Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Izolowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, znanych również jako PBMC, jest zazwyczaj długotrwałym i ręcznym procesem. Zauważyliśmy alternatywną metodę, która byłaby szybka do wdrożenia i zdolna do przetwarzania dużej liczby próbek. Nasz protokół oferuje zautomatyzowaną metodę o wysokiej przepustowości, zapewniając spójność, jednocześnie zapobiegając wypaleniu zawodowemu techników.

Szczegółowo opisujemy również naszą metodę kompatybilną z automatyzacją o średniej przepustowości, którą można wykorzystać podczas przestojów sprzętu. Ta opcja o średniej przepustowości jest bardziej przyjazną dla budżetu alternatywą dla innych laboratoriów. Biobank może teraz przetwarzać więcej próbek przy użyciu tej samej liczby techników.

Zwiększy to wielkość kolekcji próbek, a także jej różnorodność, umożliwiając przyszłe badania i poprawiając opiekę nad pacjentem. Na początek delikatnie odwróć 10-mililitrowe probówki z krwią pełną 10 razy w temperaturze pokojowej. Za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego odwirować probówki o stężeniu 800 G przez 10 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza z włączoną hamulcem.

Następnie umieść próbki w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sprawdź, czy nie ma trzech odrębnych warstw. Oznacz trzy pięciomililitrowe probówki z polistyrenu literami A, B i C. Zakręć i zbierz jeden mililitr kożucha przez aspirację i przenieś do probówki oznaczonej jako A. Następnie dodaj 60 mikrolitrów 0,1 molowego EDTA do probówki A zawierającej kożuch. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki koktajlowej do probówki A. Pipetować w górę i w dół co najmniej trzy razy, aby wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodać 890 mikrolitrów PBS do probówki A i wymieszać pipetując co najmniej trzy razy. Następnie wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund. Dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do probówki A i odpipetuj co najmniej trzy razy, aby dokładnie wymieszać kulki.

Natychmiast umieść probówkę A w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki B, zbierając klarowną frakcję bez czerwonych krwinek lub z minimalną ilością czerwonych krwinek w celu optymalnego odzyskania PBMC. Następnie wyjmij rurkę A ze stojaka na magnes i wyrzuć ją.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do zawiesiny komórek w probówce B i pipetuj w górę iw dół co najmniej trzy razy. Natychmiast umieść probówkę B w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do probówki C, zbierając tylko klarowną frakcję.

Wyjmij rurkę B ze stojaka na magnes i wyrzuć ją. Następnie natychmiast umieść probówkę C w stojaku magnetycznym i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową do oznakowanej probówki wirówkowej i uzupełnić do dwóch mililitrów PBS.

Przenieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do kubka na próbkę automatycznego licznika komórek. Dodaj 450 mikrolitrów PBS, aby uzyskać liczbę komórek rozcieńczających od 1 do 10. Na początek oznacz dwie 14-mililitrowe probówki jako A i B, jedną 15-mililitrową probówkę wirówkową jako C i jedną 15-mililitrową probówkę wirówkową jako odpad.

Po odwirowaniu krwi pełnej zbierz i dodaj jeden mililitr przygotowanego płaszcza kożuchowego do probówki A. Dodaj 60 mikrolitrów 0,1 molowego EDTA do probówki A. Następnie wiruj rurkę z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund. Aby włączyć automatyczny instrument PBMC, włącz zasilanie z przodu urządzenia. Na ekranie głównym instrumentu wybierz Profil i wybierz żądany protokół.

Następnie wprowadź objętość początkową i powtórz dla każdej próbki. Wybierz wszystkie ćwiartki, które będą używać tego samego zestawu odczynników. Następnie załaduj oznaczone materiały eksploatacyjne, końcówki filtrów i pojemnik buforowy do każdej ćwiartki karuzeli instrumentów zgodnie z instrukcjami na ekranie automatycznego instrumentu PBMC.

Po zakończeniu ładowania zdejmij pokrywki z materiałów eksploatacyjnych i odczynników, a następnie wybierz opcję uruchom na ekranie instrumentu. Po zakończeniu przebiegu wybierz opcję rozładowuj i usuwaj próbki z karuzeli instrumentów. Przenieść 500 mikrolitrów komórek do kubka na próbkę, aby nie zliczać komórek w rozcieńczeniu.

Porównując zautomatyzowaną metodę opartą na kulkach z metodą ręczną, nie stwierdzono istotnych różnic w żywotności komórek ani całkowitej liczbie komórek. Metoda ręczna pozwoliła na przetworzenie ośmiu próbek w ciągu 43 minut, podczas gdy metoda automatyczna zajęła 57 minut, w tym 35 minut przetwarzania bez użycia rąk. Średnia żywotność komórek była większa niż 90% dla PMBC przetworzonych w ciągu pięciu dni i większa niż 75% dla tych przetworzonych w ciągu 10 dni.

Średnia wydajność PBMC zmniejszyła się o 50% po pięciu dniach w porównaniu z próbkami przetworzonymi w ciągu 24 godzin.