Kwantyfikacja modulacji aktywności enzymu elastazy za pomocą analizy kolorymetrycznej

Zakres naszych badań skupia się na rozwoju naturalnych związków reaktywnych. Dlatego za pomocą metody in vitro staramy się ocenić aktywność elastazy, enzymu biorącego udział w degradacji elastyny i utracie elastyczności, w celu przywrócenia homeostazy tkanki. Kwantyfikacja naturalnych ekstraktów roślinnych wiąże się z kilkoma wyzwaniami, głównie związanymi z ich złożonym składem chemicznym i często silnym zabarwieniem, które może zakłócać powszechne pomiary.

Opracowanie niezawodnych protokołów adaptacyjnych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju tej dziedziny badań. Nasze badanie oferuje kilka korzyści dla tych dziedzin, w tym prostotę, wrażliwość, szybki wynik napięcia i zdolność adaptacji do różnych potrzeb badawczych. Na początek należy zważyć odpowiednią ilość zasady Tris za pomocą wagi analitycznej i przenieść zważoną zasadę Tris do zlewki.

Za pomocą cylindra z podziałką dodaj wodę dejonizowaną do zlewki. Mieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego, aż do całkowitego rozpuszczenia zasady Tris. Następnie dostosuj pH roztworu do ośmiu, używając czterech normalnych kwasów solnych.

Po osiągnięciu pożądanego pH przenieść roztwór do kolby miarowej. Używając wody dejonizowanej, napełnij kolbę do oznaczonej objętości. Przygotowany bufor przenieść do oznakowanej butelki do przechowywania i przechowywać w temperaturze pokojowej.

W celu przygotowania próbki należy dokładnie zważyć wymaganą ilość próbki za pomocą wagi analitycznej. Rozpuścić próbkę w przygotowanym buforze reakcyjnym do osiągnięcia pożądanego stężenia. Użyj mieszalnika wirowego, aby całkowicie rozpuścić próbkę.

I przechowuj przygotowaną próbkę na lodzie. Następnie należy przygotować roztwór roboczy enzymu elastazy w buforze reakcyjnym do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr. Roztwór elastazy należy przechowywać na lodzie do momentu przygotowania go do użycia.

Teraz przygotuj 0,8 milimolowy roztwór SANA w buforze reakcyjnym. Chronić roztwór przed światłem i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Dla fluorku fenylometanosulfonylu lub materiału wyjściowego PMSF należy przygotować 100-milimolowy roztwór PMSF w izopropanolu.

Przygotowany roztwór należy przechowywać na lodzie. Przygotować wszystkie reakcje w trzech egzemplarzach za pomocą probówek do mikrowirówek. Inkubuj wszystkie probówki w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu SANA do każdej probówki, z wyjątkiem kontroli koloru. Delikatnie odwróć probówki kilka razy, aby wymieszać próbki i przenieś 300 mikrolitrów z każdej probówki na 96-dołkową płytkę, zapewniając trzykrotne pomiary dla każdej próbki. Na koniec umieść 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek ustawionym na 410 nanometrów i mierz absorbancję okresowo, co minutę przez 20 minut lub do momentu, gdy sygnał ustabilizuje się w temperaturze pokojowej.

Ekstrakt pierwszy wykazywał słabą, ale znaczącą aktywność hamującą elastazę w stężeniach jednego, 0,75 i 0,5 miligrama na mililitr, bez znaczącego wpływu przy 0,25 miligrama na mililitr. Ekstrakt drugi wykazał wysoką aktywność hamującą elastazę we wszystkich badanych stężeniach, przy poziomach hamowania podobnych do kontroli pozytywnej przy jednym, 0,75 i 0,5 miligrama na mililitr.