Name: Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Poznaj metodę FISH do detekcji amplifikacji genów w próbkach FFPE z zastosowaniem technik hybrydyzacji fluorescencyjnej. Zoptymalizowane procedury poprawiają jakość danych cytogenetycznych w badaniach onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.W. jest stypendystą i jest wspierany przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR210034)

Ten protokół badawczy został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) University of Texas Southwestern Medical Center. Przed zabiegiem uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów
<ol>
	<li>Przygotować 0,2 N roztwór chlorku sodu (HCl) w dygestorium, powoli dodając 8,212 ml HCl (37% m/w lub 12,1 N) do 491,788 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Powoli dodawaj kwas do wody. Nie dodawaj wody do kwasu.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór kwasu cytrynowego (pH 6,0), rozpuszczając 1,47 g cytrynianu trisodowego (dwuwodnego) w 400 ml ddH2O. Użyj HCl, aby dostosować do pH 6,0, a następnie doprowadzić końcową objętość do 500 ml za pomocą ddH2O. Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 10% roztwór Tween-20, dodając 100 μL Tween-20 do 900 μL ddH2O. Przechowywać go w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 10% roztwór IGEPAL, dodając 5 ml IGEPAL CA-630 do 45 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 20 x roztwór SSC (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu), rozpuszczając 44,1 g cytrynianu trisodu (dwuwodnego) i 87,65 g chlorku sodu (NaCl) w 900 ml ddH2O. Użyj HCl, aby dostosować do pH 7,0, a następnie doprowadzić końcową objętość do 1000 ml za pomocą ddH2O. Przechowywać bufor w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Przygotować roztwór 2x SSC, dodając 100 ml 20x SSC do 900 ml ddH2O. W razie potrzeby dodać 0,5 ml środka konserwującego (tabela materiałów). Przechowuj go w RT.</li>
	<li>Przygotować bufor hybrydyzacyjny sondy, mieszając 910 μl ddH2O, 500 μl 20x SSC, 50 μl 10% Tween-20, 40 μl RNazy A, 1 ml 50% siarczanu dekstranu i 2,5 ml formamidu. Porcjować w 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 0,4x SSC z 0,3% roztworem IGEPAL, mieszając 100 ml 2x SSC, 15 ml 10% IGEPAL i 385 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 2x SSC z 0,1% roztworem IGEPAL, dodając 5 ml 10% IGEPAL do 495 ml 2x roztworu SSC. Przechowuj go w RT.</li>
	<li>Świeżo przygotuj bufor do trawienia proteinazy K przed użyciem, dodając 1 μl proteinazy K do 99 μl buforu Tris-EDTA.</li>
	<li>Przygotować 1 mg/ml DAPI poprzez rozpuszczenie 1 mg DAPI w 1 ml ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C, z dala od światła. Przygotować roztwór roboczy DAPI, dodając 1 μl zapasu do przechowywania DAPI do 999 μl 2x roztworu SSC. Przechowywać z dala od światła do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Wstępna obróbka próbki
UWAGA: Slajd używany tutaj zawiera próbkę.
<ol>
	<li>Postarzaj szkiełko w temperaturze 60-90°C przez 20 minut lub przez noc (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Ten krok ułatwia topienie parafiny. Zwykle wystarcza 20 minut ogrzewania. Można go przedłużyć do nocy, aby dostosować się do harmonogramu.</li>
	<li>Odparafinować szkiełko, zanurzając je w ksylenie lub jego substytutach w słoiku z kopliny na 10 minut. Powtórz ten krok ze świeżym ksylenem lub jego substytutami. Wykonaj wszystkie poniższe czynności związane z obróbką wstępną i myciem w słoiku Coplin. 
