprogramowanie. Ustawić poziom pompy strzykawkowej za pomocą stolika mikroskopowego i wyregulować ustawienia pompy strzykawkowej zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi. Następnie umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu i przyklej jego krawędzie do stolika, aby zapobiec ruchowi.

Teraz podłącz rurkę o średnicy jednej szesnastej cala do złącza kolankowego, a następnie do 10-mililitrowej strzykawki ze złączem o średnicy wewnętrznej jednej szesnastej cala. Napełnij 10-mililitrową strzykawkę sterylnym PBS i podłącz ją do pompy strzykawkowej. Następnie włóż złącze kolankowe do wylotu urządzenia mikroprzepływowego.

Przygotuj przewody dopływowe o długości około 10 centymetrów ze złączem kolankowym na jednym końcu i nacięciem kątowym na drugim końcu. Teraz podłącz złącze kolanka wlotowego do wlotu urządzenia i umieść przewód dolotowy w probówce do mikrowirówki na odpady umieszczonej na kątowym uchwycie. Użyj 10-krotnej soczewki obiektywowej, aby ustawić ostrość na krawędziach kanału urządzenia mikroprzepływowego.

Następnie zagruntuj linie za pomocą PBS. Ręcznie przesunąć pompę strzykawkową, aby oczyścić kanał z wszelkich PDMS lub zanieczyszczeń. Sprawdź w pobliżu wlotu i wylotu kanału, czy nie ma żadnych przeszkód.

Teraz otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazu lub utwórz nową procedurę przechwytywania obrazu dla obrazów szeregów czasowych rejestrowanych co jedną do dwóch sekund z jasnym kanałem pola i kanałami fluorescencyjnymi odpowiadającymi przeciwciałom CD41 w próbce krwi. Pobrać przefiltrowaną próbkę krwi z cytrynianu i wymieszać ją, pipetując w górę i w dół tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Umieścić próbkę na ustawionym pod kątem uchwycie mikrowirówki.

Następnie umieść przewód wlotowy w próbce krwi i rozpocznij nagrywanie przechwytywania obrazu. Powoli wyjąć strzykawkę, aby wypełnić martwą objętość w rurce. Gdy krew dotrze do kanału, natychmiast naciśnij przycisk Play na pompie strzykawkowej, aby wznowić przepływ z żądaną szybkością.

Eksperyment należy przeprowadzać do momentu, gdy płytki krwi całkowicie zamkną obszar zwężenia urządzenia mikroprzepływowego lub do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego, który zwykle wynosi 10 minut. Po zakończeniu eksperymentu przerwij przechwytywanie obrazu i zatrzymaj pompę strzykawkową. Na koniec zapisz przechwycony obraz w odpowiedniej pamięci.