Name: Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę Bergmeyera do kwantyfikacji glukozy w próbkach mikrobiologicznych. Technika enzymatyczna zwiększa dokładność i czułość pomiarów przy niskich stężeniach glukozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za częściowe darowizny od Tecnológico Nacional de México w 2023 i 2024 Call for Proposals for Scientific Research, Technological Development (16432.23-P y 19545.24-P). Serdecznie dziękujemy Narodowej Radzie Nauk Humanistycznych, Ścisłych i Technologii (CONAHCyT) za otrzymane stypendium (nr 832315) podczas studiów doktoranckich (IHRH), a udział i współpracę z Wendolyne Monroy-Martínez serdecznie dziękujemy. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml 0,1 M buforu fosforanowego. Odważ 1,28 g wodoru fosforanu potasu (KH2PO4) oraz 0,1304 g fosforanu dipotasu (K2HPO (hematoksylina i eozyna)4) i przenieś je do szklanego zlewki. Następnie dodaj 70 ml wody dejonizowanej (H2(H₂O) i dostosować pH do wartości 5,5, używając 1 M kwasu solnego (HCl) lub wodorotlenku potasu (KOH). Przenieść roztwór do kolby miarowej i doprowadzić do końcowej objętości 100 ml. Następnie przelać roztwór do bursztynowego pojemnika i przechowywać go w temperaturze 4-8 °C przez maksymalnie 3 miesiące. 
	OSTRZEŻENIE: Przez cały czas trwania procesu przygotowania należy nosić rękawice nitrylowe, aby zapobiec kontaktowi z powierzchnią skóry i potencjalnemu zanieczyszczeniu, ponieważ dihydrochlorek o-dianizydyny jest potencjalnie rakotwórczy.</li>
	<li>Przygotuj 1% (w/v) roztwór o-dihydrochlororek dianisydyny. Odważyć 0,01 g o-dianizydyny dihydrochlorowodorek i umieść go w probówce do wirowania o pojemności 2,0 ml. Za pomocą mikropipety o pojemności 1000 µl dodaj 1,0 ml H2Aby rozpuścić związek, należy powoli wymieszać go, pipetując w górę i w dół. Należy chronić roztwór przed światłem, owijając pojemnik folią aluminiową, a następnie przechowywać go w temperaturze -20 °C w celu zachowania stabilności. 
	UWAGA: Aby ułatwić podparcie probówki podczas pomiaru na wadze analitycznej, można wykorzystać zlewkę o pojemności 10 ml jako dodatkowe podparcie. Pomaga to ustabilizować probówkę, zapewniając dokładność pomiaru poprzez zminimalizowanie ryzyka przesunięcia lub przechylenia, co mogłoby zmienić wyniki uzyskane na wadze.</li>
	<li>Do kolby miarowej o pojemności 100 mL wlać 10 mL roztworu buforu fosforanowego, a następnie 1 mL 1% (v/v) o- roztwór dwuchlorku dianisydyny. Następnie należy uzupełnić objętość końcową do 100 ml buforem fosforanowym, aby uzyskać stężenie końcowe 0,01% o-mieszanina buforu z dianisydyną. Przenieś roztwór do bursztynowej kolby i owiń go folią aluminiową, aby chronić go przed światłem. Przechowuj roztwór w temperaturze 4-8 °C przez okres do 3–4 miesięcy. 
	UWAGA: Chłodzenie jest niezbędne, aby zapobiec rozkładowi, który mógłby naruszyć rzetelność pomiarów eksperymentalnych. Aby uniknąć degradacji o-mieszaninę buforu z dianisydyną w niewielkiej porcji 13 ml (wystarczającej dla 12 próbek) można umieścić w plastikowej probówce o pojemności 14 ml i przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotuj 50% H2SO4 roztwór. Umieścić kolbę miarową o pojemności 100 mL zawierającą 30 mL H2umieścić w kąpieli lodowej i schładzać przez 10 min. Następnie powoli wlać 51 ml H2SO4 (98% v/v) po ściankach kolby, delikatnie wstrząsając w celu homogenizacji roztworu. Należy odczekać, aż mieszanina ostygnie, ponieważ reakcja jest egzotermiczna (wydziela ciepło). Doprowadzić końcową objętość do 100 ml za pomocą H2Przenieść roztwór do bursztynowej kolby szklanej. 
	UWAGA: Należy pracować pod wyciągiem i przestrzegać wszystkich protokołów bezpieczeństwa, pamiętając o stosowaniu odpowiedniego sprzętu ochronnego. Przygotować 50 ml 40% roztworu węglanu wapnia w celu neutralizacji ewentualnych rozlewów.</li>
	<li>Przygotuj 50 mM roztwór octanu sodu, rozpuszczając 0,04 g octanu sodu w 5 ml H2O2Wodę dejonizowaną (ddH2O) w zlewce. Dostosować pH do wartości 5,1, używając lodowatego kwasu octowego. Na koniec uzupełnić objętość do 10 ml wodą H2O.2Odi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie enzymów