	UWAGA: Substytuty ksylenu są bezpieczną i przyjazną dla środowiska alternatywą dla ksylenu. Jeden z substytutów (patrz Tabela materiałów) działa równie dobrze jak ksylen, jeśli nie lepiej. Chociaż substytuty ksylenu wytwarzają mniej zapachu niż ksylen, zaleca się stosowanie go wewnątrz dygestoria. Jeśli substytuty ksylenu nie są dostępne, wszystkie procedury są zgodne z deparafinowaniem na bazie ksylenu bez żadnych zmian.</li>
	<li>Zmywaj substytut ksylenu 100% etanolem przez 5 minut.</li>
	<li>Nawodnij zjeżdżalnię za pomocą 70% zanurzenia w etanolu przez 5 minut.</li>
	<li>Zanurzyć szkiełko w 0,2 N kwasie solnym (HCl) w temperaturze pokojowej na 20 minut 
	UWAGA: HCl skutecznie ekstrahuje białka rozpuszczalne w kwasach, takie jak podstawowe białka jądrowe, w celu poprawy dostępności DNA dla sond FISH11.</li>
	<li>Zanurzyć szkiełko w 10 mM gorącego roztworu kwasu cytrynowego i inkubować w temperaturze 90-95 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Obróbka kwasem cytrynowym w wysokich temperaturach podobnie ekstrahuje białka rozpuszczalne w kwasach. Uważa się, że obie metody leczenia kwasami ekstrahują białka macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zmniejszenia autofluorescencji12. Zaleca się, aby roztwór cytrynowy został wstępnie podgrzany do żądanego zakresu temperatur przed nałożeniem na szkiełko. Kuchenka mikrofalowa może być na to wygodnym sposobem. Kąpiel wodna, taka jak kuchenka do sous vide, jest najskuteczniejszym i najbardziej ekonomicznym rozwiązaniem do inkubacji w wysokiej temperaturze.</li>
	<li>Przepłucz krótko szkiełko w 2x SSC, aby zneutralizować pH.</li>
	<li>Trawić tkankę, dodając 100-200 μl (wystarczająco, aby całkowicie pokryć tkankę, w zależności od wielkości sekcji) buforu do trawienia proteinazy K i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min. 
	UWAGA: Trawienie proteinazy K dodatkowo zwiększa dostępność sond FISH i zmniejsza autofluorescencję. Czas trawienia powinien być zoptymalizowany w zależności od typu tkanki. W większości przypadków wystarczy 1 minuta trawienia. Nadmierne trawienie prowadzi do morfologii jąder w kształcie aureoli, a czas trawienia powinien zostać skrócony.</li>
	<li>Natychmiast przerwij trawienie proteinazy K i odwodnij szkiełko, zanurzając je w 70% etanolu na 2 minuty, a następnie poddaj je działaniu 85% i 100% etanolu na 2 minuty każde.</li>
</ol>
3. RYBY i obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę do hybrydyzacji FISH, rozcieńczając 2 μl bulionu z sondy FISH z 8 μl buforu hybrydyzacyjnego, a następnie nałóż ją na szkiełko. Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Całkowita ilość użytej sondy FISH waha się od 0,5 do 4 μl, w zależności od jakości obrazu. Jeśli sygnał jest zbyt niski, zwiększ wejście sondy. Zmniejsz wejście sondy FISH, jeśli tło jest zbyt wysokie, zwłaszcza gdy obserwuje się fluorescencyjne szczątki na zewnątrz jąder. Bufor hybrydyzacyjny może być dostarczony z sondami zakupionymi w handlu lub przygotowany zgodnie z sekcją 1.</li>
	<li>Umieść szkiełka na gorącej płycie, takiej jak system hybrydyzacji fosy szkiełkowej, aby denaturować DNA w temperaturze 75 °C przez 2-5 minut. Następnie przenieś szkiełko na inną płytę grzejną ustawioną w temperaturze 37 °C w celu hybrydyzacji przez noc. 
	UWAGA: Jeśli płyta grzejna ma tacę na wodę lub zbiornik w celu utrzymania wilgotności podczas hybrydyzacji, uszczelnianie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym nie jest konieczne.</li>
	<li>Po hybrydyzacji zanurzyć szkiełko w temperaturze 40-60 °C ogrzanym 0,4x SSC z 0,3% buforem myjącym IGEPAL CA-630, a następnie ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe. Kontynuuj pranie dwa razy przez 5 minut w ciemności, mieszając przez pierwsze 10-15 s. 
