Name: Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę profilowania zakrzepów opartą na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej. Ta technika umożliwia ocenę skłonności prozakrzepowych i testowanie leków przeciwzakrzepowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania związane z tym artykułem oraz opracowaniem testu profilowania zakrzepów w laboratorium Chena zostały wsparte grantem Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi R00HL153678 (Y.C.), National Institute on Aging, nagrodą Claude D. Pepper Older Americans Independence Center Award #P30-AG024832 (Y.C.), UTMB Team Science Pilot Research Award (Y.C.), stypendium podoktorskim American Heart Association 20POST 35080023 (Y.C.), oraz Nagrodę Projektu Transformacyjnego Amerykańskiego Stowarzyszenia Kardiologicznego 25TPA1471420 (Y.C.). Prace te były częściowo realizowane w San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) UCSD, będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure, wspieranej przez National Science Foundation (Grant ECCS-2025752).

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Ludzkich Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksaskiego. Sprzęt eksperymentalny składa się z urządzenia mikrofluidycznego, elementów perfuzji (złącza, rurki, strzykawki i pompy strzykawkowej) oraz odwróconego mikroskopu z komponentami optycznymi umożliwiającymi obrazowanie w jasnym polu i wielokolorową fluorescencję. W mikroskopie stosuje się wielodiodowy oświetlnię oraz sześcian filtra wieloprzepustowego do rozdzielania 4 kanałów fluorescencyjnego przy minimalnym wzajemnym przeciekaniu: wzbudzenie: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 oraz emisje: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Na wszystkie procedury eksperymentalne należy nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, ochronę oczu oraz kurtkę laboratoryjną. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie urządzeń mikrofluidycznych
<ol>
	<li>Zaprojektuj formę główną z prostokątnymi kanałami (200 μm szerokości × 50 μm wysokości), które zawierają miejsce zwężenia światła w 80%. Każdy kanał ma dedykowane wloty i wyjścia do połączeń rur (Rysunek 1; zobacz Plik Uzupełniający 1 dla oryginalnego pliku projektowego).</li>
	<li>Na podstawie tego projektu użyj płytki krzemowej do wykonania formy głównej fotorezystycznej SU-8 za pomocą standardowej fotolitografii. Przyklej formę na dno 15-centymetrowej miski Petriego (rysunek 2A).</li>
	<li>Przygotować mieszankę PDMS, mieszając bazę prepolimerową i środek utwardzający w zestawie silikonowego elastomeru w stosunku wagowym 10:1. Wylej mieszankę na formę główną (rysunek 2B).</li>
	<li>Umieść płytę zawierającą mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym, aby odgazować i wyeliminować uwięzione pęcherzyki powietrza. UWAGA: Utrzymuj płytę pod próżnią przez co najmniej 2 godziny, aż bąbelki zostaną całkowicie usunięte.</li>
	<li>Termicznie utwardzaj mieszaninę PDMS, inkubując ją w temperaturze 75 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie wytnij utwardzone PDMS z formy głównej (rysunek 2C,D) i podziel je na pojedyncze jednostki układowe.</li>
	<li>Utwórz wlot i wylot, wybijając otwory w wyznaczonych miejscach za pomocą igły sondy (Rysunek 2E). UWAGA: Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie resztki z dziurków z dziurkanych otworów. Aby zminimalizować zanieczyszczenia powierzchni, przed klejeniem czyść urządzenia PDMS taśmą uszczelniającą za pomocą taśmy uszczelniającej.</li>
	<li>W okapu chemicznym spryskaj chusteczkę do pracy 75% etanolem, a zwilżoną chusteczką do wycierania i czyszczenia szkiełek. Zostaw szkiełka do wyschnięcia.</li>
	<li>W okapie chemicznym obrób szklane szkiełka i układy PDMS generatorem wysokiej częstotliwości odpowiednio przez 30 i 20 sekund, a następnie wyrównaj każdy układ ze szklanym szkiełem. Delikatnie dociskaj chip do powierzchni szkła szkła, aby można go było okleić. UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym, ponieważ generator wysokiej częstotliwości wytwarza ozon podczas użytkowania, co jest szkodliwe dla zdrowia.</li>
