Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Amplifikacja onkogenu jest kluczowym czynnikiem powodującym raka. Charakterystyka cytogenetyczna na próbkach FFPE jest opłacalnym sposobem badania amplifikacji onkogenu. Przedstawiamy solidne i kompleksowe instrukcje dotyczące badania ogniskowej amplifikacji genów i próbek FFPE.

Badając wzorzec sygnału FISH, staje się jednoznacznie jasne, czy i w jaki sposób locus genu jest amplifikowany. Stwierdzono, że onkogeny amplifikowane jako dodatkowe chromosomalne DNA są powszechne w raku człowieka, takim jak rak płuc, piersi i mózgu. Sekwencjonowanie całego genomu w FISH jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania dodatkowego chromosomalnego DNA.

Zastosowanie FISH do tkanek FFPE jest trudne, ponieważ artefakty sieciowania i autofluorescencja tła często pogarszają jakość danych. Nasz protokół obejmuje zoptymalizowane procedury, w tym ekstrakcję i trawienie białek, techniki ogrzewania i hartowania autofluorescencji w celu poprawy jakości danych podczas badania FISH na próbkach FFPE, co dostarczy cennych informacji na temat progresji raka u pacjentów. Będziemy badać funkcje molekularne dodatkowego chromosomalnego DNA i sposób, w jaki komórki rakowe utrzymują dodatkowe chromosomalne DNA.

Docelowo dążymy do ich wyeliminowania w celu leczenia raka. Aby rozpocząć, zaopatrz się w szkiełko zamontowane na próbce po jego starzeniu. W celu wstępnej obróbki szkiełka należy zanurzyć je seryjnie w słoikach z kopeliną zawierających odpowiednie roztwory na określony czas.

Trawić tkankę za pomocą 100 do 200 mikrolitrów buforu do trawienia proteinazy K i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Aby zatrzymać trawienie, należy natychmiast zanurzyć szkiełko szeregowo w roztworach etanolu na dwie minuty każdy. Nanieść mieszankę do hybrydyzacji FISH na szkiełko podstawowe i przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym.

Umieść szkiełka na płycie grzejnej, takiej jak system hybrydyzacji fosy szkiełkowej w temperaturze 75 stopni Celsjusza na dwie do pięciu minut. Następnie przenieś szkiełko na inną płytę grzejną ustawioną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby hybrydyzować przez noc. Następnie zanurz szkiełko w ciepłym buforze do mycia i ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe.

Umyj i zabarwij szkiełko za pomocą odpowiednich odczynników w ciemności. Szybko zanurz szkiełko w dejonizowanej wodzie na nie dłużej niż jedną sekundę i połóż je na ręczniku papierowym. Po wyschnięciu zamontuj szkiełko za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu.

Umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij je lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Używając soczewki olejowej 60X, uchwyć sygnał fluorescencyjny w wielu stosach Z. Na koniec wykonaj maksymalną projekcję 3D, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość i zastosuj dekonwolucję lub inne algorytmy czyszczenia tła.

W potrójnie ujemnych próbkach raka piersi, jądrowy FISH wykazuje przede wszystkim dwie wyraźne kropki na jądro, reprezentujące sygnały HER2 ERBB-2. W przeciwieństwie do tego, próbki HER2-dodatnie wykazują obfite sygnały FISH, co wskazuje na różne wzorce amplifikacji genów. Dodatkowo, niektóre jądra w próbkach HER2-dodatnich mogą wykazywać klastry, co sugeruje dodatkowe chromosomalne węzły DNA, które są punktami centralnymi dla zwiększonej amplifikacji genów.