Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej
16 maja 2025
Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.
W laboratorium Morhardta używamy danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania rozwoju i funkcji pęcherza moczowego. Zidentyfikowaliśmy funkcjonalny pęcherz moczowy, który wypełnia się i opróżnia u danio pręgowanego. Chociaż danio pręgowany jest mały, staraliśmy się wykorzystać jego rozmiar, aby ekonomicznie wykorzystać techniki transkryptomiki przestrzennej i naszą wiedzę na temat pęcherza kręgowców.
Techniki transkryptomiki przestrzennej mogą szybko stać się drogie, jeśli odczynniki i sprzęt nie zostaną zoptymalizowane. Protokół ten zapewnia sprawdzoną technikę osiągnięcia tego celu przy użyciu danio pręgowanego i zapewnia wgląd w oczekiwane wyniki i łagodzenie problemów, które mogą pojawić się w wyniku tej technologii. Oprócz ekonomicznego wykorzystania drogich technologii transkryptomiki przestrzennej, prace te pozwoliły nam na przeprowadzenie przestrzennych analiz transkryptomicznych na dużą skalę zasadniczo całych narządów w kilku epokach, przy jednoczesnej minimalizacji efektów wsadowych.
Na początek ostudź kriostat do 22 stopni Celsjusza i zbierz wszystkie potrzebne przedmioty. Przygotuj jednorazową plastikową formę do wyrównania próbki. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej po wewnętrznej stronie formy bazowej i narysuj w poprzek niego linię prostą za pomocą markera permanentnego jako punktu odniesienia.
Zaznacz wnętrze formy podstawowej, aby zapewnić prawidłową orientację próbki podczas kriosekcji. Po zalaniu dyszy butelki z medium do zamrażania, dozuj niezbędną ilość do jednego rogu formy podstawowej. Powoli przechylaj formę podstawy, aby równomiernie rozprowadzić podłoże.
Teraz umieść formę bazową z zamrażarką w łaźni lodowej i inkubuj ją przez co najmniej 10 minut, aby schłodzić podłoże. Następnie dodaj jedną część 100% etanolu do jednej części suchego lodu w wiaderku na lód pod wyciągiem. Umieść jednorazowe aluminiowe naczynie lub łódkę w łaźni lodowej i przykryj wiadro na pięć do 10 minut.
Zbierz uśpione ryby po zanurzeniu ich w wodzie o temperaturze czterech stopni Celsjusza na 10 minut. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką chwyć płetwę ogonową, aby usunąć rybę i delikatnie dociśnij ją do chłonnej, niestrzępiącej się chusteczki, aby ją wysuszyć. Umieść przygotowaną formę bazową pod mikroskopem stereoskopowym z 10-krotnym powiększeniem.
Umieść próbkę w formie wzdłuż punktu odniesienia we właściwej orientacji. Delikatnie przykryj próbkę kolejną cienką warstwą pożywki do zamrażania. Użyj anatomicznego punktu odniesienia, aby dokładnie wyrównać rybę z zaznaczonymi liniami wewnątrz formy bazowej i dostosuj orientację za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, unikając pęcherzyków.
Nałóż kawałek suchego lodu na dno formy bazowej pod próbką, aż zostanie lokalnie zamrożony na miejscu. Utrzymuj płaską płaszczyznę poziomą, aby zapobiec niewspółosiowości próbki przed całkowitym zamrożeniem. Teraz umieść formę bazową z próbką na aluminiowej łodzi lub naczyniu w kąpieli z suchym lodem i etanolem.
Upewnij się, że łódź unosi się na powierzchni, a forma podstawy pozostaje sucha. Przykryj kąpiel i pozostaw próbki do zamrożenia na 10 minut. Następnie zawiń zamrożoną formę bazową w folię i przechowuj ją w zamrażarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do krojenia.
Przynieś zamrożoną formę bazową do wstępnie schłodzonego kriostatu w celu kriosekcji i umieść ją w komorze kriostatu. Po wyjęciu szkiełka do obrazowania przestrzennego z pamięci umieść je w wstępnie schłodzonym uchwycie na szkiełka. Przechowuj uchwyt szkiełka z szkiełkiem do obrazowania przestrzennego w komorze kriostatu o temperaturze 22 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do pobrania sekcji.
Teraz wyjmij zamrożoną próbkę z formy podstawowej i umieść ją w uchwycie ze świeżym medium do zamrażania, upewniając się, że powierzchnia cięcia jest skierowana w stronę ostrza mikrotomu. Następnie umieść świeże, drobne ostrze mikrotomu w kriostacie. Po wyrównaniu formy z ostrzem przytnij obszar zainteresowania zalecaną grubością od 20 do 50 mikrometrów.
Upewnij się, że oznaczenia wewnątrz formy są przenoszone na zamrożony blok w celu prawidłowej orientacji próbki. Podczas przycinania wyreguluj formę tak, aby powierzchnia cięcia pozostała równoległa do oznaczeń referencyjnych w medium zamrażającym. Pokrój skrawki z zamrożonego bloku i zbierz je na standardowe dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe.
Sprawdź skrawki pod mikroskopem jasnego pola, aby upewnić się, że przycinanie zostało zakończone. Następnie wyjmij szkiełko do obrazowania przestrzennego z komory kriostatu i umieść je w łaźni lodowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza, trzymając je w uchwycie szkiełka. Rozpocznij kriosekcję przy zalecanej grubości od 10 do 14 mikrometrów.
