Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Nasze laboratorium bada rozwój limfocytów T CD4 w różnych kontekstach tolerancji i odporności. We wszystkich naszych projektach interesuje nas przede wszystkim to, w jaki sposób ekspozycja na antygen napędza rozwój fenotypowych podzbiorów limfocytów T, które tworzą pamięć immunologiczną, która może zwiększyć tolerancję na siebie lub odporność na patogeny. Ostatnio skupiliśmy się na rozwoju podzbiorów regulatorowych i pamięciowych limfocytów T, które znajdują się w tkance płucnej.

Te rezydujące w tkance limfocyty T odgrywają ważną rolę we wzmacnianiu tolerancji na antygeny komórkowe podczas uszkodzenia tkanek lub promowaniu odpowiedzi zapalnych na patogeny podczas reinfekcji. Nasze laboratorium specjalizuje się w bezpośrednim badaniu limfocytów T specyficznych dla antygenu, z niestandardowymi odczynnikami tetrameru peptydowego MHC. To pozwala nam badać te limfocyty T bez użycia transgenicznych modeli TCR lub innych eksperymentalnych manipulacji, o których wiadomo, że powodują eksperymentalne artefakty.

Chociaż możemy łatwo zidentyfikować limfocyty T specyficzne dla antygenu za pomocą tetramerów, te limfocyty T są często obecne na bardzo niskich częstotliwościach, szczególnie gdy są w stanie naiwności lub pamięci. Wyzwaniem jest również wyizolowanie tych limfocytów T z tkanek nielimfatycznych, w których często znajdują się po odpowiedzi immunologicznej. Chociaż istnieje kilka ustalonych protokołów izolowania limfocytów T z płuc myszy, protokół, który tutaj prezentujemy, został zoptymalizowany pod kątem późniejszego wykrywania limfocytów T specyficznych dla antygenu o niskiej częstotliwości poprzez barwienie tetramerów.

W tym protokole uwzględniliśmy również dwie opcje dysocjacji tkanek, aby lepiej pomieścić żywe zasoby. Nasz protokół pomoże naukowcom rozszerzyć zastosowanie tetramerów do badania limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkance płucnej. Doprowadzą one do bardziej zaawansowanych badań in vivo nad rozwojem i funkcjonowaniem limfocytów T pamięci rezydującej w tkankach, które są tematami intensywnie interesującymi w tej dziedzinie.

Wstrzyknąć dożylnie od jednego do trzech miligramów sprzężonego z fluoroforem przeciwciała anty-mysiego CD45 rozcieńczonego w 100 mililitrach normalnej soli fizjologicznej do każdej znieczulonej myszy. Zacznij od umieszczenia czterech mililitrów lodowatego buforu HEPES przygotowanego w specjalistycznej probówce z dysocjacją tkanek na lodzie dla każdej myszy. Po eutanazji myszy umieść wycięte płuca w odpowiedniej probówce dysocjacyjnej tkanek schłodzonej na lodzie.

Umieść rurki na automatycznej dysocjacji tkanek i uruchom pierwszy wstępnie ustawiony program dla tkanki płucnej. Następnie dodać 500 mikrolitrów roztworu podstawowego liberazy i 500 mikrolitrów roztworu podstawowego aminoguanidyny do każdej probówki zawierającej zdysocjowaną tkankę płucną. Inkubuj go na mikserze do notacji przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umieść rurki z powrotem na dysocjatorze i uruchom drugi zaprogramowany program dla tkanki płucnej. Teraz wlej zawiesinę pojedynczej komórki z rurki dysocjatora tkanek przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz probówkę dysocjacyjną tkanek pięcioma mililitrami kompletnego EHAA i przepuść przez sitko do 50-mililitrowej probówki.

Po wyjęciu sitka zwiększyć objętość zawiesiny komórek do 50 mililitrów za pomocą pełnego EHAA. Zamiast używać specjalistycznych rurek z dysocjacją tkanek, umieść wycięte płuca w odpowiednich 1,5-mililitrowych probówkach do mikrofuge schłodzonych na lodzie. Po pobraniu wszystkich płuc przenieś każde płuco do świeżej probówki do mikrofuge bez żadnych pożywek komórkowych.