	<li>Termicznie związać urządzenia, inkubując je w temperaturze 150 °C przez 15 minut. Po ostudzeniu urządzenia będą gotowe do użycia (rysunek 2F).</li>
	<li>Przechowuj urządzenia w temperaturze pokojowej i bez kurzu.</li>
	<li>Użyj szczypców, aby usunąć plastikową część igieł sondy i wygiąć metalowe rurki pod kątem 90°. Te wygięte rurki będą używane jako złącza dla urządzeń mikrofluidycznych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie czujnika świetlówkowego
UWAGA: Eksperyment wykorzystuje łącznie 7 czujników fluorescencjowych: SZ22-FITC, fibrinogen-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Wśród nich fibrynogen, 2.2.9 i MBC 370.2 są dostępne komercyjnie tylko w formie niesprzężonej i muszą być fluorescencyjne sprzężone w laboratorium.
<ol>
	<li>Aby sprzężyć fibrynogen z Alexa Fluor 405:<ol>
		<li>Przygotuj świeży bufor wodorowęglanu sodu o pojemności 0,1 M, pH 8,5.</li>
		<li>Rozcieńcz zapas fibrynogenu do 1 mg/mL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).</li>
		<li>Dodaj 1/10 objętości buforu wodorowęglanu sodu do roztworu fibrynogenu.</li>
		<li>Wymieszaj 1 ml fibrynogenu z 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-ester i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Chroń się przed światłem.</li>
		<li>Usuń bufor magazynowy z kolumny oczyszczającej, wirując kolumnę w 1 100 × g przez 2 minuty, a następnie wyrzuć przepływ. Załaduj roztwór reakcji na kolumnę, zamontuj kolumnę na kompatybilnej fiolce zbierającej i wiruj w 1100 × g przez 5 minut, aby pobrać fibrynogen Alexa Fluor 405.</li>
		<li>Użyj spektrofotometru do pomiaru absorpcji przy 280 nm (A280; sygnał białkowy) i długości fali 405 nm (A405; sygnał barwnikowy). Oblicz stężenie białka i stosunek F/P (fluorescencja: stosunek molowy białka). UWAGA: Stosunek F/P powinien mieścić się w zakresie 8-10.</li>
		<li>Przechowuj fibrinogen-Alexa Fluor 405 w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby sprzężyć przeciwciała 2.2.9 i MBC 370.2 z Alexa Fluor 555:<ol>
		<li>Przygotuj świeży bufor wodorowęglanu sodu o pojemności 0,1 M, pH 8,5.</li>
		<li>Rozcieńcz zapas przeciwciał do 1 mg/mL w buforze wolnym od amin.</li>
		<li>Dodaj 1/10 objętości buforu wodorowęglanu sodu do roztworu przeciwciał.</li>
		<li>Wymieszaj przeciwciało 100 μL z 1 fiolką (100 μg) esteru NHS Alexa Fluor 555 i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Chroń się przed światłem.</li>
		<li>Usuń bufor magazynowy z kolumny oczyszczającej, wirując kolumnę w 1100 × g przez 2 minuty, a następnie wyrzuć przepływ. Załaduj roztwór reakcyjny na kolumnę, montuj kolumnę na kompatybilnej fiolce zbierającej i wiruj w 1 100 × g przez 5 minut, aby pobrać 2.2.9- lub MBC 370.2-Alexa Fluor 555.</li>
		<li>Użyj spektrofotometru do pomiaru absorpcji przy 280 nm (A280; sygnał białkowy) i 555 nm (A555; sygnał barwnikowy) długości fali. Oblicz stężenie przeciwciał oraz stosunek F/P (fluorescencja: molowy stosunek przeciwciał). UWAGA: Stosunek F/P powinien mieścić się w zakresie 1-1,5.</li>
		<li>Przechowywać 2.2.9- oraz MBC 370.2-Alexa Fluor 555 w temperaturze 4 °C w ciemności. UWAGA: Unikaj nadmiernego oznakowania – wysoki stosunek F/P może zaburzać funkcjonowanie biologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie krwi od ludzi
UWAGA: Procedura ta musi być przeprowadzana przez wykwalifikowany personel medyczny (np. licencjonowane pielęgniarki, certyfikowane flebotomistki). Uzyskaj także pisemną, świadomą zgodę od osób biorących udział w badaniu.
<ol>
	<li>Przygotuj strzykawkę, aspirując 500 μL buforu Tyrode (12 mM NaHCO3, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,5 mM D-Glukozy, 0,5% albuminy surowicy bydłej, pH 7,4) zawierającego 0,32 U/mL heparyny na 10 mL krwi do pobrania.</li>
	<li>Pobieraj krew przez wenipunkcję. Użyj pustej strzykawki, aby zebrać pierwsze 2 mL krwi do wyrzucenia. Następnie przełącz się na strzykawkę zawierającą heparynę, aby pobrać próbkę krwi. Ciągnij strzykawkę powoli, aby zminimalizować aktywację płytek.</li>
	<li>Przelej pobraną krew do probówki do wirówki o pojemności 15 ml i utrzymuj ją w temperaturze poniżej 37 °C. UWAGA: Próbki krwi należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 6 godzin od pobrania.</li>