<ol>
	<li>W sterylnej mikroprobówce o pojemności 2,0 mL odważyć 0,01 g oksydazy glukozowej i zmieszać z 1 mL 50 mM octanu sodu, pH 5,0, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mg/mL. Przykryć probówkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać do 2 miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Obliczyć objętość roztworu enzymu V2 niezbędną do uzyskania pożądanej aktywności enzymu w każdej plastikowej kuwecie (o całkowitej objętości 1,5 mL), korzystając z równania (1): V1C1 = V2C2, gdzie V1 wynosi 1 500 µL, C1 to 28,5 U aktywności enzymu, a C2 (stężenie roztworu enzymu) wynosi 12 970 U/mL (10 mg enzymu [129 000 jednostek/g] w 1 mL H2Odi). 
	V2 = (1 500 µL × 28,5 U)/12 970 U = 3,29 µL    (1) 
	UWAGA: Dla dokładniejszego pipetowania wartość tę można zaokrąglić do 3,3 µL.</li>
	<li>W nowej mikroprobówce o pojemności 2 mL odważyć 0,0031 g peroksydazy i dodać 1 mL buforu fosforanowego, pH 5,5, aby uzyskać stężenie końcowe 3,1 mg/mL. Przykryć mikroprobówkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Obliczyć objętość roztworu peroksydazy wymaganą do uzyskania pożądanej aktywności enzymu na kuwetę, korzystając z równania (1). Przyjąć całkowitą objętość kuwety 1 500 µL i docelową aktywność enzymu 1,25 U. Następnie wyznaczyć niezbędną objętość roztworu enzymu, przyjmując jego stężenie wynoszące 1 551 U. 
	V2 = (1 500 µL × 1,25 U)/1 551 U = 1,208 µL 
	UWAGA: Dla dokładniejszego pipetowania wartość tę zaokrąglono do 1,20 μL.</li>
</ol>
3. Standard glukozy
<ol>
	<li>Przygotować roztwór wzorcowy D-glukozy o stężeniu 1 g/L, dodając 0,01 g D-glukozy do 10 mL H2Odi w kolbie miarowej. Aby rozcieńczyć roztwór do stężenia 0,5 g/L, należy pobrać 500 µL roztworu zapasu i zmieszać z 500 µL H2Odi, aby uzyskać objętość końcową 1 mL. 
	UWAGA: Proces rozcieńczania jest niezbędny do przygotowania dokładnych roztworów wzorcowych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie krzywej standardowej
<ol>
	<li>Do nowej mikroprobówki o pojemności 2 mL dodać objętości buforu i glukozy wskazaną w Tabeli 1.</li>
	<li>Ustawić suchą kąpiel termostatyczną na 37 °C. Po ustabilizowaniu temperatury dodać 3,3 µL oksydazy glukozowej do wszystkich probówek, a następnie dodać 1,2 µL peroksydazy do każdej probówki. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
	<li>Po inkubacji niezwłocznie dodać 750 µL 50% H2SO4 (v/v) do każdej mikroprobówki i schłodzić mieszaninę w kąpieli lodowej przez 2 min. Otrzymana końcowa objętość wyniesie 1,500 µL. Następnie przenieść roztwór do plastikowej kuwety i zmierzyć absorbancję przy 529 nm.</li>
</ol>
Tabela 1: Krzywa kalibracyjna glukozy dla metody GOX-H2SO4. Skróty: GOD = oksydaza glukozowa; POD = peroksydaza; H2SO4 = kwas siarkowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
5. Badanie próbek mikrobiologicznych
<ol>
	<li>Próbkę należy uzyskać poprzez hodowlę bakterii lub drożdży w płynnej pożywce w określonych warunkach, w tym przy zachowaniu odpowiedniej temperatury, prędkości mieszania oraz czasu inkubacji. Po osiągnięciu przez kulturę pożądanej gęstości optycznej (OD) lub stężenia komórek, należy zebrać kulturę do dalszej obróbki. 
	UWAGA: Pseudomonas reptilivora hodowano przy stałej prędkości mieszania 300 obr./min i 28 °C, podczas gdy Debaryomyces hansenii hodowano przy prędkości mieszania 200 obr./min w 30 °C w inkubatorze wytrząsającym. W przypadku konkretnego D. hansenii, Jadalny olej rzapkowy był również stosowany jako induktor produkcji lipazy.</li>
	<li>Oczyścić obszar roboczy 70% roztworem alkoholu lub odpowiednim środkiem czyszczącym zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Zapalić palnik w celu zapewnienia aseptyki.</li>
	<li>Transfer 100 µL pożywki hodowlanej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml lub 2 ml za pomocą sterylnych końcówek.</li>
