Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej
January 9th, 2026
Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.
Opracowaliśmy nową metodę, która może odpowiednio uchwycić biomechaniczne cechy zakrzepicy oraz wykrywać nieprawidłowości protrombotyczne u ludzi. Na początek użyj płytki krzemowej do wykonania formy głównej fotooporowej SU8 za pomocą standardowej fotolitografii na podstawie projektu i zabezpiecz formę główną na dnie 15-centymetrowej szalki Petriego taśmą. Przygotuj mieszankę polidimetylosiloksanu, czyli PDMS, mieszając bazę prepolimerową i środek utwardzający z zestawu silikonowego elastomeru w stosunku wagowym 10 do 1.
Wlej mieszankę PDMS na formę główną. Następnie umieść płytę zawierającą mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym, aby ją odgazować. Termicznie utwardzaj mieszaninę PDMS, umieszczając ją w inkubatorze ustawionym na 75 stopni Celsjusza na dwie godziny.
Po wyjęciu próbki z inkubatora ostrożnie wytnij utwardzone PDMS z formy głównej i podziel utwardzone PDMS na pojedyncze jednostki chipowe. Za pomocą igły sondy przebij otwory w wyznaczonych miejscach, aby utworzyć wlot i wylot. W okapie chemicznym użyj chusteczki zwilżonej etanolem 75%, aby wyczyścić szkła i je wysuszyć.
Następnie, używając generatora wysokiej częstotliwości, traktuj szkiełka przez 30 sekund, a układy PDMS przez 20 sekund. Wyrównaj każdy odcinek ze szklaną prowokacją i delikatnie dociskaj ją do powierzchni szklanej, aby ją związać. Teraz termicznie zmocnij urządzenia, umieszczając je w piekarniku ustawionym na 150 stopni Celsjusza na 15 minut.
Po związaniu przechowuj urządzenia w temperaturze pokojowej i bez kurzu. Następnie, używając szczypiec, usuń plastikową część igieł sondy i wygiń metalowe rurki pod kątem 90 stopni, aby stworzyć złącza dla urządzeń mikrofluidycznych. Po przygotowaniu reakcji na sprzężenie fibrynogenu i wymaganych przeciwciał z Alexa Fluor, wiruj kolumny oczyszczające w stężeniu 1 100 G przez dwie minuty, aby usunąć bufor magazynowy.
Po odrzuceniu przepływu przez środek załaduj roztwór reakcyjny na kolumnę oczyszczającą zamontowaną w kompatybilnej fiolce zbiorczej i wirówce o mocy 1,100 G przez pięć minut, aby pobrać wymaganą mieszankę. Za pomocą spektrofotometru zmierz absorpcję białka i sygnału barwnika. Oblicz stężenie białka oraz stosunek molowy fluorescencji do białka.
Farbniki przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Dodaj heparynę do buforu Tyrode do końcowego stężenia 0,32 jednostki na mililitr na 10 mililitrów krwi, która ma być pobrana, a strzykawkę przygotuj przez aspirację 500 mikrolitrów buforu Tyrode przy pH 7,4. Po pobraniu krwi za pomocą nakłucia żył w strzykawce zawierającej heparynę, przelej ją do 15-mililitrowej wirówki i utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Rozcieńcz monomer czynnika von Willebranda do dwóch mikrogramów na mililitr w PBS. Wstępnie pokryj urządzenia mikrofluidyczne rozcieńczonym monomerem czynnika von Willebranda i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj próbkę krwi za pomocą czujników fluorescencyjnych ustawionych 1 lub 2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie podłącz urządzenie mikrofluidyczne z wlotami i wyjściami oraz rurkami. Podłącz drugi koniec złącza wlotowego do rurki zawierającej PBS, a następnie podłącz drugi koniec złącza do strzykawki. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, a urządzenie mikrofluidyczne na odwróconym mikroskopie.
Ręcznie obróć stopień mikroskopu, aby zlokalizować miejsce zwężenia. Napełnij kanał mikrofluidyczny i rurkę PBS za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,5 mililitra na minutę. Sprawdź urządzenie, aby upewnić się, że wokół miejsca zwężenia nie ma pęcherzyków powietrza.
Podłącz rurkę wlotową do próbki krwi i przeprowadź próbkę krwi przez kanał mikrofluidyczny za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,018 mililitra na minutę. W mikroskopie odwróconym ustaw czas naświetlania i wzmocnienie dla każdego kanału fluorescencyjnego w oprogramowaniu. Wykonaj wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, przeplatając cztery kanały i wzbudzając jeden fluoro-4 na raz.
Dostosuj płaszczyznę ostrości do zakrzepa i nagrywaj sygnały fluorescencyjne w miejscu zwężenia przez 15 do 30 minut. Do analizy danych otwórz plik danych używając wersji ImageJ 1.53. Użyj kanału SZ 22 fit C, aby zidentyfikować kontur trombu.
Następnie, używając wyborów wielokątów, mniej więcej wybierz obszar trombu. Dla każdego kanału usuń sygnał tła, wybierając obraz, wybierając Adjust, a następnie wybierając Threshold. Na koniec zmierz powierzchnię i średnią intensywność sygnału wewnątrz zakrzepu, wybierając Analizuj i wybierając Mierz.
