Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej
9 stycznia 2026
Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.
Opracowaliśmy nową metodę, która może odpowiednio uchwycić biomechaniczne cechy zakrzepicy oraz wykrywać nieprawidłowości protrombotyczne u ludzi. Na początek użyj płytki krzemowej do wykonania formy głównej fotooporowej SU8 za pomocą standardowej fotolitografii na podstawie projektu i zabezpiecz formę główną na dnie 15-centymetrowej szalki Petriego taśmą. Przygotuj mieszankę polidimetylosiloksanu, czyli PDMS, mieszając bazę prepolimerową i środek utwardzający z zestawu silikonowego elastomeru w stosunku wagowym 10 do 1.
Wlej mieszankę PDMS na formę główną. Następnie umieść płytę zawierającą mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym, aby ją odgazować. Termicznie utwardzaj mieszaninę PDMS, umieszczając ją w inkubatorze ustawionym na 75 stopni Celsjusza na dwie godziny.
Po wyjęciu próbki z inkubatora ostrożnie wytnij utwardzone PDMS z formy głównej i podziel utwardzone PDMS na pojedyncze jednostki chipowe. Za pomocą igły sondy przebij otwory w wyznaczonych miejscach, aby utworzyć wlot i wylot. W okapie chemicznym użyj chusteczki zwilżonej etanolem 75%, aby wyczyścić szkła i je wysuszyć.
Następnie, używając generatora wysokiej częstotliwości, traktuj szkiełka przez 30 sekund, a układy PDMS przez 20 sekund. Wyrównaj każdy odcinek ze szklaną prowokacją i delikatnie dociskaj ją do powierzchni szklanej, aby ją związać. Teraz termicznie zmocnij urządzenia, umieszczając je w piekarniku ustawionym na 150 stopni Celsjusza na 15 minut.
Po związaniu przechowuj urządzenia w temperaturze pokojowej i bez kurzu. Następnie, używając szczypiec, usuń plastikową część igieł sondy i wygiń metalowe rurki pod kątem 90 stopni, aby stworzyć złącza dla urządzeń mikrofluidycznych. Po przygotowaniu reakcji na sprzężenie fibrynogenu i wymaganych przeciwciał z Alexa Fluor, wiruj kolumny oczyszczające w stężeniu 1 100 G przez dwie minuty, aby usunąć bufor magazynowy.
Po odrzuceniu przepływu przez środek załaduj roztwór reakcyjny na kolumnę oczyszczającą zamontowaną w kompatybilnej fiolce zbiorczej i wirówce o mocy 1,100 G przez pięć minut, aby pobrać wymaganą mieszankę. Za pomocą spektrofotometru zmierz absorpcję białka i sygnału barwnika. Oblicz stężenie białka oraz stosunek molowy fluorescencji do białka.
Farbniki przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Dodaj heparynę do buforu Tyrode do końcowego stężenia 0,32 jednostki na mililitr na 10 mililitrów krwi, która ma być pobrana, a strzykawkę przygotuj przez aspirację 500 mikrolitrów buforu Tyrode przy pH 7,4. Po pobraniu krwi za pomocą nakłucia żył w strzykawce zawierającej heparynę, przelej ją do 15-mililitrowej wirówki i utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Rozcieńcz monomer czynnika von Willebranda do dwóch mikrogramów na mililitr w PBS. Wstępnie pokryj urządzenia mikrofluidyczne rozcieńczonym monomerem czynnika von Willebranda i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz inkubuj próbkę krwi za pomocą czujników fluorescencyjnych ustawionych 1 lub 2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie podłącz urządzenie mikrofluidyczne z wlotami i wyjściami oraz rurkami. Podłącz drugi koniec złącza wlotowego do rurki zawierającej PBS, a następnie podłącz drugi koniec złącza do strzykawki. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, a urządzenie mikrofluidyczne na odwróconym mikroskopie.
Ręcznie obróć stopień mikroskopu, aby zlokalizować miejsce zwężenia. Napełnij kanał mikrofluidyczny i rurkę PBS za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,5 mililitra na minutę. Sprawdź urządzenie, aby upewnić się, że wokół miejsca zwężenia nie ma pęcherzyków powietrza.
Podłącz rurkę wlotową do próbki krwi i przeprowadź próbkę krwi przez kanał mikrofluidyczny za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,018 mililitra na minutę. W mikroskopie odwróconym ustaw czas naświetlania i wzmocnienie dla każdego kanału fluorescencyjnego w oprogramowaniu. Wykonaj wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, przeplatając cztery kanały i wzbudzając jeden fluoro-4 na raz.