	<li>Wiruj próbki przy 7 500 × g przez 7 min w temperaturze 4 °Club przy 10 000 × g przez 7 min bez kontroli temperatury. Po wirowaniu ostrożnie usunąć supernatant zawierający rozpuszczoną glukozę, a osad odrzucić.</li>
	<li>Zastosowanie 0.5 µL nadpływu dla stężeń glukozy w zakresie od 1 do 20 g/L, a następnie zmieszać z 749.5 µL z Oto jest treść, którą należy przetłumaczyć. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego.bufor dianisydynowy, 3.3 µL Boga, a następnie 1.2 µL POD. Inkubować mikroprobówki przez 20 min w 37 °Czgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 4.2, a następnie natychmiast dodać 750 µL z 50% H2SO4 i schłodzić w łaźni lodowej przez 2 min.
	<ol>
		<li>W przypadku stężeń powyżej 20 g/L należy przeprowadzić rozcieńczenie 1:1 za pomocą sterylnej wody H2O2Odi przed przystąpieniem do dalszych działań.</li>
		<li>Jeśli próbki supernatantu były wcześniej mrożone w temperaturze -80 °C lub -20 °C, rozmrozić je w temperaturze pokojowej i mieszać w wstrząsarce wortex przez 30 s przed użyciem. W przypadku konieczności rozcieńczenia należy użyć sterylnej H2Odi.</li>
		<li>W przypadku próbek o stężeniu glukozy powyżej 30 g/L należy wykonać rozcieńczenie 1:1 za pomocą sterylnej wody H2O2Odi, co daje czynnik rozcieńczenia wynoszący 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz całkowite stężenie glukozy w każdej próbce, korzystając z równania (2) w programie arkusza kalkulacyjnego. 
	<img alt="Równanie regresji liniowej, wzór obliczeniowy x w statystycznej analizie danych." src="/files/ftp_upload/67126/67126eq11.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 11">     ​(2) 
	Gdzie: 
	Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. = stężenie glukozy (g/L)     δ = Końcowa objętość reakcji (0,0015 L) 
	y = absorbancja       SM = ilość użytej próbki* 
	UWAGA: The b i m wartości pochodzą z równania modelującego linię trendu krzywej kalibracyjnej dla danej metody (y = mx + b). *Wartość M.S. musi opierać się na ilości próbki użytej do uzyskania stosunku przy odpowiadającym jej rozcieńczeniu (t.j. jeśli pobierze się 0.5 µL nadfiltratu, M.S. = 0,0000005 L = 0,5 × 10-6 L); w przypadku zastosowania czynnika rozcieńczenia (DF), należy pomnożyć otrzymaną absorbancję przez DF. 
	Na przykład, jeśli uzyskano absorbancję wynoszącą 0,5 i zastosowano DF równy 2, wynik wyniesie 1,0. Zatem y = 1,0 i wartość tę należy wprowadzić do równ. (2), zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
</ol>
6. Walidacja analityczna
<ol>
	<li>Oblicz parametry walidacji analitycznej metody GOX-H2SO4 zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Narodowe Centrum Metrologii oraz Meksykańską Jednostkę Akredytacyjną10 (CENAM-ema).
	<ol>
		<li>Oblicz precyzję jako procentowy współczynnik zmienności lub %CV = (S/x) × 100, gdzie x to średnia grupy próbek, a S to odchylenie standardowe, przy wartości akceptowalnej ≤10%.</li>
		<li>Określ liniowość poprzez dopasowanie krzywej wzorcowej do modelu liniowego z R2 powyżej 0,995.</li>
		<li>Oblicz granicę oznaczalności (LOQ) korzystając z równania: LOQ = yB + 10sB, gdzie yB reprezentuje stężenie analityczne generujące sygnał równoważny sygnałowi docelowemu, a 10sB oznacza 10-krotność odchylenia standardowego próbki ślepej.</li>
		<li>Oblicz błąd systematyczny korzystając z równania: Slant = x - m, gdzie x = średnie stężenie eksperymentalne, a m to stężenie teoretyczne.</li>
		<li>Określ dokładność jako stopień zgodności między wartością rzeczywistą a wartością teoretyczną. 
		Odzysk% = (CR/CV) × 100 
		Gdzie CR to średnie stężenie eksperymentalne, a CV to współczynnik zmienności stężenia teoretycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Interferencje ze strony innych cukrów redukujących
<ol>
	<li>Osobno poddaj ocenie cztery cukry redukujące: glukozę, fruktozę, galaktozę i ksylozę z roztworu zapasu o stężeniu 0,5 g/L. Dodatkowo zastosuj trehalozę jako kontrolę negatywną. Postępuj zgodnie z protokołem dla wszystkich próbek i zmierz absorbancję przy 545 i 529 nm.</li>
</ol>