</ol>
4. Testowanie zakrzepów
UWAGA: Zaleca się wykonywanie wszystkich procedur związanych z handlem krwią w szafce bioasekuracyjnej, gdy to możliwe, aby uniknąć rozcieków krwi na eksperymentaliście. Jeśli to niemożliwe, użyj tarczy ochronnej na ławce.
<ol>
	<li>Rozcieńcz monomer VWF do 2 μg/mL w PBS. Wstępnie pokryj urządzenia mikrofluidyczne monomerem VWF i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubuj próbkę krwi za pomocą czujnika fluorescencyjnego Set 1 lub 2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej:<ol>
		<li>Zestaw 1: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), fibrynogen-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2,2,9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).</li>
		<li>Zestaw 2: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370,2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL). UWAGA: Ponieważ dwa zestawy czujników muszą być używane oddzielnie, każda próbka krwi musi być zbadana co najmniej dwukrotnie (raz zestawem sensorów 1, raz zestawem czujników 2), aby uzyskać pełny zestaw danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz urządzenie mikrofluidyczne z wlotami i wyjściami oraz rurkami. Drugi koniec złącza wlotowego należy połączyć z rurką zawierającą PBS, a drugi koniec złącza wylotowego za pomocą strzykawki. Zamontuj strzykawkę na pompce strzykawkowej. Zamontuj urządzenie mikrofluidyczne na odwróconym mikroskopie i ręcznie manewruj stopniem, aby znaleźć miejsce zwężenia pod mikroskopem (rysunek 3A).</li>
	<li>Napełnij kanał mikrofluidyczny i rurkę PBS za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,5 mL/min. Upewnij się, że wokół miejsca zwężenia nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Połącz rurkę wlotową z próbką krwi i przeprowadź próbkę krwi przez kanał mikrofluidyczny za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,018 mL/min (Rysunek 3A).</li>
	<li>Ustaw czas naświetlania i wzmocnienie każdego kanału fluorescencji. Wykonaj wielokolorowe obrazowanie fluorescencji w czasie rzeczywistym, naprzemiennie przeplatając 4 kanały, pobudzając jeden rodzaj fluoroforu naraz. Tymczasem znajdź płaszczyznę ogniska krzepu i rejestruj sygnały w miejscu stenozy, zwykle trwające 15-30 minut (rysunek 4). UWAGA: Czas naświetlania każdego kanału należy dostosować tak, aby sygnał fluorescencjonalny był łatwo rozpoznawalny, unikając jednocześnie nasycenia (Rysunek 4). W obecnym systemie próbki krwi zdrowych pacjentów zazwyczaj wykazują następujący zakres intensywności sygnału w obrębie uformowanego zakrzepca: SZ22-FITC, 70-110; fibrinogen-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Warto jednak zauważyć, że niewielka część zdrowych osób dawała nietypowy wynik. Dlatego zaleca się badanie co najmniej 5 próbek krwi zdrowego pacjenta, aby upewnić się, że czas ekspozycji dla każdego kanału jest prawidłowo dobrany.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik danych za pomocą ImageJ 1.53 (Fidżi, National Institutes of Health). UWAGA: Każdy plik powinien zawierać łącznie 4 filmy z 4 różnych kanałów. Poniższa procedura jest zazwyczaj stosowalna do każdego punktu czasowego, który użytkownik chce analizować.</li>
	<li>Użyj kanału SZ22-FITC do identyfikacji konturu trombu oraz użyj 'Polygon selections', aby mniej więcej wybrać powierzchnię trombu (rysunek 5A,B).</li>
	<li>Dla każdego kanału użyj Obraz -> Reguluj -> Próg , aby wyeliminować tło (Rysunek 5C), a następnie użyj Analizuj -> Mierz , aby zmierzyć powierzchnię i średnią intensywność sygnału w obrębie trombu. UWAGA: SZ22-FITC barwi płytki krwi, a tym samym odzwierciedla rozmiar zakrzepa. W Zestawie 1 fibrynogen-Alexa Fluor 405 odzwierciedla poziom wzbogacenia fibrynogenu, 2.2.9-Alexa Fluor 555 odzwierciedla poziom wzbogacenia czynnika von Willebrand (VWF), a AK4-Alexa Fluor 647 odzwierciedla ekspresję P-selekcji. W Zestawie 2 Annexin V-Pacific Blue odzwierciedla ekspozycję na fosfatydyloserynę (PS), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 odzwierciedla aktywację integriny αIIbβ3 do przedłużonej konformacji (E+ αIIbβ3), a PAC-1-Alexa Fluor 647 odzwierciedla pełną aktywację integriny αIIbβ3 (Akt. αIIbβ3)21.</li>
</ol>

