Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ
12 lipca 2024
Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.
Amplifikacja onkogenu jest kluczowym czynnikiem powodującym raka. Charakterystyka cytogenetyczna na próbkach FFPE jest opłacalnym sposobem badania amplifikacji onkogenu. Przedstawiamy solidne i kompleksowe instrukcje dotyczące badania ogniskowej amplifikacji genów i próbek FFPE.
Badając wzorzec sygnału FISH, staje się jednoznacznie jasne, czy i w jaki sposób locus genu jest amplifikowany. Stwierdzono, że onkogeny amplifikowane jako dodatkowe chromosomalne DNA są powszechne w raku człowieka, takim jak rak płuc, piersi i mózgu. Sekwencjonowanie całego genomu w FISH jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania dodatkowego chromosomalnego DNA.
Zastosowanie FISH do tkanek FFPE jest trudne, ponieważ artefakty sieciowania i autofluorescencja tła często pogarszają jakość danych. Nasz protokół obejmuje zoptymalizowane procedury, w tym ekstrakcję i trawienie białek, techniki ogrzewania i hartowania autofluorescencji w celu poprawy jakości danych podczas badania FISH na próbkach FFPE, co dostarczy cennych informacji na temat progresji raka u pacjentów. Będziemy badać funkcje molekularne dodatkowego chromosomalnego DNA i sposób, w jaki komórki rakowe utrzymują dodatkowe chromosomalne DNA.
Docelowo dążymy do ich wyeliminowania w celu leczenia raka. Aby rozpocząć, zaopatrz się w szkiełko zamontowane na próbce po jego starzeniu. W celu wstępnej obróbki szkiełka należy zanurzyć je seryjnie w słoikach z kopeliną zawierających odpowiednie roztwory na określony czas.
Trawić tkankę za pomocą 100 do 200 mikrolitrów buforu do trawienia proteinazy K i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Aby zatrzymać trawienie, należy natychmiast zanurzyć szkiełko szeregowo w roztworach etanolu na dwie minuty każdy. Nanieść mieszankę do hybrydyzacji FISH na szkiełko podstawowe i przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym.
Umieść szkiełka na płycie grzejnej, takiej jak system hybrydyzacji fosy szkiełkowej w temperaturze 75 stopni Celsjusza na dwie do pięciu minut. Następnie przenieś szkiełko na inną płytę grzejną ustawioną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby hybrydyzować przez noc. Następnie zanurz szkiełko w ciepłym buforze do mycia i ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe.
Umyj i zabarwij szkiełko za pomocą odpowiednich odczynników w ciemności. Szybko zanurz szkiełko w dejonizowanej wodzie na nie dłużej niż jedną sekundę i połóż je na ręczniku papierowym. Po wyschnięciu zamontuj szkiełko za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu.
Umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij je lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Używając soczewki olejowej 60X, uchwyć sygnał fluorescencyjny w wielu stosach Z. Na koniec wykonaj maksymalną projekcję 3D, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość i zastosuj dekonwolucję lub inne algorytmy czyszczenia tła.
W potrójnie ujemnych próbkach raka piersi, jądrowy FISH wykazuje przede wszystkim dwie wyraźne kropki na jądro, reprezentujące sygnały HER2 ERBB-2. W przeciwieństwie do tego, próbki HER2-dodatnie wykazują obfite sygnały FISH, co wskazuje na różne wzorce amplifikacji genów. Dodatkowo, niektóre jądra w próbkach HER2-dodatnich mogą wykazywać klastry, co sugeruje dodatkowe chromosomalne węzły DNA, które są punktami centralnymi dla zwiększonej amplifikacji genów.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia odtwarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Dzięki zastosowaniu technik FISH badacze mogą skutecznie badać amplifikację onkogenów, która stanowi istotny czynnik progresji nowotworu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Genetyka
- Cytogenetyka
Wstęp
- Amplifikacja onkogenów jest kluczowym czynnikiem napędzającym rozwój nowotworów.
- Próbki FFPE są powszechnie stosowane w charakterystyce cytogenetycznej.
- Techniki FISH są niezbędne do wykrywania amplifikacji genów.
- Wyzwania obejmują artefakty sieciowania oraz autofluorescencję w tkankach FFPE.