Enzymatic Bergmeyer Glucose Quantification for Microbial and Yeast Analysis

<ol><li>Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuang%2C+WC+%22New+Technologies+and+Applications%22">New Technologies and Applications</a>. , Elsevier. 185-223 (2007).</li>
<li>Hernandez-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+reducing+sugars+based+on+the+qualitative+technique+of+Benedict%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Quantification of reducing sugars based on the qualitative technique of Benedict.</a> ACS Omega. 5 (50), 32403-32410 (2020).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., Sastri, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+the+3%2C5-dinitrosalicylic+acid+%28DNS%29+assay+for+the+reducing+sugars%3A+interference+of+furfural+and+5-hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural.</a> Int J Biol Macromol. 156, 180-185 (2020).</li>
<li>De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+fractionation+and+pectin+content+during+the+ripening+of+guava+cv.+Pedro+Sato%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato.</a> Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. -A., Hamilton, J. K., Roberts, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of sugars.</a> Nature. 168 (4265), 167(1951).</li>
<li>Gonzalez, N. M., Fitch, A., Al-Bazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+RP-HPLC+method+for+determination+of+glucose+in+Shewanella+oneidensis+cultures+utilizing+1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a RP-HPLC method for determination of glucose in Shewanella oneidensis cultures utilizing 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatization.</a> PLoS ONE. 15 (3), e0229990(2020).</li>
<li>Galant, A. L., Kaufman, R. C., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%3A+Detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose: Detection and analysis.</a> Food Chem. 188, 149-160 (2015).</li>
<li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis%22">Methods of enzymatic analysis</a>. 2, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gu%C3%ADa+t%C3%A9cnica+sobre+trazabilidad+e+incertidumbre+en+las+mediciones+anal%C3%ADticas+que+emplea+la+t%C3%A9cnica+de+espectrofotometr%C3%ADa+de+ultravioleta-visible%22">Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible</a>. , CENAM-EMA. (2008).</li>
<li>Yuen, V. G., McNeill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+glucose+oxidase+method+for+glucose+determination+by+manual+assay+and+automated+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).</li>
<li>Hansen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+glucose+oxidase+reaction+and+interference+with+quantitative+glucose+oxidase-peroxidase-O-dianisidine+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Investig%22%5BJournal%5D)">Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method.</a> Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).</li>
<li>Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Basic+concepts+in+clinical+biochemistry%3A+A+practical+guide%22">Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide</a>. , Springer eBooks. 57-60 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Kwantyfikacja glukozy w pożywkach hodowlanych jest niezbędna do zrozumienia wzrostu drobnoustrojów i aktywności metabolicznej, ponieważ glukoza służy jako podstawowe źródło energii dla wielu mikroorganizmów. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę GOX-H2SO4 do dokładnego pomiaru poziomu glukozy w pożywkach hodowlanych, mając na celu optymalizację procesów mikrobiologicznych w fermentacji bakteryjnej lub drożdżowej. Nasze ustalenia są zgodne z ustaleniami Yuena i McNeilla11; Jedna...