<ol><li>Lindstrom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+cardiovascular+diseases+and+risks+collaboration%2C+1990-2021%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021.</a> J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).</li>
<li>Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+global+coagulation+assays+-+is+there+a+role+in+thrombosis+risk+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction.</a> Thromb Res. 179, 45-55 (2019).</li>
<li>Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+tests%3A+A+comparative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Health+Risk+Manag%22%5BJournal%5D)">Platelet function tests: A comparative review.</a> Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mechanobiology+inspired+microdevices%3A+From+hematological+function+tests+to+disease+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening.</a> Front Pharmacol. 12, 779753(2021).</li>
<li>Gorog, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+direct+comparison+of+platelet+reactivity+and+thrombolytic+status+between+Japanese+and+Western+volunteers%3A+Possible+relationship+to+the+%26%2334%3BJapanese+paradox%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the &#34;Japanese paradox&#34.</a> Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).</li>
<li>Gorog, D. A., Becker, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+platelet+function+tests%3A+Relevance+to+arterial+thrombosis+and+opportunities+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Thrombolysis%22%5BJournal%5D)">Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement.</a> J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).</li>
<li>Lopez-Jaime, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clot+stiffness+measured+by+seer+sonorheometry+as+a+marker+of+poor+prognosis+in+hospitalized+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Appl+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients.</a> Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).</li>
<li>Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+TEG+platelet+mapping+assay+in+blood+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors.</a> Thromb J. 5, 3(2007).</li>
<li>Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+assays+of+hemostasis+in+the+diagnostics+of+hypercoagulation+and+evaluation+of+thrombosis+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+J%22%5BJournal%5D)">Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk.</a> Thromb J. 13 (1), 4(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Thromboelastography+loinc+code+67790-6%22">Thromboelastography loinc code 67790-6</a>. , LOINC Committee. (2022).</li>
<li>Volod, O., Viola, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantra+system%3A+System+description+and+protocols+for+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The quantra system: System description and protocols for measurements.</a> Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaiibbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+thrombosis+under+multiple+shear+rates+and+antiplatelet+therapy+doses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses.</a> PLoS One. 9 (1), e82493(2014).</li>
<li>Colace, T. V., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+von+Willebrand+factor+elongation+and+fiber+formation+on+collagen+during+acute+whole+blood+exposure+to+pathological+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).</li>
<li>Brazilek, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+strain+rate+gradient+microfluidic+device+to+von+Willebrand%27s+disease+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening.</a> Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).</li>
<li>Tovar-Lopez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics+device+to+monitor+platelet+aggregation+dynamics+in+response+to+strain+rate+micro-gradients+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood.</a> Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).</li>
<li>Kim, D. A., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+shear-induced+platelet+aggregated+clot+formed+in+an+in+vitro+arterial+thrombosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model.</a> Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).</li>
<li>Receveur, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+rate+gradients+promote+a+bi-phasic+thrombus+formation+on+weak+adhesive+proteins%2C+such+as+fibrinogen%2C+in+a+vwf-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner.</a> Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).</li>
<li>Din, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+thrombus+profiling+microfluidics+detects+intensified+biomechanical+thrombogenesis+associated+with+hypertension+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging.</a> Nat Commun. 15, 9067(2024).</li>
<li>Stein, P. D., Sabbah, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measured+turbulence+and+its+effect+on+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Measured turbulence and its effect on thrombus formation.</a> Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).</li>
<li>Mahalingam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+analysis+of+the+effect+of+turbulence+transition+on+the+hemodynamic+parameters+in+human+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries.</a> Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).</li>
<li>Thomson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gigapixel+imaging+with+a+novel+multi-camera+array+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope.</a> Elife. 11, e74988(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Łącząc test zwężenia mikrofluidycznego z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, test profilowania zakrzepów zapewnia wygodne i skuteczne podejście do badania trombogenezy biomechanicznej oraz mechanobiologii płytek krwi. Z kolei test jest przydatny w wielu zastosowaniach. Na przykład może być używany do przesiewu środków przeciwzakrzepowych, które specyficznie hamują agregację płytek biomechanicznych, gdzie cel molekularny i mechanizm działania można wywnioskować z kodu kreskowego efektu21....