	UWAGA: Zanurzenie szkiełka w buforze do mycia pomaga delikatnie zwolnić szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Myć szkiełko w SSC 0,1% IGEPAL CA-630 przez 5 min w temperaturze RT w ciemności, z mieszaniem przez pierwsze 10-15 s.</li>
	<li>Aby wygasić autofluorescencję, należy potraktować szkiełko zestawem do hartowania autofluorescencji (patrz Tabela materiałów), nakładając 150 μL odczynnika (50 μL + 50 μL + 50 μL odczynników A, B, C) przez 2-5 min, a następnie przemyć je 2x SSC przez 5 min. 
	UWAGA: Jest to krok opcjonalny. Autofluorescencja tkankowa wywodzi się przede wszystkim ze składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen i elastyna. Znaczący wpływ mają również lizosomy i mitochondria ze względu na zawartość lipofuscyny, NADPH i koenzymu flawiny. Wiązanie aldehydu i obecność komórek krwi mogą również dobrze zwiększać autofluorescencję13,14.</li>
	<li>Szkiełko należy zabarwić DAPI przez 10 min. Przepłukać szkiełko 2x buforem SSC przez 5 min. 
	UWAGA: Jeśli szkiełko nie zostanie poddane obróbce za pomocą zestawu do hartowania autofluorescencji, barwienie DAPI można skrócić do 2 minut.</li>
	<li>Szybko zanurz szkiełko w wodzie dejonizowanej na nie dłużej niż 1 s, a następnie szybko wysusz, wchłaniając dodatkową wilgoć ręcznikiem papierowym. 
	UWAGA: Jest to krok opcjonalny. Uzdatnianie wody dejonizowanej skutecznie zapobiega osadzaniu się kryształów soli w buforze SSC na szkiełku i poprawia jakość obrazowania. Jednak w tak niskich warunkach jonowych wiązania wodorowe między sondą FISH a docelowym DNA są osłabione, co prowadzi do dysocjacji sondy i utraty sygnału. Dlatego kluczowe znaczenie ma utrzymanie etapu uzdatniania wody przez bardzo krótki czas.</li>
	<li>Osusz szkiełko, a następnie zamontuj je za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Jeśli szkiełko jest poddawane działaniu odczynnika do gaszenia autofluorescencji, należy zamontować szkiełko za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zgodnie z instrukcją producenta. Ponadto, w zależności od rodzaju materiału montażowego, utwardzającego lub nieutwardzającego, próbka musi być utwardzona przez 1-24 godziny przed uszczelnieniem i obrazowaniem. Zaleca się, aby próbka była utwardzana co najmniej przez noc, aby uzyskać najlepszy współczynnik załamania światła do obrazowania.</li>
	<li>Użyj soczewki olejowej 60×, aby uchwycić sygnał fluorescencji. Użyj kanału DAPI, aby dostosować ostrość. Upewnij się, że uzyskałeś wiele stosów Z. Zazwyczaj wystarczy 5-10 stosów z odstępem 1 μm. Wykonaj maksymalną projekcję 3D, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość. Zastosuj dekonwolucję lub inne algorytmy czyszczenia tła, aby jeszcze bardziej poprawić jakość obrazu.</li>
</ol>

Enhancing FISH Analysis for Oncogenic Drivers in Cancer Tissue Samples

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. jest członkiem naukowej rady doradczej Dimension Genomics Inc.

FISH to szybka i niedroga opcja do diagnostyki cytogenetycznej. Szczególnie w określaniu, czy ecDNA jest obecne w raku, dowody FISH pozostają złotymstandardem1. FISH w tkance FFPE umożliwia szybkie określenie statusu genów w próbkach biopsyjnych pacjenta, co pozwala na szybszą diagnozę i śledzenie zmian w trakcie postępu choroby. Technika ta jest szczególnie cenna w przypadku badania próbek klinicznych, które zostały już pobrane do celów patologicznych.
Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym krokiem jest dokładna deparafinizacja. Resztkowa parafina może zakłócić hybrydyzację FISH. Jeśli po etapie 2 próbka nadal wydaje się woskowata, należy ją ponownie poddać działaniu świeżego ksylenu lub jego substytutów.