Za pomocą nożyczek pokrój płuca na małe fragmenty w probówce do mikrofuge. Dodaj jeden mililitr koktajlu trawiennego Liberase TM i DNase I do każdej tubki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej.

Następnie przelej próbkę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Odpipetować pozostałą próbkę na sitko. Rozetrzyj tkankę o siatkę gumową końcówką tłoka ze sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra.

Przepłucz sitko zimnym buforem sortującym, zbierając końcową objętość siedmiu mililitrów do probówki. Niezależnie od tego, czy stosuje się metodę dysocjacji automatycznej, czy ręcznej, odwiruj uzyskaną zawiesinę komórek. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów supernatantu i osad komórkowy.

Na koniec dodaj około 100 mikrolitrów roztworu blokowego FC, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 mikrolitrów i energicznie wiruj, aby ponownie zawiesić granulkę. Na początek dodaj 50 mikrolitrów mikrogranulek anty-mysich CD90.2 do izolowanych komórek płuc. Po wirowaniu mieszaniny inkubuj ją przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umieść paramagnetyczną kolumnę separacji komórek na jedno- lub czteropozycyjnym magnesie do separacji komórek. Umieść otwartą stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod każdą kolumną, aby uchwycić przepływ. Zalać kolumnę trzema mililitrami bufora do sortowania na zimno, umożliwiając grawitacyjne opróżnienie kolumny do stożkowej rurki poniżej.

Po inkubacji komórek z mikrogranulkami przez 10 minut, dodać bufor do sortowania na zimno do objętości jednego mililitra i przenieść mieszaninę przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów umieszczone na szczycie kolumny. Zebrać przepływ kolumny do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów umieszczonej pod kolumną. Gdy zawiesina komórek całkowicie spłynie przez kolumnę, dodaj dodatkowe trzy mililitry bufora do sortowania na zimno do oryginalnej probówki i nałóż go na kolumnę przez siatkę przed wyjęciem sitka.

Gdy próbka całkowicie spłynie do kolumny i nie wydostaje się przez nią dalszy przepływ, wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na świeżej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Dodaj pięć mililitrów buforu do sortowania na zimno do kolumny. Aby wymyć związane komórki, popchnij tłok kolumny w dół jednym ciągłym ruchem, wypychając bufor z dna do nowej rurki.

Odwirować eluowane próbki o masie 400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów supernatantu i osadu komórkowego. Średnio w procesie wzbogacania odzyskuje się ponad 99% wszystkich limfocytów T CD90.2+ z płuc o czystości większej niż 90%.

Po wzbogaceniu próbki płuc w poszukiwaniu limfocytów T dodaj jeden mililitr 10-milimolowego dazatynibu do każdej próbki. Zmieszaj mieszaninę i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodać peptyd peptydowy MHC PE lub sprzężony z APC do końcowego stężenia 10 nanomolowców.

Po wirowaniu mieszaniny inkubuj ją w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas gdy próbka jest barwiona peptydowymi tetramerami MHC, przygotuj główną mieszankę przeciwciał w celu wybarwienia markerów powierzchni komórki. Gdy pozostało 15 minut w okresie inkubacji barwienia tetramerowego, dodać powierzchniową mieszaninę wzorcową przeciwciał w rozcieńczeniu jeden do 100.

Dodaj 50 000 kulek cytometrii przepływowej i bufor sortownika na zimno, aby osiągnąć końcową objętość około pięciu mililitrów. Następnie dodać bufor do sortowania na zimno do objętości 15 mililitrów i odwirować probówkę o sile 400 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów supernatantu i osadu komórkowego.

Teraz ponownie zawieś próbkę za pomocą dodatkowych 200 mikrolitrów buforu sortera i przenieś ją do pięciomililitrowej probówki FACS.