Glukoza służy jako główne źródło energii i węgla dla wielu mikroorganizmów, w tym bakterii, drożdży i grzybów. Mikroorganizmy te pobierają glukozę za pomocą transporterów zlokalizowanych w błonie zewnętrznej, gdzie w ramach szlaku metabolicznego glikolizy przechodzi ona serię reakcji biochemicznych, w wyniku których zostaje przekształcona w pirogronian1. Istnieje wiele technik ilościowego oznaczania cukrów redukujących, takich jak glukoza. Można zastosować na przykład odczyn Benedicta2, kwas 3,5-dinitrosalicylowy (DNS)3,4, metodę antronu5 lub metodę fenolo-siarkową6. Metody te wykrywają jednak każdy cukier redukujący obecny w próbce, np. fruktozę i maltozę, co może wpływać na sygnał i utrudniać dokładne oznaczenie konkretnego cukru.
Ponadto wymagają one ścisłej kontroli temperatury oraz obchodzenia się z substancjami niebezpiecznymi, co może skomplikować proces i wpłynąć na dokładność. Metody te mogą być również podatne na interferencje ze strony innych związków obecnych w próbce, co utrudnia precyzyjne oznaczanie ilości glukozy. Z kolei wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) stanowi bardziej precyzyjną alternatywę, umożliwiając rozróżnienie glukozy od innych cukrów redukujących, choć wiąże się to z wyższymi kosztami operacyjnymi. Te przeciwstawne metody podkreślają stałą potrzebę opracowania dokładnych i kosztowo efektywnych technik ilościowego oznaczania glukozy7.
Metoda z wykorzystaniem oksydazy glukozowej, peroksydazy i kwasu siarkowego (GOX-H2SO4) wykorzystuje dwa enzymy: oksydazę glukozową (GOD) oraz peroksydazę (POD). GOD jest enzymem oksydoreduktazą wykazującym wysoką selektywność w utlenianiu β-D-glukozy8. Kompleks ten działa jako katalizator w reakcji zachodzącej w obecności tlenu i glukozy, prowadzącej do powstania kwasu glukonowego oraz nadtlenku wodoru (H2O2). H2O2 jest wykrywany za pomocą chromogennego akceptora tlenu, o-dianizydyny, która po oddziaływaniu z POD ulega utlenieniu i powoduje uwalnianie H2O2, co zapobiega ponownemu przekształceniu kwasu glukonowego w glukozę (patrz Rysunek 1). Otrzymany kolor jest stabilizowany poprzez dodanie kwasu siarkowego (H2SO4), który zatrzymuje również reakcję enzymatyczną, co pozwala uniknąć możliwych zakłóceń, które mogłyby wystąpić w przypadku kontynuacji reakcji9.
<img alt="Schemat reakcji enzymatycznej, utlenianie glukozy, analiza spektrofotometryczna przy 529 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67126/67126fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd metody oznaczania ilości glukozy z wykorzystaniem enzymu oksydazy glukozowej), który reaguje z glukozą, tworząc nadtlenek wodoru (H2O2) i kwas glukonowy. Następnie enzym peroksydaza reaguje z H2O2 w obecności dwuwodorku O-dianizydyny. W ostatnim kroku dodaje się kwas siarkowy (H2SO4), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, co skutkuje powstaniem różowego zabarwienia mierzonego przy 529 nm. Skróty: POD = peroksydaza; GOD = oksydaza glukozowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Enzymatyczna metoda GOX-H2SO4 jest techniką powszechnie stosowaną do pomiaru stężenia glukozy w próbkach biologicznych, z których większość ma znaczenie kliniczne. Jednakże niewiele badań dotyczyło techniki pozwalającej na oznaczanie ilości glukozy w pożywce wzrostowej w celu oceny jej zużycia. W związku z tym w niniejszym protokole przedstawiono metodologię ilościowego oznaczania glukozy za pomocą reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem oksydazy glukozowej, peroksydazy, o-dianizydyny dihydrochlorku oraz H2SO4 w mikrobiologicznych próbkach w płynie, która stanowi modyfikację metody opracowanej przez Bergmeyera9, poprzez zastosowanie 50% (v/v) H2SO4 oraz mniejszych ilości odczynników.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml mikroprobówka</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-2,0 ml mikroprobówka</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-CaCO3</td><td>Meyer</td><td>471-34-1</td><td>Węglan wapnia</td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Meyer</td><td>50-99-7</td><td>D-Glukoza&nbsp;</td></tr><tr><td>Sucha kąpiel</td><td>FisherScientific</td><td>11-718-4</td><td>Numer seryjny 911NO251. Blok SxDxH mm/in: 124 x 76 x 39 / 4,9 x 3,0 x 1,5</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6125-50KU</td><td>Proszek enzymatyczny</td></tr><tr><td>H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Woda dejonizowana</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Meyer</td><td>7664-93-9</td><td>Kwas siarkowy</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Meyer</td><td>7647-01-0</td><td>Kwas chlorowodorowy&nbsp;</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Meyer</td><td>7758-11-4</td><td>Fosforan dipotasowy</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Meyer</td><td>7778-77-0</td><td>Fosforan monopotasowy</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Meyer</td><td>1310-58-3</td><td>Wodorotlenek potasu</td></tr><tr><td>Lambda 35</td><td>PerkinElmer-Spektrofotometr</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikrorurka wirówka</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>o-dichlorowodorek dianizydyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3252</td><td>Peroksydaza chromogenna</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8125-50KU</td><td>Enzymatyczny</td></tr><tr><td>pH-metr</td> w proszku <td>Hanna&nbsp;</td><td>1131</td><td>Hanna 1170</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Meyer</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Meyer Szpatułki do ważenia&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja glukozy bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Bergmeyer Glucose Quantification for Microbiological Samples