Dostosuj płaszczyznę ostrości do zakrzepa i nagrywaj sygnały fluorescencyjne w miejscu zwężenia przez 15 do 30 minut. Do analizy danych otwórz plik danych używając wersji ImageJ 1.53. Użyj kanału SZ 22 fit C, aby zidentyfikować kontur trombu.
Następnie, używając wyborów wielokątów, mniej więcej wybierz obszar trombu. Dla każdego kanału usuń sygnał tła, wybierając obraz, wybierając Adjust, a następnie wybierając Threshold. Na koniec zmierz powierzchnię i średnią intensywność sygnału wewnątrz zakrzepu, wybierając Analizuj i wybierając Mierz.
Reprezentatywne zdjęcia pokazały zakrzepy powstałe we krwi w kanale stenotycznym z użyciem płytek krwi, fibrynogenu, czynnika von Willebranda i P-selektyny wizualizowanych za pomocą zestawu sensorów 1 oraz płytek krwi, fosfatydyloseryny, E-dodatniej integriny alfa IIb beta 3, aktywowanej integriny alfa IIb beta 3 wizualizowanych za pomocą zestawu czujników 2. Pojedynczy obraz kanału fluorescencyjnego był przetwarzany poprzez wyznaczenie obszaru krzepowego, usunięcie sygnału tła oraz pomiar powierzchni sygnału i średniej jasności, aby umożliwić analizę ilościową. Ciągła analiza intensywności sygnału fluorescencyjnego w czasie generowała krzywą sygnału względem czasu dla nagromadzenia płytek podczas tworzenia zakrzepów.
Dla każdego punktu czasowego uzyskano łączną intensywność sygnału dla czterech biomarkerów w zbiorze pierwszym oraz czterech biomarkerów w zbiorze drugim. Obliczono rozmiar zakrzepu i wygenerowano siedmiowymiarowy profil zakrzepu. Obecnie nie ma testów biologicznych, które oceniałyby tendencję protrombotyczną u pacjentów ludzkich, a nasza praca stara się wypełnić tę lukę.
Dzięki wykrywaniu aktywności biomechanicznej próbek krwi, nasz test może kompleksowo ocenić właściwości protrombowe badanych. Nasz test może zostać rozwinięty jako kliniczny test wykrywający tendencję protrombotyczną u pacjentów, a także może być wykorzystywany do przesiewowych leków przeciwzakrzepowych nowej generacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską analizę profilowania zakrzepów, która integruje mikroprzepływy z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym w celu kompleksowej charakterystyki biomechanicznej trombogenezy. Metoda ta umożliwia szczegółową analizę tworzenia się zakrzepów w warunkach ścinania tętniczego, dostarczając siedmiu odrębnych odczytów związanych z wielkością, składem i aktywacją płytek krwi. Analiza ta odpowiada na zapotrzebowanie na wiarygodny bioassay do oceny tendencji protrombotycznych u ludzi oraz badania skuteczności środków przeciwzakrzepowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hematologia
- Bioinżynieria
- Mikrofluidyka
- Badania nad zakrzepicą
Wprowadzenie
- Zakrzepica polega na nieprawidłowym gromadzeniu się płytek krwi i czynników krzepnięcia w naczyniach krwionośnych.
- Zakrzepica tętnicza jest często powiązana z podwyższonym naprężeniem ścinającym wynikającym ze zwężenia tętnicy.
- Czynniki biomechaniczne, takie jak przepływ krwi, odgrywają kluczową rolę w powstawaniu zakrzepu.
- Istniejące testy nie oddają w pełni biomechanicznych aspektów trombogenezy.
Cel badania
- Opracowanie testu umożliwiającego szczegółowe profilowanie biomechanicznej trombogenezy.
- Umożliwienie kompleksowej oceny tendencji prozakrzepowych w próbkach ludzkiej krwi.
- Stworzenie platformy do testowania środków przeciwtrombotycznych oraz zrozumienia mechanizmów zakrzepicy tętniczej.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych z wykorzystaniem PDMS i fotolitografii.
- Powlekanie powierzchni mikrokanałów czynnikiem von Willebranda.
- Perfuzja heparynizowanej krwi ludzkiej znakowanej fluorescencyjnymi biomarkerami przez mikrokanały zwężone.
- Wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym w celu monitorowania tworzenia zakrzepu w miejscu zwężenia.
