Przygotowanie biblioteki ATAC-Seq mysich neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego

Badania te mają na celu optymalizację protokołu budowy biblioteki ATAC-Seq do badania dostępności chromatyny neutrofilowej. Ta optymalizacja ułatwi badania nad przeprogramowaniem epigenetycznym neutrofili i ujawni ich mechanizmy odpowiedzi immunologicznej w obliczu różnych wyzwań oraz ujawni potencjalne cele terapeutyczne istotne dla wystąpienia i postępu chorób. Średni okres półtrwania neuroneutrofili wynosi 12,5 godziny, a ich indywidualny okres półtrwania jest jeszcze krótszy, ze względu na ich zwiększoną wrażliwość na bodźce mikrośrodowiskowe.

W związku z tym wyizolowanie wysoce aktywnych neutrofili i pojawienie się wysokiej jakości jąder neutrofili jest niezbędnym, ale trudnym krokiem dla pomyślnej budowy bibliotek ATAC-Seq. Odkryliśmy, że separacja immunomagnetyczna zwiększa wydajność sortowania neutrofili, zapewniając wysoką czystość i zapewniając skalowalny protokół generowania wysokiej jakości bibliotek ATAC-Seq z neutrofili gryzoni. Na początek weźmy uśpionego samca myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, ważącego od 19 do 21 gramów.

Użyj małych nożyczek i kleszczy, aby ostrożnie oddzielić kość udową od stawu biodrowego i piszczelowego. Po usunięciu przyczepionej skóry i mięśni szkieletowych przepłucz kość udową zimnym PBS na 10-centymetrowej szalce Petriego. Następnie odetnij nasady kości udowej i delikatnie włóż igłę o rozmiarze 28 przymocowaną do dwumililitrowej strzykawki do jamy szpiku.

Wypłukać szpik kostny zimnym PBS zawierającym 2% płodową surowicę bydlęcą. Następnie użyj sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów, aby przefiltrować zawiesinę komórek do probówki do sortowania komórek aktywowanej fluorescencją. Odwirować probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając na dnie około 100 mikrolitrów płynu i delikatnie postukaj w rurkę, aby poluzować granulkę. Następnie erytrocyty znajdują się w komórkach szpiku kostnego za pomocą buforu do lizy bez poliformaldehydu. Na koniec dwukrotnie umyj komórki pożywką RPMI 1640 zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej przed ponownym wymieszaniem ich w objętości dwóch mililitrów.

Na początek ponownie zawieś przygotowane komórki szpiku kostnego w dwóch mililitrach pożywki RPMI 1640 i odwiruj w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odessać większość supernatantu, pozostawiając około 100 mikrolitrów i delikatnie postukać w rurkę, aby poluzować osad. Następnie dodaj 30 mikrolitrów kulek LY-6G i delikatnie postukaj w probówkę, aby wymieszać je z komórkami szpiku kostnego.

Po ponownym zawieszeniu kulek w komórkach w dwóch mililitrach PBS, odwirować probówkę o stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Usunąć większość supernatantu i dodać dodatkowy PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra. Umieścić kolumnę MS w polu magnetycznym kompatybilnego separatora do sortowania komórek aktywowanego magnetycznie.

Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami PBS i powtórzyć czynność po całkowitym przepływie do kolumny MS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów magnetycznie znakowanej zawiesiny komórek szpiku kostnego do kolumny MS. Gdy zbiornik kolumny jest pusty, należy go natychmiast napełnić.

Jak tylko zbiornik kolumny zostanie wyczerpany, usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na pięciomililitrowej rurce. Po dozowaniu dwóch mililitrów PBS na kolumnę, mocno wciśnij tłok do kolumny, aby wydalić magnetycznie znakowane neutrofile. Odwirować 50 000 zawiesin jednokomórkowych zawierających neutrofile w stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w probówce o pojemności 0,2 mililitra.

Po wyrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić neutrofile w 50 mikrolitrach wstępnie schłodzonego buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj roztwór za pomocą pipety i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Po ponownym odwirowaniu neutrofili i odrzuceniu supernatantu, zebrać jądro.

Umieść rurkę na lodzie przed rozpoczęciem kolejnych procedur. Na początek należy przygotować mieszaninę reakcyjną znakowania zawierającą transpozazę Tn5 w probówce do PCR. Podgrzej schłodzone kulki do oczyszczania amplikonu w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut.

Ponownie zawiesić wyekstrahowane jądro neutrofili za pomocą 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej znakowania i delikatnie wymieszać pipetą. Wirować przez pięć sekund w temperaturze 2 600 G, a następnie inkubować probówkę reakcyjną w przyrządzie do PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj do lizatu 100 mikrolitrów wstępnie wirowanych kulek oczyszczających amplikon i dokładnie wymieszaj je w roztworze.

Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po odwirowaniu probówki przez pięć sekund umieść probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny, aby oczyścić przerwany fragment DNA. Ostrożnie usunąć supernatant.

Następnie umyj kulki magnetyczne 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym przez 30 sekund. Następnie wyjmij rurkę reakcyjną ze stojaka magnetycznego. Dodaj 26 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody, aby przykryć kulki magnetyczne i inkubować.

Po odwirowaniu probówki oddziel kulki magnetyczne za pomocą stojaka magnetycznego, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie przenieś 24 mikrolitry supernatantu do nowej probówki PCR. Następnie dodaj 27,5 mikrolitrów kulek oczyszczających amplikon do 50 mikrolitrów produktów PCR i dokładnie wymieszaj je w roztworze.

Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Wirować probówkę przez pięć sekund. Oczyść bibliotekę kwasu dezoksyrybonukleinowego, umieszczając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny.

Ostrożnie przenieść supernatant do nowej wysterylizowanej probówki do PCR i wyrzucić kulki magnetyczne. Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek oczyszczających amplikon do supernatantu i dokładnie wymieszaj kulki magnetyczne w roztworze. Po inkubacji probówki reakcyjnej w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut, wirować przez pięć sekund.

Umieścić probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym przed usunięciem supernatantu. Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu. Suszyć koraliki magnetyczne przez pięć minut przy otwartej pokrywie.

Po wyjęciu probówki reakcyjnej ze stojaka magnetycznego dodaj 22 mikrolitry podwójnie destylowanej wody, aby przykryć kulki magnetyczne i inkubować. Oddziel koraliki za pomocą stojaka magnetycznego, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie przenieś 20 mikrolitrów supernatantu do nowej wysterylizowanej probówki PCR przed przechowywaniem jej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Stwierdzono, że czystość neutrofili wynosi 98,5% w żywych komórkach po sortowaniu immunomagnetycznym. DNA biblioteki sekwencjonowania ATAC wykazało długość fragmentów od 100 do 1 000 par zasad bez zanieczyszczenia małymi lub dużymi fragmentami. Zaobserwowano typowy dla ATAC-Seq rozkład wielkości fragmentów z okresowymi pikami, reprezentujący obszary wolne od nukleosomów, mononukleosomy, dinukleosomy i trinukleosomy.

W porównaniu z kontrolą, neutrofile stymulowane LPS wykazały zwiększoną dostępność chromatyny w genach takich jak IL-10, STAT-1, IL12A, CXCL1 i IRAK1.