Stężenie glukozy jest kluczowym wskaźnikiem metabolizmu komórkowego i może wskazywać na całkowite tempo metabolizmu, aberrację w metabolizmie glukozy, a w niektórych przypadkach na to, jak komórki łączą metabolizm glukozy z metabolizmem energetycznym. Ponadto wewnątrzkomórkowy i zewnątrzkomórkowy poziom glukozy wskazuje na stan metaboliczny komórek. Techniki enzymatyczne, takie jak oznaczanie ilościowe glukozy metodą Bergmeyera, są dokładniejsze i bardziej czułe niż inne techniki, takie jak kwas dinitrosalicylowy lub metody fluorescencyjne, które są zwykle stosowane w mikrobiologii. Chociaż jest stosowana głównie w obszarze klinicznym, oznaczanie ilościowe glukozy Bergmeyera może być również stosowane do dowolnej komórki, ale nie zostało szczegółowo opisane w przypadku bakterii, grzybów, drożdży lub innych mikroorganizmów. 
Tutaj przedstawiamy metodologię ilościowego oznaczania glukozy z próbek bakterii i drożdży za pomocą enzymatycznej metody kwantyfikacji glukozy Bergmeyera. Procedura obejmowała enzymy oksydazę glukozową, peroksydazę i dichlorowodorek o-dianizydyny inkubowane w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie dodawane były kwas siarkowy. Następnie mierzy się absorbancję przy długości fali 545 nm. Należy podkreślić, że chociaż technika ta stwarza trudności w pomiarze wysokich stężeń glukozy (powyżej 60 g/l), możliwe jest zmierzenie stężeń poniżej 50 g/l przy użyciu współczynników rozcieńczenia. To enzymatyczne podejście jest cenne dla badań i analiz w mikrobiologii i innych dziedzinach naukowych. Precyzja i czułość metody sprawiają, że jest ona pomocna w wykrywaniu nawet niskich stężeń glukozy w próbkach mikrobiologicznych.

Analiza spektrofotometryczna GOX-H2SO4 wykazała pojedyncze maksimum absorbancji przy 529 nm (λmax) (Rysunek 2A), przy czym dodatkowe wartości absorbancji zaobserwowano przy 545 nm. Analizując wartości absorbancji dla różnych stężeń glukozy, uzyskano liniowość (R²) wynoszącą 0,9977 dla λ529 nm oraz R² wynoszącą 0,9967 dla λ545 nm (Rysunek 2B). Liniowość w określonym zakresie odnosi się do zdolności do uzyskiwania wyników bezpośrednio pro...