Zbieraj skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach, aż do osiągnięcia obszaru zainteresowania. Teraz wyjmij jednokomórkowy szkiełko do obrazowania przestrzennego z kąpieli lodowej i wyjmij szkiełko z uchwytu. Zbieraj sekcje rząd po rzędzie za pomocą pędzla z cienką końcówką, aby zapobiec toczeniu się.
Następnie dociśnij róg pustego medium zamrażającego do stolika noża za pomocą tylnej strony pędzla. Użyj górnej części zjeżdżalni jako punktu obrotu i powoli opuść zjeżdżalnię na sekcję, aby przylegała przez trzy sekundy przed podniesieniem. Ułóż sekcje szeregowe równolegle do siebie, aby zmaksymalizować miejsce na slajdzie.
Po zebraniu odcinków z obszaru zainteresowania umieść szkiełko z powrotem w uchwycie szkiełka. Jeśli nie są potrzebne żadne dodatkowe próbki, przechowuj szkiełko w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni przed analizą. Pobrać skrawki przed i po obszarze zainteresowania na standardowe dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe i wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną, aby ocenić wyrównanie próbki i jakość przekroju przed przystąpieniem do analizy.
Wyrównanie wielu sekcji zostało zweryfikowane poprzez porównanie struktur w różnych sekcjach w tym samym przekroju. Dostosowania etapów osadzania i pobierania umożliwiły zmieszczenie większej liczby sekcji w obszarze obrazowania przestrzennego preparatu transkryptomicznego. Jakość przestrzennego sygnału transkryptomicznego była wysoka w obrębie obszarów tkankowych, ale niższa w pustych obszarach szkiełka ze względu na niską złożoność sygnału.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie prezentuje metodę wyrównania i kriosekcjowania wielu próbek larw rybki zebra na potrzeby przestrzennej analizy transkryptomowej. Podejście ma na celu ekonomiczne wykorzystanie technik przestrzennej analizy transkryptomowej przy minimalizowaniu efektów wsadowości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Transkryptomyka
Tło
- Ryby zebra są używane jako organizm modelowy do badania rozwoju i funkcji pęcherza moczowego.
- Funkcjonalny pęcherz moczowy został zidentyfikowany u ryb zebra.
- Przestrzenne techniki transkryptomowe mogą być kosztowne, jeśli nie są zoptymalizowane.
- Protokół ten ma na celu dostarczenie informacji na temat oczekiwanych wyników i zmniejszenie problemów.
Cel badania
- Opracowanie opłacalnej metody przestrzennej analizy transkryptomowej przy użyciu ryb zebra.
- Przeprowadzenie dużych analiz całych narządów w różnym wieku.
- Minimalizowanie efektów wsadowości w badaniach transkryptomowych.
Stosowane metody
- Wyrównanie i kriosekcjowanie próbek larw ryb zebra.
- Zbieranie próbek na jednej szkle.
- Zastosowanie przestrzennych technik transkryptomowych.
- Optymalizacja reagentów i sprzętu dla efektywności kosztowej.
Główne wyniki
- Udane wyrównanie i kriosekcjowanie wielu próbek.
- Wgląd w rozwój pęcherza przez analizę transkryptomu.
- Zdemonstrowano ekonomiczne wykorzystanie przestrzennych technologii transkryptomowych.
- Zmniejszenie potencjalnych problemów związanych z technologią.
Wnioski
- Metoda pozwala na efektywną przestrzenną analizę transkryptomu u ryb zebra.
- Wspiera duże badania, minimalizując koszty i efekty wsadowości.
- To podejście może poprawić zrozumienie rozwoju pęcherza u kręgowców.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Spatial transcriptomic analysis in compactly arranged zebrafish sections enables high-throughput, cost-efficient mapping of gene expression across developmental stages. This approach reduces reagent and equipment costs while supporting robust, large-scale comparative studies with minimized batch effects. The method enhances early discovery and target validation by providing spatially resolved transcriptomic data in a genetically tractable vertebrate model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of gene expression patterns in developmental models.
- Supports biological de-risking by clarifying tissue-specific transcriptomic changes.
- Facilitates predictive confidence in target selection through high-content spatial data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, spatially organized tissue sections for downstream transcriptomic workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing batch effects across samples.
- Enables scalable, multiplexed analysis of multiple biological replicates on a single slide.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental gene expression data with disease-relevant pathways in vertebrate models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by leveraging conserved genetic homology.
- Provides mechanistic insights that inform risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This spatial transcriptomic specimen arrangement method fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling efficient hypothesis testing and pathway analysis in vertebrate models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven mapping of gene expression in spatial context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spatial transcriptomic outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, spatially registered gene expression data for robust statistical evaluation.
- Translational Research: Bridges developmental biology findings to preclinical disease models via conserved pathways.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective workflow adaptable to multiple experimental conditions and replicates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and spatial transcriptomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient study designs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, spatial transcriptomics, and zebrafish developmental biology.
- Needs access to spatial imaging platforms and analytical infrastructure for high-throughput data collection.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample alignment and sectioning protocols.
- Adaptable to other small vertebrate models with similar anatomical and genetic features.
- Section quality and alignment are critical for maximizing data output and minimizing signal loss.