Cel badania
- Zapewnienie zoptymalizowanych procedur FISH dla próbek FFPE.
- Zbadanie funkcji molekularnych pozachromosomalnego DNA w komórkach nowotworowych.
- Poprawa jakości danych oraz pogłębienie wiedzy na temat progresji nowotworu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i obróbka wstępna preparatów FFPE.
- Ekstrakcja i trawienie białek przy użyciu proteinazy K.
- Techniki hybrydyzacji FISH i obrazowania.
- Analiza danych z wykorzystaniem maksymalnej projekcji 3D oraz algorytmów dekonwolucji.
Główne wyniki
- W próbkach potrójnie ujemnego raka piersi zaobserwowano wyraźne wzory sygnałów FISH.
- Próbki HER2-dodatnie wykazały liczne sygnały FISH wskazujące na amplifikację genu.
- W niektórych jądrach zidentyfikowano skupiska dodatkowych chromosomowych centrów DNA.
- Zoptymalizowane metody poprawiły jakość danych FISH w tkankach FFPE.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa możliwości badania amplifikacji onkogenów w nowotworach.
- Udoskonalone techniki mogą prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów nowotworowych.
- Przyszłe badania mogą skupić się na eliminacji pozachromosomalnego DNA w celu leczenia nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach FFPE przy użyciu metody FISH odpowiada na krytyczną potrzebę rzetelnej oceny onkogenów w zarchiwizowanych materiałach klinicznych. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych i wspiera decyzje uwzględniające ryzyko w kluczowych punktach zwrotnych badań odkrywczych i translacyjnych. Standaryzowane procedury FISH w tkankach FFPE umożliwiają spójną ocenę amplifikacji genów, co bezpośrednio wpływa na priorytetyzację portfolio onkologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację zdarzeń amplifikacji genów w tkankach o znaczeniu klinicznym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez potwierdzenie statusu amplifikacji onkogenu w próbkach nowotworowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie amplifikacji napędzanej przez ecDNA od zdarzeń chromosomalnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie późniejszego testowania hipotez terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia ustandaryzowany test cytogenetyczny do ilościowego oznaczania amplifikacji genów w próbkach FFPE.
- Gwarantuje powtarzalność i porównywalność wyników w różnych archiwach tkanek.
- Dostarcza ilościowe wyniki obrazowania odpowiednie do benchmarkingu testów i walidacji platformy.
- Umożliwia wiarygodny screening potencjalnych biomarkerów w procesach badawczych w onkologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność wykrywania amplifikacji genów z modelami tkanek istotnymi dla choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Wspiera stratyfikację pacjentów opartą na biomarkerach w badaniach przedklinicznych.
- Ułatwia rozwój projektów onkologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka w oparciu o zweryfikowany status amplifikacji.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy oporności na terapię związanej z ecDNA w progresji nowotworu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół FISH wpisuje się w kontinuum od odkrycia do zastosowań translacyjnych, umożliwiając rzetelną ocenę amplifikacji genów w próbkach FFPE, co łączy wczesne etapy odkryć, opracowywanie testów oraz przepływy pracy w badaniach translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez potwierdzenie amplifikacji onkogenów w archiwalnych tkankach.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki FISH w celu standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz ilościową analizę sygnału do badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość walidacji biomarkerów od etapu odkrywania po modele przedkliniczne z wykorzystaniem próbek o znaczeniu klinicznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny, zestandaryzowany przepływ pracy dla detekcji amplifikacji genów w programach onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów amplifikacji genów w tkankach FFPE.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej oceny biomarkerów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów onkologicznych w oparciu o zwalidowane dane dotyczące amplifikacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytogenetyki i obrazowania fluorescencyjnego w celu optymalnego pozyskania danych.
- Wymagany jest dostęp do wysokiej jakości platform obrazowania oraz oprogramowania analitycznego do kwantyfikacji sygnału.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i obrazowania między zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych typów tkanek lub docelowych onkogenów w zależności od charakterystyki próbki.
- Potencjalne ograniczenia obejmują autofluorescencję oraz artefakty sieciowania charakterystyczne dla próbek FFPE.