Reprezentatywne zdjęcia pokazały zakrzepy powstałe we krwi w kanale stenotycznym z użyciem płytek krwi, fibrynogenu, czynnika von Willebranda i P-selektyny wizualizowanych za pomocą zestawu sensorów 1 oraz płytek krwi, fosfatydyloseryny, E-dodatniej integriny alfa IIb beta 3, aktywowanej integriny alfa IIb beta 3 wizualizowanych za pomocą zestawu czujników 2. Pojedynczy obraz kanału fluorescencyjnego był przetwarzany poprzez wyznaczenie obszaru krzepowego, usunięcie sygnału tła oraz pomiar powierzchni sygnału i średniej jasności, aby umożliwić analizę ilościową. Ciągła analiza intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie generowała krzywą sygnału względem czasu dla nagromadzenia płytek podczas tworzenia zakrzepów.
Dla każdego punktu czasowego uzyskano łączną intensywność sygnału dla czterech biomarkerów w zbiorze pierwszym oraz czterech biomarkerów w zbiorze drugim. Obliczono rozmiar zakrzepu i wygenerowano siedmiowymiarowy profil zakrzepu. Obecnie nie ma testów biologicznych, które oceniałyby tendencję protrombotyczną u pacjentów ludzkich, a nasza praca stara się wypełnić tę lukę.
Dzięki wykrywaniu aktywności biomechanicznej próbek krwi, nasz test może kompleksowo ocenić właściwości protrombowe badanych. Nasz test może zostać rozwinięty jako kliniczny test wykrywający tendencję protrombotyczną u pacjentów, a także może być wykorzystywany do przesiewowych leków przeciwzakrzepowych nowej generacji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a novel thrombus profiling assay that integrates microfluidics with multi-color fluorescence imaging to comprehensively characterize biomechanical thrombogenesis. The method enables detailed analysis of thrombus formation under arterial shear conditions, providing seven distinct readouts related to thrombus size, composition, and platelet activation. This assay addresses the need for a robust bioassay to evaluate prothrombotic tendencies in humans and assess the efficacy of anti-thrombotic agents.
Key Study Components
Area of Science
- Hematology
- Bioengineering
- Microfluidics
- Thrombosis research
Background
- Thrombosis involves abnormal accumulation of platelets and clotting factors in blood vessels.
- Arterial thrombosis is often linked to elevated shear stress due to arterial stenosis.
- Biomechanical factors, such as blood flow, play a critical role in thrombus formation.
- Existing assays have not fully captured the biomechanical aspects of thrombogenesis.
Purpose of Study
- To develop an assay that profiles biomechanical thrombogenesis in detail.
- To enable comprehensive evaluation of prothrombotic tendencies in human blood samples.
- To provide a platform for testing anti-thrombotic agents and understanding arterial thrombosis mechanisms.
Methods Used
- Fabrication of microfluidic devices using PDMS and photolithography.
- Surface coating of microchannels with von Willebrand factor.
- Perfusion of heparinized human blood labeled with fluorescent biomarkers through stenotic microchannels.
- Real-time multi-color fluorescence imaging to monitor thrombus formation at the site of stenosis.
- Quantitative image analysis using ImageJ to measure thrombus area, biomarker signal intensity, and generate seven-dimensional thrombus profiles.
Main Results
- The assay successfully visualized and quantified thrombus formation under biomechanical (shear) conditions.
- Seven key parameters, including thrombus size and multiple biomarker signals, were measured simultaneously.
- Distinct profiles were generated for platelet accumulation, fibrinogen, von Willebrand factor, P-selectin, phosphatidylserine, and integrin activation.
- The method enabled continuous monitoring and quantitative analysis of thrombus development over time.
Conclusions
- This thrombus profiling assay fills a critical gap in evaluating biomechanical thrombogenesis.
- It offers a comprehensive tool for assessing prothrombotic risk and screening anti-thrombotic drugs.
- The approach can be further developed for clinical diagnostics and mechanistic studies of arterial thrombosis.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Biomechanical thrombogenesis presents a critical challenge in cardiovascular drug discovery, as traditional assays often fail to capture the complexity of thrombus formation under arterial shear conditions. The microfluidics-based thrombus profiling assay enables comprehensive, quantitative characterization of thrombus size, composition, and platelet activation, directly supporting predictive confidence in early-stage anti-thrombotic agent evaluation. This platform advances portfolio decision-making by providing mechanistic insights and robust risk assessment for candidate therapies targeting arterial thrombosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biomechanical pathways driving arterial thrombosis.
- Supports functional validation of targets involved in platelet activation and aggregation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying multiple thrombus biomarkers simultaneously.
- Improves predictive confidence for triaging anti-thrombotic candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for high-content screening of anti-thrombotic compounds.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative multi-parametric readouts.
- Enables scalable, platform-based evaluation of compound efficacy under physiologically relevant shear conditions.
- Supports reliable comparison of compound effects on thrombus formation and biomarker expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro thrombus formation with disease-relevant arterial shear profiles.
- Provides translational biomarker data for continuity from discovery to preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on comprehensive thrombus profiling.
- Supports mechanistic studies of arterial thrombosis relevant to human pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker validation for anti-thrombotic drug development.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical triggers and pathways of thrombogenesis for hypothesis testing and biological de-risking.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in a physiologically relevant context.
- Analytics: Generates seven-dimensional thrombus profiles, enabling robust statistical comparison across conditions and compounds.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant arterial thrombosis mechanisms for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic and imaging platform adaptable to diverse anti-thrombotic R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-thrombotic target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales multi-parametric thrombus analysis for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-thrombotic candidates based on comprehensive mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized instrumentation, including microfabrication and multi-channel fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different blood sources or disease models to ensure translational relevance.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret multi-dimensional thrombus profiles.