Po drugie, ekstrakcja i trawienie białka mają kluczowe znaczenie. Procesy te nie tylko zwiększają dostęp DNA do sondy FISH, ale także znacznie zmniejszają autofluorescencję. Protokół ten obejmuje trzy etapy deproteinizacji. Podczas gdy leczenie 0,2 N HCl i 10 mM kwasem cytrynowym jest proste, trawienie proteinazy K może wymagać optymalizacji. Nadmierne trawienie jest najczęstszym błędem podczas stosowania proteinazy K, co skutkuje jądrami w kształcie halo. Skrócenie czasu trawienia poprawi morfologię jąder. Dodatkowo zaleca się, aby nie trawić więcej niż czterech próbek jednocześnie, aby zminimalizować różnicę czasu między pierwszą a ostatnią próbką. Ważne jest, aby pamiętać, że nawet nienaruszone jądro może wyglądać jak halo pod mikroskopem w dużym powiększeniu i wysokiej rozdzielczości. Dzieje się tak, ponieważ jądro nie znajduje się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Dlatego sugeruje się, aby wziąć wiele stosów Z i wykonać maksymalną projekcję w celu sprawdzenia morfologii jądrowej.
Na koniec zalecana jest autofluorescencja gaszenia. Chociaż ekstrakcja kwasem i trawienie proteinazy K mogą znacznie zmniejszyć tło pochodzące z białek, metabolity fluorescencyjne mogą nadal wpływać na jakość obrazowania.
Chociaż FISH oferuje niezrównaną rozdzielczość przestrzenną w identyfikacji ogniskowej amplifikacji genów, ma ograniczenia. Po pierwsze, zawartość i przepustowość są niskie w porównaniu z podejściami opartymi na PCR lub sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Zazwyczaj na jedno szkiełko można nałożyć od jednej do trzech sond FISH o różnych kolorach bez specjalistycznego sprzętu. Niemniej jednak postęp w technologiach automatyzacji umożliwił stosowanie FISH o wysokiej zawartości i przepustowości, takich jak sekwencjonowanie in situ 21. Po drugie, konstrukcja sondy FISH wymaga wcześniejszych informacji. Nieustanne wysiłki mające na celu zidentyfikowanie nawracających ogniskowych zdarzeń amplifikacji w nowotworach umożliwiły stworzenie wstępnie zaprojektowanych paneli FISH do zastosowań laboratoryjnych i klinicznych. Na przykład onkogeny z rodziny MYC są często amplifikowane jako ecDNA w drobnokomórkowym raku płuca w celu pośredniczenia w oporności na chemioterapię. W związku z tym panel FISH ukierunkowany na geny MYC, MYCL i MYCN może przyspieszyć określenie odpowiedzi na leczenie w biopsjach. Dla porównania, NGS pozwala na bardziej bezstronne badania przesiewowe genów, które są przedmiotem zainteresowania. Jednak wśród technologii opartych na NGS tylko sekwencjonowanie całego genomu z kosztowną analiząobliczeniową 22 może scharakteryzować ecDNA.
Podsumowując, przedstawiamy solidne i kompleksowe instrukcje dotyczące badania ogniskowej amplifikacji genów w próbkach FFPE. Badając wzorzec sygnału FISH, staje się jednoznacznie jasne, czy i w jaki sposób locus genu jest amplifikowany. Przewidujemy integrację uczenia maszynowego z analizą obrazu23 jąder międzyfazowych w celu wyodrębnienia informacji cytogenetycznych dotyczących liczby kopii i formy amplifikacji (chromosomu lub ecDNA), usprawniając w ten sposób proces diagnostyki molekularnej i zwiększając nasze zrozumienie mechanizmów patogenetycznych w raku.

Badanie ogniskowej amplifikacji onkogenu jest kluczowe, ponieważ napędza powstawanie, progresję i oporność na terapię raka1. Co ważne, onkogeny i geny immunoregulacyjne mogą amplifikować się jako pozachromosomalne DNA (ecDNA), których asymetryczne dziedziczenie sprzyja heterogeniczności genetycznej w raku2,3. ecDNA zostało powiązane z opornością na terapię i niekorzystnymi wynikami klinicznymi4,5,6.
Próbki tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie stanowią ogromny zasób archiwalny w laboratoriach patologicznych, oferując obfite informacje do badań retrospektywnych. Jednak ekstrakcja danych molekularnych z próbek FFPE za pomocą PCR lub sekwencjonowania jest trudna ze względu na fragmentację, degradację i sieciowanie kwasów nukleinowych podczas utrwalania7. Spośród szeregu technik dostępnych do analizy molekularnej tkanek FFPE, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) okazała się skuteczna w wizualizacji określonych sekwencji DNA8.