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera to spektrofotometryczna technika enzymatyczna używana głównie do testów klinicznych, które dokładnie i czule mierzą ilość glukozy. W niniejszym artykule przedstawiono protokół stosowania tej metody do próbek mikrobiologicznych.

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

The glucose concentration is a key indicator of cellular metabolism and could indicate the total metabolism rate, an aberration in glucose metabolism, ...

Badania oceniają stężenie glukozy w próbkach mikrobiologicznych przy użyciu technik kwantyfikacji z filtrów bakteryjnych i drożdżowych. Celem jest poprawa dokładności pomiaru masy glukozy w badaniach mikrobiologicznych. Wyzwania obejmują dokładne określenie ilościowe niskiego stężenia glukozy w złożonych próbkach mikrobiologicznych oraz rozróżnienie między mikrobiologicznymi i środowiskowymi źródłami glukozy w kulturach mieszanych.Badania wykazały wyraźną korelację między określonymi szczepami drobnoustrojów a ich wskaźnikami zużycia glukozy, ujawniając, w jaki sposób czynniki środowiskowe wpływają na szlaki metaboliczne. Nasz protokół usprawnia wykrywanie glukozy poprzez poprawę swoistości i czułości przy jednoczesnym skróceniu czasu przetwarzania. Stosowanie kwasu siarkowego w kontrolowany sposób minimalizuje zakłócenia.Przyszłe badania będą koncentrować się na optymalizacji metod wykrywania glukozy pod kątem zastosowań w mikrobiologii przemysłowej oraz badaniu roli określonych genów w metabolizmie glukozy w różnych warunkach środowiskowych. Na początek zważ 1,28 grama diwodorofosforanu potasu i 0,1304 grama fosforanu dipotasowego w szklanej zlewce. Dodaj 70 mililitrów wody dejonizowanej i dostosuj pH do 5,5 za pomocą 1 molowego kwasu solnego lub wodorotlenku potasu.Następnie przenieś roztwór do 100-mililitrowej kolby miarowej i dostosuj objętość do 100 mililitrów wodą dejonizowaną. Przygotowany roztwór przechowuj w bursztynowym pojemniku w temperaturze 4-8 stopni Celsjusza do trzech miesięcy. Następnie zważ 0,01 grama dichlorowodorku o-dianizydyny w 2-mililitrowej probówce wirówkowej.Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów dodaj 1 mililitr wody dejonizowanej, aby rozpuścić związek i powoli mieszaj roztwór. Zawiń probówkę wirówkową w folię aluminiową, aby osłonić ją przed światłem, i przechowuj ją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodać roztwór dichlorowodorku o-dianizydyny do 10 mililitrów buforu fosforanowego pobranego do 100-mililitrowej kolby miarowej i dostosować końcową objętość do 100 mililitrów za pomocą buforu fosforanowego.Po przeniesieniu roztworu do kolby bursztynowej przechowuj go w temperaturze 4-8 stopni Celsjusza przez 3-4 miesiące. Teraz umieść 100-mililitrową kolbę miarową z 30 mililitrami dejonizowanej wody w łaźni lodowej. Po 10 minutach powoli wlej 51 mililitrów 98% kwasu siarkowego na ścianki kolby, delikatnie nią potrząsając.Później dostosuj końcową objętość do 100 mililitrów wodą dejonizowaną i przenieś roztwór do szklanej bursztynowej kolby do przechowywania. W celu przygotowania enzymu odważ 0,01 grama oksydazy glukozowej w sterylnej mikroprobówce o pojemności 2 mililitrów. Dodaj 1 mililitr 50-milimolowego buforu octanu sodu o pH 5 do mikroprobówki i delikatnie wymieszaj.Następnie w nowej mikroprobówce o pojemności 2 mililitrów odważ 0,0031 grama enzymu peroksydazy i rozpuść go w 1 mililitrze buforu fosforanowego ustawionego na pH 5,5. Przykryj obie mikroprobówki zawierające enzymy folią aluminiową i przechowuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 1 gram na litr roztworu wzorcowego D-Glucose przy użyciu wody dejonizowanej.Na początek przygotuj wzorzec glukozy i wszystkie inne wymagane roztwory do testu. Dodaj odpowiednią objętość glukozy do świeżych 2-mililitrowych probówek. Ustaw suchą kąpiel termiczną na 37 stopni Celsjusza i pozwól jej się ustabilizować.Dodaj odpowiednie objętości buforu do każdej mikroprobówki, a następnie 3,3 mikrolitra oksydazy glukozowej i 1,2 mikrolitra peroksydazy. Inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i ustaw minutnik na 20 minut. Natychmiast po inkubacji dodaj 750 mikrolitrów 50% kwasu siarkowego do każdej mikroprobówki i umieść je w łaźni lodowej na 2 minuty do ostygnięcia.Przenieś schłodzoną mieszaninę o pojemności 1 500 mikrolitrów do plastikowej kuwety i zmierz absorbancję przy 529 nanometrach. Następnie oczyść obszar roboczy roztworem 70% alkoholu i zapal palnik, aby zapewnić aseptykę. Otrzymać bakterie lub drożdże w płynnej pożywce hodowlanej.Przenieś 100 mikrolitrów kultury do 1,5-mililitrowych mikroprobówek za pomocą sterylnych końcówek. Odwirować próbki w temperaturze 7,500 G przez 7 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, który zawiera glukozę w roztworze.Wymieszać 0,5 mikrolitra supernatantu ze wszystkimi wymaganymi składnikami, aby przygotować mieszaninę reakcyjną. Inkubuj mikroprobówki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i natychmiast dodaj 750 mikrolitrów 50% kwasu siarkowego. Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia w łaźni lodowej przez 2 minuty.Na koniec zmierz absorbancję przy 529 nanometrach. Analiza spektrofotometryczna wykazała maksymalny pik absorbancji na poziomie 529 nanometrów. Analiza zużycia glukozy przez Debaryomyces hansenii wykazała spójne wyniki między oksydazą glukozową a metodami DNS, aż do pojawienia się istotnych różnic po 6, 8 i 12 godzinach.Zastosowanie metody oksydazy glukozowej i kwasu siarkowego ułatwiło analizę wysokich stężeń glukozy do 100 gramów na litr, z wiarygodnymi wynikami po rozcieńczeniu.

