Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Badania oceniają stężenie glukozy w próbkach mikrobiologicznych przy użyciu technik kwantyfikacji z filtrów bakteryjnych i drożdżowych. Celem jest poprawa dokładności pomiaru masy glukozy w badaniach mikrobiologicznych. Wyzwania obejmują dokładne określenie ilościowe niskiego stężenia glukozy w złożonych próbkach mikrobiologicznych oraz rozróżnienie między mikrobiologicznymi i środowiskowymi źródłami glukozy w kulturach mieszanych.

Badania wykazały wyraźną korelację między określonymi szczepami drobnoustrojów a ich wskaźnikami zużycia glukozy, ujawniając, w jaki sposób czynniki środowiskowe wpływają na szlaki metaboliczne. Nasz protokół usprawnia wykrywanie glukozy poprzez poprawę swoistości i czułości przy jednoczesnym skróceniu czasu przetwarzania. Stosowanie kwasu siarkowego w kontrolowany sposób minimalizuje zakłócenia.

Przyszłe badania będą koncentrować się na optymalizacji metod wykrywania glukozy pod kątem zastosowań w mikrobiologii przemysłowej oraz badaniu roli określonych genów w metabolizmie glukozy w różnych warunkach środowiskowych. Na początek zważ 1,28 grama diwodorofosforanu potasu i 0,1304 grama fosforanu dipotasowego w szklanej zlewce. Dodaj 70 mililitrów wody dejonizowanej i dostosuj pH do 5,5 za pomocą 1 molowego kwasu solnego lub wodorotlenku potasu.

Następnie przenieś roztwór do 100-mililitrowej kolby miarowej i dostosuj objętość do 100 mililitrów wodą dejonizowaną. Przygotowany roztwór przechowuj w bursztynowym pojemniku w temperaturze 4-8 stopni Celsjusza do trzech miesięcy. Następnie zważ 0,01 grama dichlorowodorku o-dianizydyny w 2-mililitrowej probówce wirówkowej.

Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj 1 mililitr wody dejonizowanej, aby rozpuścić związek i powoli mieszaj roztwór. Zawiń probówkę wirówkową w folię aluminiową, aby osłonić ją przed światłem, i przechowuj ją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodać roztwór dichlorowodorku o-dianizydyny do 10 mililitrów buforu fosforanowego pobranego do 100-mililitrowej kolby miarowej i dostosować końcową objętość do 100 mililitrów za pomocą buforu fosforanowego.

Po przeniesieniu roztworu do kolby bursztynowej przechowuj go w temperaturze 4-8 stopni Celsjusza przez 3-4 miesiące. Teraz umieść 100-mililitrową kolbę miarową z 30 mililitrami dejonizowanej wody w łaźni lodowej. Po 10 minutach powoli wlej 51 mililitrów 98% kwasu siarkowego na ścianki kolby, delikatnie nią potrząsając.

Później dostosuj końcową objętość do 100 mililitrów wodą dejonizowaną i przenieś roztwór do szklanej bursztynowej kolby do przechowywania. W celu przygotowania enzymu odważ 0,01 grama oksydazy glukozowej w sterylnej mikroprobówce o pojemności 2 mililitrów. Dodaj 1 mililitr 50-milimolowego buforu octanu sodu o pH 5 do mikroprobówki i delikatnie wymieszaj.

Następnie w nowej mikroprobówce o pojemności 2 mililitrów odważ 0,0031 grama enzymu peroksydazy i rozpuść go w 1 mililitrze buforu fosforanowego ustawionego na pH 5,5. Przykryj obie mikroprobówki zawierające enzymy folią aluminiową i przechowuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 1 gram na litr roztworu wzorcowego D-Glucose przy użyciu wody dejonizowanej.

Na początek przygotuj wzorzec glukozy i wszystkie inne wymagane roztwory do testu. Dodaj odpowiednią objętość glukozy do świeżych 2-mililitrowych probówek. Ustaw suchą kąpiel termiczną na 37 stopni Celsjusza i pozwól jej się ustabilizować.

Dodaj odpowiednie objętości buforu do każdej mikroprobówki, a następnie 3,3 mikrolitra oksydazy glukozowej i 1,2 mikrolitra peroksydazy. Inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i ustaw minutnik na 20 minut. Natychmiast po inkubacji dodaj 750 mikrolitrów 50% kwasu siarkowego do każdej mikroprobówki i umieść je w łaźni lodowej na 2 minuty do ostygnięcia.

Przenieś schłodzoną mieszaninę o pojemności 1 500 mikrolitrów do plastikowej kuwety i zmierz absorbancję przy 529 nanometrach. Następnie oczyść obszar roboczy roztworem 70% alkoholu i zapal palnik, aby zapewnić aseptykę. Otrzymać bakterie lub drożdże w płynnej pożywce hodowlanej.

Przenieś 100 mikrolitrów kultury do 1,5-mililitrowych mikroprobówek za pomocą sterylnych końcówek. Odwirować próbki w temperaturze 7,500 G przez 7 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, który zawiera glukozę w roztworze.

Wymieszać 0,5 mikrolitra supernatantu ze wszystkimi wymaganymi składnikami, aby przygotować mieszaninę reakcyjną. Inkubuj mikroprobówki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i natychmiast dodaj 750 mikrolitrów 50% kwasu siarkowego. Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia w łaźni lodowej przez 2 minuty.

Na koniec zmierz absorbancję przy 529 nanometrach. Analiza spektrofotometryczna wykazała maksymalny pik absorbancji na poziomie 529 nanometrów. Analiza zużycia glukozy przez Debaryomyces hansenii wykazała spójne wyniki między oksydazą glukozową a metodami DNS, aż do pojawienia się istotnych różnic po 6, 8 i 12 godzinach.

Zastosowanie metody oksydazy glukozowej i kwasu siarkowego ułatwiło analizę wysokich stężeń glukozy do 100 gramów na litr, z wiarygodnymi wynikami po rozcieńczeniu.