Pomimo postępu nowoczesnych technik diagnostyki molekularnej, zdolność FISH do wizualizacji i ilościowego określania amplifikacji genów na poziomie pojedynczej komórki dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw nowotworzenia i wyników klinicznych. Korzystając ze znakowanych fluorescencyjnie sond komplementarnych do docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania, FISH może wygodnie określić lokalizację onkogenu i wywnioskować formę amplifikacji onkogenu (taką jak ecDNA) w poszczególnych komórkach, co w innym przypadku jest niemożliwe lub kosztowne przy użyciu innych technologii. Dlatego FISH oferuje ekonomiczny sposób oceny heterogeniczności guza i ewolucji klonalnej9. Co więcej, postępy w automatyzacji, obrazowaniu i analizie obliczeniowej ułatwiły wysokoprzepustową analizę danych FISH, umożliwiając solidną kwantyfikację amplifikacji genów w dużych kohortach tkankowych10.
Jednak zastosowanie FISH do tkanki FFPE wiąże się z nieodłącznymi wyzwaniami, w tym z artefaktami sieciowania i autofluorescencji tła. Pokonanie tych przeszkód wymaga starannej optymalizacji każdej procedury, aby zapewnić dokładne i powtarzalne wyniki. W tym artykule przedstawiono krok po kroku, w pełni zoptymalizowany protokół stosowania FISH do badania amplifikacji genów w próbkach tkanek FFPE. Za pomocą sondy ukierunkowanej na locus genu ERBB2 (HER2) wykazaliśmy, że FISH może solidnie wykryć status amplifikacji ERBB2 w próbkach FFPE od pacjentek z rakiem piersi. Możliwe jest nawet oszacowanie, czy ERBB2 jest amplifikowany jako ecDNA. Syntetyzując istniejącą literaturę i wyniki naszych eksperymentów, wyjaśniamy względy metodologiczne, wyzwania techniczne i potencjalne pułapki analizy opartej na FISH. Omawiamy również kliniczne znaczenie profilowania amplifikacji genów w różnych typach nowotworów, podkreślając jego znaczenie prognostyczne i potencjał dla spersonalizowanych strategii terapeutycznych.
Podsumowując, ten artykuł podkreśla znaczenie FISH jako cennego narzędzia do badania amplifikacji genów w próbkach tkanek FFPE, oferując niezrównany wgląd w biologię nowotworów i pomagając w podejmowaniu decyzji klinicznych w onkologii. Dzięki ciągłemu udoskonalaniu i integracji z komplementarnymi testami molekularnymi, analiza oparta na projekcie FISH może jeszcze bardziej poszerzyć naszą wiedzę na temat patogenezy nowotworów i poprawić wyniki leczenia pacjentów w erze medycyny precyzyjnej.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>Barwienie jądra</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu 50% roztwór</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>Sonda buforowa do hybrydyzacji</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) FISH Sonda</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>Sonda FISH</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Odwadnianie i nawilżanie tkanki</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Scientific Chemikalia</td><td>205821000</td><td>Bufor hybrydyzacyjny sondy</td></tr><tr><td>Formuła 83 (substytut ksylenu)</td><td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>Usuwanie parafiny</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td>Obróbka wstępna próbki</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>Mycie szkiełek</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>Konserwant do buforu SSC (opcjonalnie</td></tr><tr><td>)Proteinaza K (800 jednostek/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>Trawienie białek</td></tr><tr><td>RNaza A (20 mg / ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>Bufor hybrydyzacyjny sondy</td></tr><tr><td>System hybrydyzacji</td> <td>fosy ślizgowejBoekel Scientific</td><td>280001</td><td>Denaturyzacja i hybrydyzacja próbek. Dopuszczalne są alternatywne płyty grzejne.