Zakrzepica jest główną przyczyną chorób sercowo-naczyniowych, odpowiedzialną za miliony zgonów na całymświecie każdego roku. Obecnie nie ma dostępnych badań biologicznych w standardowych warunkach klinicznych do oceny ryzyka zakrzepicy. Wśród skomercjalizowanych laboratoryjnych i punktów badań hematologicznych konwencjonalnych testów koagulacyjnych i aggregometria okazały się niewiarygodne w przewidywaniu zakrzepicy lub poważnych niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych 2,3,4. Globalne testy zakrzepicy5, PFA-100/2006 oraz globalne testy krzepnięcia 7,8,9,10,11 również mają ograniczone dane potwierdzające ich wydajność.
Na podstawie obecnej wiedzy, proces trombogenezy jest głównie wspierany przez trzy mechanizmy. Poza dwoma konwencjonalnie uznawanymi mechanizmami, czyli biochemiczną agregacją płytek krwi i koagulacją, trzecim mechanizmem, który jest niedostatecznie zbadany i często niedoceniany, jest agregacja płytek sterowana ścinaniem, określana również jako "agregacja płytek biomechanicznych"12,13. W agregacji płytek biomechanicznych wysokie naprężenia ścinania i gradient ścinania są głównym czynnikiem umożliwiającym usieciowanie płytek za pomocą czynnika GPIbα-von Willebrand (VWF), integriny αIIbβ 3-VWF oraz integriny αIIbβ interakcji3-fibrynogenów. W zakrzepicy tętniczej najważniejszym mechanizmem prawdopodobnie jest agregacja płytek biomechanicznych, biorąc pod uwagę, że jest ona znacznie wzmocniona przez wysoki przepływ ścinający spowodowany stenozą tętnic. Dlatego trombogeneza wywołana przez agregację płytek biomechanicznych została nazwana "trombogenezą biomechaniczną"12,14.
W poprzednich pracach powszechną metodą eksperymentalnej obserwacji agregacji płytek biomechanicznych jest test zwężenia mikrofluidycznego, w którym miejsce ciężkiej stenozy jest osadzone w prostym kanale. Gdy krew jest przepuszczana przez kanał pod fizjologicznym naprężeniem ścinającym ściany, wokół miejsca stenotycznego powstaje wysokie naprężenie ścinające, co powoduje gromadzenie płytek krwi w kształcie krzepka. Jednak wcześniejsze badania wykorzystywały tylko jeden odczyt (dla płytek krwi, odzwierciedlający rozmiar zakrzepa) 15,16,17,18,19 lub co najwyżej dwa (jeden dla płytek krwi, drugi dla innego biomarkera) odczyt13,20, co nie jest w stanie zapewnić kompleksowej charakterystyki zakrzepca.
Niedawno opracowano test profilowania zakrzepowego, który wykorzystuje wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w teście zwężenia mikrofluidycznego, umożliwiając śledzenie w czasie rzeczywistym 7 biomarkerów (płytki krwi, poziom fibrynogenu, poziom czynnika von Willebranda, poziom ekspresji P-selektyny, poziom ekspozycji na fosfatydyloserynę, rozszerzony poziom integrinyα IIbβ3 , w pełni aktywną integrinę αIIbβ3 poziom ekspresji) w zakrzepie, który stanowi podstawę do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej21. W tej pracy przedstawiono szczegółowe protokoły dotyczące przygotowania i wykonania testu profilowania zakrzepów oraz powiązanej analizy danych. Sprzęt wymagany do testu obejmuje odwrócony wielokolorowy mikroskop fluorescencyjny oraz układ mikrofluidyczny. Test wykorzystuje stosunkowo niewielką ilość ludzkiej krwi pełnej (mniej niż 2 mL), ma wysoką opłacalność (~$12 za próbkę) i daje wyniki w ciągu 30 minut. Test pozwala dokładnie wykrywać wielowymiarowe nieprawidłowości protrombotyczne u osób oraz oceniać wpływ środków przeciwzakrzepowych na zmianę rozmiaru, składu i aktywacji płytek krwi, co potwierdza szerokie zastosowanie zarówno w badaniach, jak i klinicznychw przyszłości. Warto zauważyć, że test musi wykorzystywać świeżo pobraną heparynizowaną krew. Przechowywanie krwi w temperaturze 4 °C lub przez ponad 6 godzin lub stosowanie antykoagulantów innych niż heparyna może zapobiec powstawaniu zakrzepów lub spowodować niedokładne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 10 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5100-X00V0</td><td>Pobranie próbki krwi</td></tr><tr><td>Rurki falcon o pojemności 15 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-101</td><td>Przechowywanie próbek krwi</td></tr><tr><td>1 mL gazoszczelna szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>81331</td><td>Montaż sprzętu</td></tr><tr><td>2.2.9</td><td>MERU VasImmune</td><td></td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>20 igieł sond 20 x 2</td><td>McMaster-Carr</td><td>M919</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Strzykawki 20 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5200-X00V0</td><td>Pobranie próbki krwi</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0281-1</td><td>Dezynfekcja gazoszczelnych strzykawek i czyszczenie szkiełek szklanych</td></tr><tr><td>AK4-Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>304918</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 NHS Ester</td><td>Invitrogen</td><td>A30000</td><td>Znakowanie fibrynogenów</td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania przeciwciał Alexa fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A88065</td><td>Oznaczenia MBC 370.2 i 2.2.9</td></tr><tr><td>Annexin V-Pacific Blue</td><td>Invitrogen</td><td>501121505</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Sprzątacz do</td><td>Office Depot</td><td>911245</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Zestaw noży hobbystycznych do rękodzieła z drewnianym pudełkiem</td><td>Łopatki Excel</td><td>44282</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>751-628</td><td>Mycie gazoszczelnych strzykawek</td></tr><tr><td>Suszarka</td><td>Bel Art</td><td>F420270000</td><td>Odgazowywanie PDMS</td></tr><tr><td>Jednorazowa wielofunkcyjna szpatułka laboratoryjna</td><td>LevGo</td><td>17211</td><td>Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania;</td></tr><tr><td>Kolumna do usuwania barwników i biotyn</td><td>Zeba</td><td>A44296S</td><td>Znakowanie fibrynogenów</td></tr><tr><td>Fibrynogen</td><td>Innowacyjne badania</td><td>IHUFBG25MG</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa Fusion 200-X</td><td>Chemyx Inc.</td><td>0720X</td><td>Montaż sprzętu</td></tr><tr><td>Heparyna &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>Antykoagulacja próbki krwi</td></tr><tr><td>Generator wysokich częstotliwości</td><td>Electro-technic product Inc.</td><td>BD-20</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Ludzki monomer VWF</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10973-H08C</td><td>Powłoka urządzeń mikrofuidycznych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image J v1.53</td><td>Fidżi, Narodowy Instytut Zdrowia</td><td></td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td><td>DM IL PROWADZIŁ; kostka filtra: Leica DFT51010; Latarnia morska: LED5</td><td>Montaż sprzętu</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Czyszczenie szkiełek szklanych</td></tr><tr><td>Nasadki zamków luer</td><td>International Medical Industries, Inc.</td><td>57100B</td><td>Pobranie próbki krwi</td></tr><tr><td>MBC 370.2</td><td>Kerafast</td><td>EBW104</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Okulary osłonowe na mikroskop</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Kompania KG</td><td>ES0107222</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Mini-skrobak do żyletki</td><td>Stanley</td><td>28-100</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Pomiar stężenia białka i stosunku F/P</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Instrumenty linii laboratoryjnej</td><td>3512</td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>PAC-1-Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>362806</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Plastikowy kubek</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>S04589</td><td>Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania;</td></tr><tr><td>SU-8 fotorezysta master&nbsp; Pleśń</td><td>Zakład Czystej Nano3 Nanofabrykacji UC San Diego</td><td></td><td>Tworzenie urządzeń PDMS</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw Silikonowego Elastomera</td><td>Krayden Dow</td><td>DC4019862</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>SZ22-FITC&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM 1756U</td><td>Barwienie zakrzepu</td></tr><tr><td>Rurki</td><td>Cole-Palmer Instrument Co.</td><td>06422-01</td><td>Montaż sprzętu</td></tr></tbody></table>

testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Thrombus Profiling Assay: A Microfluidics-Based Platform for Comprehensively Characterizing Biomechanical Thrombogenesis

Zakrzepica to stan patologiczny opisujący nieprawidłowe gromadzenie płytek krwi i czynników krzepnięcia w naczyniu krwionośnym. Chociaż wiele badań koncentrowało się na aktywacji płytek krwi przez rozpuszczalnych agonistów jako mechanizmie zakrzepicy, często pomijano, że przepływ krwi sprzyja także powstawaniu zakrzepów. Szczególnie w tętnicach zakrzepica wiąże się z zwężeniem tętnic, które zwiększa naprężenie ścinające w przepływie krwi i ułatwia proces trombogenezy, zjawiska określanego jako trombogeneza biomechaniczna. Przez długi czas nie było dostępnego biotestu, który dostarczałby kompleksowych i szczegółowych informacji na temat procesu trombogenezy biomechanicznej. Aby temu zaradzić, opracowano test profilowania zakrzepów poprzez połączenie mikrofluidyki z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, który umożliwia kompleksową charakterystykę trombogenezy biomechanicznej z siedmioma odczytami obejmującymi wielkość i skład zakrzepu oraz poziom aktywacji płytek. Ten test profilowania zakrzepów może być używany do oceny tendencji protrombowej u ludzi oraz skuteczności leków przeciwzakrzepowych, a także jest przydatny do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zakrzepicy tętniczej.