- Ilościowa analiza obrazu przy użyciu programu ImageJ w celu pomiaru powierzchni zakrzepu, intensywności sygnału biomarkerów oraz wygenerowania siedmiowymiarowych profili zakrzepów.
Główne wyniki
- Test pozwolił na pomyślną wizualizację i kwantyfikację tworzenia się skrzepu w warunkach biomechanicznych (ścinania).
- Jednocześnie zmierzono siedem kluczowych parametrów, w tym wielkość skrzepu oraz sygnały wielu biomarkerów.
- Wygenerowano odrębne profile dla akumulacji płytek krwi, fibrynogenu, czynnika von Willebranda, P-selektyny, fosfatydyloseryny oraz aktywacji integryn.
- Metoda ta umożliwiła ciągłe monitorowanie i ilościową analizę rozwoju skrzepu w czasie.
Wnioski
- Niniejszy test profilowania zakrzepu wypełnia istotną lukę w ocenie biomechanicznej trombogenezy.
- Stanowi on kompleksowe narzędzie do oceny ryzyka protrombotycznego oraz przesiewowych badań leków przeciwzakrzepowych.
- Opisane podejście może zostać dalej rozwinięte na potrzeby diagnostyki klinicznej oraz badań mechanistycznych nad zakrzepicą tętniczą.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Biomechaniczna trombogeneza stanowi krytyczne wyzwanie w procesie opracowywania leków sercowo-naczyniowych, ponieważ tradycyjne testy często nie oddają złożoności tworzenia się skrzepów w warunkach ścinania tętniczego. Analiza profilowania zakrzepów oparta na mikrofluidyce umożliwia kompleksową, ilościową charakterystykę wielkości, składu i aktywacji płytek krwi w zakrzepie, co bezpośrednio zwiększa pewność prognostyczną przy ocenie przeciwzakrzepowych środków na wczesnym etapie badań. Platforma ta usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio leków, dostarczając wglądu w mechanizmy działania oraz rzetelnej oceny ryzyka dla potencjalnych terapii ukierunkowanych na zakrzepicę tętniczą.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek biomechanicznych napędzających zakrzepicę tętniczą.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w aktywację i agregację płytek krwi.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez jednoczesne ilościowe oznaczanie wielu biomarkerów zakrzepu.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy selekcji kandydatów na leki przeciwzakrzepowe.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy mikroprzepływowe do wysokoprzepustowego przesiewania związków przeciwzakrzepowych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe wieloparametryczne odczyty.
- Umożliwia skalowalną, platformową ocenę skuteczności związków w fizjologicznie istotnych warunkach ścinania.
- Wspiera wiarygodne porównywanie wpływu związków na tworzenie się zakrzepów i ekspresję biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność tworzenia zakrzepów in vitro z profilami ścinania tętniczego istotnymi dla przebiegu choroby.
- Dostarcza translacyjnych danych dotyczących biomarkerów, zapewniając ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o kompleksowe profilowanie zakrzepów.
- Wspiera badania mechanistyczne zakrzepicy tętniczej istotne dla patologii ludzkiej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z translacyjną walidacją biomarkerów w procesie opracowywania leków przeciwzakrzepowych.
- Biologia odkryć: Ilościowo określa biomechaniczne wyzwalacze i szlaki trombogenezy w celu testowania hipotez i minimalizacji ryzyka biologicznego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny związków w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Analityka: Generuje siedmiowymiarowe profile zakrzepów, umożliwiając solidne porównania statystyczne pomiędzy różnymi warunkami i związkami.
- Badania translacyjne: Dostosowuje wyniki in vitro do mechanizmów zakrzepicy tętniczej istotnych dla choroby w celu zapewnienia ciągłości przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę mikrofluidyczną i obrazową, którą można zaadaptować do różnorodnych programów B+R w zakresie leków przeciwzakrzepowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w walidacji celów przeciwzakrzepowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje wieloparametryczną analizę skrzepów w celu zapewnienia porównywalności międzyprogramowej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów przeciwzakrzepowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o kompleksowe dane mechanistyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroprzepływów, obrazowania fluorescencyjnego oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury, w tym urządzeń do mikrofabrykacji oraz wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów testowych i przepływów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych źródeł krwi lub modeli chorób w celu zapewnienia istotności translacyjnej.
- Zależy od rzetelnej analizy statystycznej w celu interpretacji wielowymiarowych profili zakrzepów.
