Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych
19 lipca 2024
Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.
Izolowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, znanych również jako PBMC, jest zazwyczaj długotrwałym i ręcznym procesem. Zauważyliśmy alternatywną metodę, która byłaby szybka do wdrożenia i zdolna do przetwarzania dużej liczby próbek. Nasz protokół oferuje zautomatyzowaną metodę o wysokiej przepustowości, zapewniając spójność, jednocześnie zapobiegając wypaleniu zawodowemu techników.
Szczegółowo opisujemy również naszą metodę kompatybilną z automatyzacją o średniej przepustowości, którą można wykorzystać podczas przestojów sprzętu. Ta opcja o średniej przepustowości jest bardziej przyjazną dla budżetu alternatywą dla innych laboratoriów. Biobank może teraz przetwarzać więcej próbek przy użyciu tej samej liczby techników.
Zwiększy to wielkość kolekcji próbek, a także jej różnorodność, umożliwiając przyszłe badania i poprawiając opiekę nad pacjentem. Na początek delikatnie odwróć 10-mililitrowe probówki z krwią pełną 10 razy w temperaturze pokojowej. Za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego odwirować probówki o stężeniu 800 G przez 10 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza z włączoną hamulcem.
Następnie umieść próbki w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sprawdź, czy nie ma trzech odrębnych warstw. Oznacz trzy pięciomililitrowe probówki z polistyrenu literami A, B i C. Zakręć i zbierz jeden mililitr kożucha przez aspirację i przenieś do probówki oznaczonej jako A. Następnie dodaj 60 mikrolitrów 0,1 molowego EDTA do probówki A zawierającej kożuch. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki koktajlowej do probówki A. Pipetować w górę i w dół co najmniej trzy razy, aby wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodać 890 mikrolitrów PBS do probówki A i wymieszać pipetując co najmniej trzy razy. Następnie wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund. Dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do probówki A i odpipetuj co najmniej trzy razy, aby dokładnie wymieszać kulki.
Natychmiast umieść probówkę A w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki B, zbierając klarowną frakcję bez czerwonych krwinek lub z minimalną ilością czerwonych krwinek w celu optymalnego odzyskania PBMC. Następnie wyjmij rurkę A ze stojaka na magnes i wyrzuć ją.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do zawiesiny komórek w probówce B i pipetuj w górę iw dół co najmniej trzy razy. Natychmiast umieść probówkę B w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki C, zbierając tylko klarowną frakcję.
Wyjmij rurkę B ze stojaka na magnes i wyrzuć ją. Następnie natychmiast umieść probówkę C w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do oznakowanej probówki wirówkowej i uzupełnić do dwóch mililitrów PBS.
Przenieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do kubka na próbkę automatycznego licznika komórek. Dodaj 450 mikrolitrów PBS, aby uzyskać liczbę komórek rozcieńczających od 1 do 10. Na początek oznacz dwie 14-mililitrowe probówki jako A i B, jedną 15-mililitrową probówkę wirówkową jako C i jedną 15-mililitrową probówkę wirówkową jako odpad.
Po odwirowaniu krwi pełnej zbierz i dodaj jeden mililitr przygotowanego płaszcza kożuchowego do probówki A. Dodaj 60 mikrolitrów 0,1 molowego EDTA do probówki A. Następnie wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund. Aby włączyć automatyczny instrument PBMC, włącz zasilanie z przodu urządzenia. Na ekranie głównym instrumentu wybierz Profil i wybierz żądany protokół.
Następnie wprowadź objętość początkową i powtórz dla każdej próbki. Wybierz wszystkie ćwiartki, które będą używać tego samego zestawu odczynników. Następnie załaduj oznaczone materiały eksploatacyjne, końcówki filtrów i pojemnik buforowy do każdej ćwiartki karuzeli instrumentów zgodnie z instrukcjami na ekranie automatycznego instrumentu PBMC.
Po zakończeniu ładowania zdejmij pokrywki z materiałów eksploatacyjnych i odczynników, a następnie wybierz opcję uruchom na ekranie instrumentu. Po zakończeniu przebiegu wybierz opcję rozładowuj i usuwaj próbki z karuzeli instrumentów. Przenieść 500 mikrolitrów komórek do kubka na próbkę, aby nie zliczać komórek w rozcieńczeniu.
Porównując zautomatyzowaną metodę opartą na kulkach z metodą ręczną, nie stwierdzono istotnych różnic w żywotności komórek ani całkowitej liczbie komórek. Metoda ręczna pozwoliła na przetworzenie ośmiu próbek w ciągu 43 minut, podczas gdy metoda automatyczna zajęła 57 minut, w tym 35 minut przetwarzania bez użycia rąk. Średnia żywotność komórek była większa niż 90% dla PMBC przetworzonych w ciągu pięciu dni i większa niż 75% dla tych przetworzonych w ciągu 10 dni.