Badanie profilowania zakrzepów perfuzuje krew przez kanał stenotyczny, umożliwiając powstawanie krzepca sterowanego ścinaniem, oraz wykonuje wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, aby zebrać wielowymiarowe informacje o utworzonym zakrzepcie. Wykonując eksperymenty z użyciem czujników Zestawu 1 i Zestawu 2, można scharakteryzować zakrzep pod względem takich jak rozmiar, wzbogacenie białek sieciujących (czynnik von Willebranda, fibrynogen), a także poziom aktywacji płytek (odzwierciedlony ekspresj...

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Thrombosis is a pathological condition describing the abnormal accumulation of platelets and clotting factors in a blood vessel. While many works focused ...

Opracowaliśmy nową metodę, która może odpowiednio uchwycić biomechaniczne cechy zakrzepicy oraz wykrywać nieprawidłowości protrombotyczne u ludzi. Na początek użyj płytki krzemowej do wykonania formy głównej fotooporowej SU8 za pomocą standardowej fotolitografii na podstawie projektu i zabezpiecz formę główną na dnie 15-centymetrowej szalki Petriego taśmą. Przygotuj mieszankę polidimetylosiloksanu, czyli PDMS, mieszając bazę prepolimerową i środek utwardzający z zestawu silikonowego elastomeru w stosunku wagowym 10 do 1.Wlej mieszankę PDMS na formę główną. Następnie umieść płytę zawierającą mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym, aby ją odgazować. Termicznie utwardzaj mieszaninę PDMS, umieszczając ją w inkubatorze ustawionym na 75 stopni Celsjusza na dwie godziny.Po wyjęciu próbki z inkubatora ostrożnie wytnij utwardzone PDMS z formy głównej i podziel utwardzone PDMS na pojedyncze jednostki chipowe. Za pomocą igły sondy przebij otwory w wyznaczonych miejscach, aby utworzyć wlot i wylot. W okapie chemicznym użyj chusteczki zwilżonej etanolem 75%, aby wyczyścić szkła i je wysuszyć.Następnie, używając generatora wysokiej częstotliwości, traktuj szkiełka przez 30 sekund, a układy PDMS przez 20 sekund. Wyrównaj każdy odcinek ze szklaną prowokacją i delikatnie dociskaj ją do powierzchni szklanej, aby ją związać. Teraz termicznie zmocnij urządzenia, umieszczając je w piekarniku ustawionym na 150 stopni Celsjusza na 15 minut.Po związaniu przechowuj urządzenia w temperaturze pokojowej i bez kurzu. Następnie, używając szczypiec, usuń plastikową część igieł sondy i wygiń metalowe rurki pod kątem 90 stopni, aby stworzyć złącza dla urządzeń mikrofluidycznych. Po przygotowaniu reakcji na sprzężenie fibrynogenu i wymaganych przeciwciał z Alexa Fluor, wiruj kolumny oczyszczające w stężeniu 1 100 G przez dwie minuty, aby usunąć bufor magazynowy.Po odrzuceniu przepływu przez środek załaduj roztwór reakcyjny na kolumnę oczyszczającą zamontowaną w kompatybilnej fiolce zbiorczej i wirówce o mocy 1,100 G przez pięć minut, aby pobrać wymaganą mieszankę. Za pomocą spektrofotometru zmierz absorpcję białka i sygnału barwnika. Oblicz stężenie białka oraz stosunek molowy fluorescencji do białka.Farbniki przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Dodaj heparynę do buforu Tyrode do końcowego stężenia 0,32 jednostki na mililitr na 10 mililitrów krwi, która ma być pobrana, a strzykawkę przygotuj przez aspirację 500 mikrolitrów buforu Tyrode przy pH 7,4. Po pobraniu krwi za pomocą nakłucia żył w strzykawce zawierającej heparynę, przelej ją do 15-mililitrowej wirówki i utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Rozcieńcz monomer czynnika von Willebranda do dwóch mikrogramów na mililitr w PBS. Wstępnie pokryj urządzenia mikrofluidyczne rozcieńczonym monomerem czynnika von Willebranda i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj próbkę krwi za pomocą czujników fluorescencyjnych ustawionych 1 lub 2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie podłącz urządzenie mikrofluidyczne z wlotami i wyjściami oraz rurkami. Podłącz drugi koniec złącza wlotowego do rurki zawierającej PBS, a następnie podłącz drugi koniec złącza do strzykawki. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, a urządzenie mikrofluidyczne na odwróconym mikroskopie.Ręcznie obróć stopień mikroskopu, aby zlokalizować miejsce zwężenia. Napełnij kanał mikrofluidyczny i rurkę PBS za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,5 mililitra na minutę. Sprawdź urządzenie, aby upewnić się, że wokół miejsca zwężenia nie ma pęcherzyków powietrza.Podłącz rurkę wlotową do próbki krwi i przeprowadź próbkę krwi przez kanał mikrofluidyczny za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,018 mililitra na minutę. W mikroskopie odwróconym ustaw czas naświetlania i wzmocnienie dla każdego kanału fluorescencyjnego w oprogramowaniu. Wykonaj wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, przeplatając cztery kanały i wzbudzając jeden fluoro-4 na raz.Dostosuj płaszczyznę ostrości do zakrzepa i nagrywaj sygnały fluorescencyjne w miejscu zwężenia przez 15 do 30 minut. Do analizy danych otwórz plik danych używając wersji ImageJ 1.53. Użyj kanału SZ 22 fit C, aby zidentyfikować kontur trombu.Następnie, używając wyborów wielokątów, mniej więcej wybierz obszar trombu. Dla każdego kanału usuń sygnał tła, wybierając obraz, wybierając Adjust, a następnie wybierając Threshold. Na koniec zmierz powierzchnię i średnią intensywność sygnału wewnątrz zakrzepu, wybierając Analizuj i wybierając Mierz.Reprezentatywne zdjęcia pokazały zakrzepy powstałe we krwi w kanale stenotycznym z użyciem płytek krwi, fibrynogenu, czynnika von Willebranda i P-selektyny wizualizowanych za pomocą zestawu sensorów 1 oraz płytek krwi, fosfatydyloseryny, E-dodatniej integriny alfa IIb beta 3, aktywowanej integriny alfa IIb beta 3 wizualizowanych za pomocą zestawu czujników 2. Pojedynczy obraz kanału fluorescencyjnego był przetwarzany poprzez wyznaczenie obszaru krzepowego, usunięcie sygnału tła oraz pomiar powierzchni sygnału i średniej jasności, aby umożliwić analizę ilościową. Ciągła analiza intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie generowała krzywą sygnału względem czasu dla nagromadzenia płytek podczas tworzenia zakrzepów.Dla każdego punktu czasowego uzyskano łączną intensywność sygnału dla czterech biomarkerów w zbiorze pierwszym oraz czterech biomarkerów w zbiorze drugim. Obliczono rozmiar zakrzepu i wygenerowano siedmiowymiarowy profil zakrzepu. Obecnie nie ma testów biologicznych, które oceniałyby tendencję protrombotyczną u pacjentów ludzkich, a nasza praca stara się wypełnić tę lukę.Dzięki wykrywaniu aktywności biomechanicznej próbek krwi, nasz test może kompleksowo ocenić właściwości protrombowe badanych. Nasz test może zostać rozwinięty jako kliniczny test wykrywający tendencję protrombotyczną u pacjentów, a także może być wykorzystywany do przesiewowych leków przeciwzakrzepowych nowej generacji.