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Bufor SSC</td><td>Fisher Chemical</td><td>S2713</td></tr><tr><td>Dwuwodny cytrynian sodu</td><td>Odczynniki Fisher BioReagents</td><td>FLBP3271</td><td>bufor SSC i wstępna obróbka próbki</td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA (TE)</td><td>Odczynniki Fisher BP2473500</td><td></td><td>Bufor do trawienia proteinazy K</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td>Bufor hybrydyzacyjny sondy</td></tr><tr><td>Vectashield Nośniki montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H190010</td><td>Montaż ślizgowy</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>Zestaw do hartowania autofluorescencji</td></tr></tbody></table>

niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Ogniskowa amplifikacja genów, taka jak pozachromosomalne DNA (ecDNA), odgrywa ważną rolę w rozwoju raka i oporności na terapię. Podczas gdy metodologie oparte na sekwencjonowaniu umożliwiają bezstronną identyfikację ecDNA, techniki oparte na cytogenetyce, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), pozostają efektywne czasowo i kosztowo w identyfikacji ecDNA w próbkach klinicznych. Zastosowanie FISH w próbkach tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie oferuje unikalną drogę do wykrywania amplifikowanych genów, szczególnie gdy żywe próbki nie są dostępne do badania kariotypu. Brakuje jednak procedur konsensusu w odniesieniu do tej techniki. Protokół ten zawiera kompleksowe, w pełni zoptymalizowane instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania FISH w celu wykrycia amplifikacji genów, w tym ecDNA, w próbkach tkanek FFPE, które stanowią wyjątkowe wyzwania, które ten protokół ma na celu przezwyciężyć i ustandaryzować. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą w powtarzalny sposób pozyskiwać wysokiej jakości dane obrazowe w celu oceny amplifikacji genów.

Wykorzystaliśmy próbki FFPE z nowotworów piersi HER2-dodatnich oraz HER2-ujemnych, aby zaprezentować wyniki obrazowania FISH. Amplifikacja HER2 (kodowanego przez gen ERBB2) jest markerem korzystnym ze względu na dostępność i skuteczność terapii celowanych molekularnie przeciwko HER2. Przeciwnie, pacjentki z potrójnie ujemnym rakiem piersi, w którym brakuje ekspresji HER2, receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR), mają gorsze rokowania ze względu na ograniczone opcje terapeutyczne. Dlatego określenie statusu HER2 jest kluczowe w badaniach i leczeniu raka piersi15.
W próbce raka piersi potrójnie ujemnego większość jąder wykazuje dwie odrębne kropki reprezentujące sygnały FISH dla HER2/ERBB2. Niektóre jądra mogą posiadać tylko jedną kropkę z powodu błędu wynikającego z cięcia preparatu (Rysunek 2, lewo). W przeciwieństwie do nich, próbki HER2-dodatnie wykazują liczne sygnały FISH w dwóch różnych wzorcach. Jeden wzorzec charakteryzuje się rozproszonymi kropkami w całym jądrze (Rysunek 2, środek). Wzorzec ten jest charakterystyczny dla morfologii ecDNA, ponieważ ecDNA mogą nie zajmować unikalnego i zorganizowanego terytorium jądrowego16. Co więcej, asymetryczna segregacja ecDNA podczas mitozy napędza zmienność liczby kopii, prowadząc do heterogeniczności sygnałów między jądrami17. Niektóre jądra mogą wykazywać sporadyczne skupiska, co wskazuje na obecność hubów ecDNA18 (Rysunek 2, prawo). Drugi typ amplifikacji HER2 objawia się głównie pod postacią prętowatych, skondensowanych agregatów. Morfologia ta prawdopodobnie wskazuje na amplifikację opartą na chromosomach, taką jak regiony homogenicznie barwiące się (HSR)19 lub wynikającą z cyklu pęknięcia-fuzji-mostka (BFB)20. Warto zauważyć, że amplifikacje ecDNA, HSR i BFB mogą współistnieć w tym samym jądrze. Dlatego zaleca się badanie wielu jąder, aby określić formę amplifikacji ogniskowej.