bergmeyer-glucose-quantification-for-microbiological-samples

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metodę precyzyjnego generowania i kompleksowej charakterystyki morfologicznej grzyba nitkowatego Aspergillus niger, która pozwala na matematyczną korelację wyglądu morfologicznego z produktywnością.

Dostosowanie morfologii Aspergillus niger poprzez dodanie mikrocząsteczek talku

Ten film demonstruje test in vitro do pośredniego pomiaru wewnątrzkomórkowego wychwytu glukozy. Test wykorzystuje znakowany fluorescencyjnie analog glukozy w celu ustalenia korelacji między zewnątrzkomórkowym zubożeniem glukozy a wewnątrzkomórkowym wychwytem glukozy.

Test zubożenia glukozy in vitro: oparta na fluorescencji metoda ilościowego określania wychwytu glukozy w komórkach za pomocą zewnątrzkomórkowego pomiaru wyczerpania glukozy

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru mleczanu w lizatach komórkowych przy użyciu enzymu dehydrogenazy mleczanowej. Enzym ten przekształca mleczan w pirogronian, wraz z konwersją NAD do NADH, który reaguje z barwnikami tetrazolowymi i daje kolorowy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie w celu ilościowego określenia mleczanu.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

Ten film demonstruje procedurę zbierania moczu myszy i oceny jej poziomu glukozy. Aby ocenić poziom glukozy, zanurz pasek testowy pokryty enzymami i barwnikiem chromogennym w próbce, inicjując zmianę koloru, która wskazuje poziom glukozy. W celu ilościowego określenia poziomu glukozy w moczu należy wprowadzić próbkę moczu do płytki wielodołkowej z rosnącymi stężeniami glukozy, dodać mieszaninę reakcyjną i inkubować. Zmierz absorbancję, aby utworzyć krzywą wzorcową i oblicz poziomy glukozy na...

Testy do jakościowej i ilościowej oceny stężeń glukozy w moczu myszy

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Poznaj metodę Bergmeyera do kwantyfikacji glukozy w próbkach mikrobiologicznych. Technika enzymatyczna zwiększa dokładność i czułość pomiarów przy niskich stężeniach glukozy.

Kwantyfikacja glukozy Bergmeyera dla próbek mikrobiologicznych

Przeglądaj więcej filmów