thrombus-profiling-assay-microfluidics-based-platform-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsze badanie opisuje nowatorski test na mikropłytce, który mierzy aktywność krzepnięcia FV podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie, co nie było wcześniej raportowane. Metoda ta wykorzystuje kinetyczny czytnik mikropłytek do ciągłego pomiaru zmiany absorbancji przy 405nm podczas tworzenia skrzepu fibrynowego w ludzkiej plazmie.

Pomiar aktywności czynnika V w ludzkiej plazmie przy użyciu mikropłytkowego testu krzepliwości

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Testy trombolizy in vitro często miały trudności z odtworzeniem warunków in vivo, czy to w trawionej skrzeplinie, czy w środowisku, w którym tromboliza zachodzi. W tym artykule badamy, w jaki sposób sprzężenie pętli Chandlera i testu fluorometrycznej fibrynolizy przepływowej w czasie rzeczywistym (RT-FluFF) jest wykorzystywane do monitorowania lizy skrzepów ex vivo o wysokiej wierności.

Śledzenie fibrynolizy skrzepów krwi pełnej uformowanych w pętli Chandlera pod wpływem przepływu ścinającego w modelu trombolizy in vitro

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Protokół ten opisuje test hemostazy Nijmegen, który umożliwia jednoczesne, czasowo rozdzielcze pomiary generacji trombiny i plazminy, zapewniając zintegrowaną ocenę krzepnięcia i fibrynozy. Celem testu jest poprawa charakterystyki równowagi hemostatycznej w badaniach i środowiskach klinicznych wykraczających poza zakresu konwencjonalnych testów hemostatycznych.

Test hemostazy Nijmegen: Jednoczesny pomiar fluorogenny generacji trombiny i plazminy w pojedynczej studni

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Poznaj metodę profilowania zakrzepów opartą na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej. Ta technika umożliwia ocenę skłonności prozakrzepowych i testowanie leków przeciwzakrzepowych.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Przeglądaj więcej filmów