<img alt="Schemat przygotowania tkanki: proces obejmuje odparafinizowanie, ekstrakcję białek oraz hybrydyzację FISH." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat badania FISH w próbkach FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie linii komórkowych HER2, ecDNA i typu HSR z użyciem DAPI i FISH ERBB2; mikroskopia fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywny obraz FISH w próbkach FFPE z raka piersi. Powiększenie: 600x; Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Amplifikacja onkogenu jest kluczowym czynnikiem powodującym raka. Charakterystyka cytogenetyczna na próbkach FFPE jest opłacalnym sposobem badania amplifikacji onkogenu. Przedstawiamy solidne i kompleksowe instrukcje dotyczące badania ogniskowej amplifikacji genów i próbek FFPE.Badając wzorzec sygnału FISH, staje się jednoznacznie jasne, czy i w jaki sposób locus genu jest amplifikowany. Stwierdzono, że onkogeny amplifikowane jako dodatkowe chromosomalne DNA są powszechne w raku człowieka, takim jak rak płuc, piersi i mózgu. Sekwencjonowanie całego genomu w FISH jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania dodatkowego chromosomalnego DNA.Zastosowanie FISH do tkanek FFPE jest trudne, ponieważ artefakty sieciowania i autofluorescencja tła często pogarszają jakość danych. Nasz protokół obejmuje zoptymalizowane procedury, w tym ekstrakcję i trawienie białek, techniki ogrzewania i hartowania autofluorescencji w celu poprawy jakości danych podczas badania FISH na próbkach FFPE, co dostarczy cennych informacji na temat progresji raka u pacjentów. Będziemy badać funkcje molekularne dodatkowego chromosomalnego DNA i sposób, w jaki komórki rakowe utrzymują dodatkowe chromosomalne DNA.Docelowo dążymy do ich wyeliminowania w celu leczenia raka. Aby rozpocząć, zaopatrz się w szkiełko zamontowane na próbce po jego starzeniu. W celu wstępnej obróbki szkiełka należy zanurzyć je seryjnie w słoikach z kopeliną zawierających odpowiednie roztwory na określony czas.Trawić tkankę za pomocą 100 do 200 mikrolitrów buforu do trawienia proteinazy K i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Aby zatrzymać trawienie, należy natychmiast zanurzyć szkiełko szeregowo w roztworach etanolu na dwie minuty każdy. Nanieść mieszankę do hybrydyzacji FISH na szkiełko podstawowe i przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym.Umieść szkiełka na płycie grzejnej, takiej jak system hybrydyzacji fosy szkiełkowej w temperaturze 75 stopni Celsjusza na dwie do pięciu minut. Następnie przenieś szkiełko na inną płytę grzejną ustawioną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby hybrydyzować przez noc. Następnie zanurz szkiełko w ciepłym buforze do mycia i ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe.Umyj i zabarwij szkiełko za pomocą odpowiednich odczynników w ciemności. Szybko zanurz szkiełko w dejonizowanej wodzie na nie dłużej niż jedną sekundę i połóż je na ręczniku papierowym. Po wyschnięciu zamontuj szkiełko za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu.Umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij je lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Używając soczewki olejowej 60X, uchwyć sygnał fluorescencyjny w wielu stosach Z. Na koniec wykonaj maksymalną projekcję 3D, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość i zastosuj dekonwolucję lub inne algorytmy czyszczenia tła.W potrójnie ujemnych próbkach raka piersi, jądrowy FISH wykazuje przede wszystkim dwie wyraźne kropki na jądro, reprezentujące sygnały HER2 ERBB-2. W przeciwieństwie do tego, próbki HER2-dodatnie wykazują obfite sygnały FISH, co wskazuje na różne wzorce amplifikacji genów. Dodatkowo, niektóre jądra w próbkach HER2-dodatnich mogą wykazywać klastry, co sugeruje dodatkowe chromosomalne węzły DNA, które są punktami centralnymi dla zwiększonej amplifikacji genów.

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Ten film opisuje strategię sekwencyjnej hybrydyzacji, która polega na hybrydyzacji sond mRNA do określonego docelowego mRNA. Po hybrydyzacji sondy przeprowadza się wzmocnienie sygnału w celu zwiększenia rozdzielczości poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu podczas RNA-CISH próbek histologicznych.

Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału w hybrydyzacji RNA in situ: technika wykrywania określonych sekwencji RNA w skrawkach tkanek

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę FISH do detekcji amplifikacji genów w próbkach FFPE z zastosowaniem technik hybrydyzacji fluorescencyjnej. Zoptymalizowane procedury poprawiają jakość danych cytogenetycznych w badaniach onkologicznych.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (Wideo) | JoVE Journal

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Przeglądaj więcej filmów