Średnia wydajność PBMC zmniejszyła się o 50% po pięciu dniach w porównaniu z próbkami przetworzonymi w ciągu 24 godzin.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wysokoprzepustową zautomatyzowaną metodę izolacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) człowieka w celu zwiększenia wydajności i różnorodności biobankowania. Protokół ten zmniejsza obciążenie pracą technika, zachowując jednocześnie wysoką żywotność komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Biobankowanie
- Automatyzacja technik laboratoryjnych
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody izolacji PBMC są czasochłonne i pracochłonne.
- Techniki zautomatyzowane mogą usprawnić procesy i zwiększyć różnorodność próbek.
- Rośnie zapotrzebowanie na rozwiązania kostefektywne w warunkach laboratoryjnych.
Wykorzystane metody
- Zautomatyzowane protokoły izolacji o średniej przepustowości
- Ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej
- Wirowanie, separacja za pomocą kulek magnetycznych i zautomatyzowane liczenie komórek
Główne wyniki
- Metody zautomatyzowane wykazały przeżywalność i całkowitą liczbę komórek porównywalne z metodami manualnymi.
- Automatyzacja umożliwiła przetworzenie większej liczby próbek bez istotnych różnic w przeżywalności.
- Średnia przeżywalność komórek przekraczała 90% dla PBMC przetworzonych w ciągu pięciu dni.
Wnioski
- Badanie z sukcesem demonstruje wydajną i niezawodną zautomatyzowaną metodę izolacji PBMC.
- To usprawnienie jest kluczowe dla optymalizacji działań biobankowania oraz badań nad pacjentami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa immunomagnetyczna separacja PBMC za pomocą kulek rozwiązuje problemy ze skalowalnością i powtarzalnością w badaniach wczesnego etapu odkryć oraz badaniach translacyjnych. Ten przepływ pracy umożliwia biobankom i zespołom B+R przetwarzanie większych i bardziej zróżnicowanych zestawów próbek, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i spójnego rozkładu populacji. Podejście to wspiera niezawodne zastosowania w dalszych etapach analiz, zwiększając pewność prognostyczną i efektywność operacyjną w całym procesie odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką i spójną izolację PBMC do badań opartych na hipotezach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez dostarczanie populacji komórek odpornościowych o wysokiej żywotności.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki standaryzacji przygotowania próbek.
- Zwiększa pewność prognostyczną we wczesnym profilowaniu odpornościowym i analizie szlaków.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia walidowane preparaty PBMC odpowiednie do cytometrii przepływowej, testów immunologicznych i badań genomicznych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów w wielu seriach pomiarowych i przy różnych operatorach.
- Umożliwia skalowalne procesy przesiewowe poprzez zwiększenie przepustowości próbek i ograniczenie zmienności wynikającej z błędów manualnych.
- Wspiera rzetelną ocenę związków w testach opartych na komórkach odpornościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia populacje komórek odpornościowych istotne dla danej choroby w celu odkrywania i walidacji biomarkerów.
- Utrzymuje integralność próbek w badaniach podłużnych i wieloośrodkowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez zapewnienie spójnej jakości i żywotności komórek.
- Wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda izolacji PBMC oparta na kuleczkach immunomagnetycznych integruje się płynnie z procesem od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno manualne, jak i zautomatyzowane schematy pracy.
- Biologia odkrywcza: Standaryzuje izolację PBMC do testowania hipotez i analizy szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne preparaty komórek o wysokiej żywotności do opracowywania testów i przesiewów związków.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę stężenia komórek, ich żywotności oraz rozkładu populacji w celu przeprowadzenia rzetelnej analizy danych.
- Badania translacyjne: Zachowuje jakość próbek w celu dopasowania biomarkerów i prowadzenia badań istotnych dla patogenezy chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczne, skalowalne protokoły, które można dostosować do różnych wymagań dotyczących wydajności i budżetu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów izolacji PBMC.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie przetwarzania większej i bardziej zróżnicowanej liczby próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych związanych z odpornością.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza techniczna w zakresie separacji immunomagnetycznej i zautomatyzowanego liczenia komórek.
- Niezbędny jest dostęp do kompatybilnej aparatury zarówno dla przepływów pracy manualnych, jak i zautomatyzowanych.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest dostosowana do różnych objętości próbek i potrzeb przepustowości w różnych laboratoriach.
- Wydajność spada przy opóźnieniu w przetwarzaniu; optymalne wyniki uzyskuje się w ciągu 24 godzin od pobrania.
