Name: Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę przestrzennej analizy transkryptomicznej w larwach Danio rerio, która umożliwia ekonomiczne badanie rozwoju pęcherza moczowego przy minimalizacji efektów wsadowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sekcja i obrazowanie zostały wykonane za pomocą narzędzi dostarczonych przez wspólne zasoby w Dartmouth Cancer Center, finansowane przez NCI Cancer Center Support Grant 5P30CA023108, oraz Center for Quantitative Biology at Dartmouth College (NIGMS COBRE).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami w Dartmouth College.
1. Przygotowanie kriostatu
<ol>
	<li>Schłodzić kriostat do temperatury -22 °C i oczyścić wewnętrzne powierzchnie kriostatu, wcierając zanieczyszczenia do pojemnika. Umieść wszystkie niezbędne szczotki i narzędzia w komorze.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jednorazowej formy bazowej
<ol>
	<li>Przygotuj formę bazową (jednorazowa forma z tworzywa sztucznego 37 mm 24 mm 5 mm) do wyrównania próbki, rysując linię prostą w poprzek wnętrza formy bazowej za pomocą trwałego markera, który będzie służył jako punkt odniesienia do wyrównania próbki. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej po wewnętrznej stronie formy bazowej, w miejscu, w którym powinna znajdować się linia prosta, zanim narysujesz linię, aby uzyskać najlepsze wyniki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Narysuj kropkę po wewnętrznej stronie formy bazowej w pobliżu lewej lub prawej ściany, aby zapewnić prawidłową orientację próbki podczas kriosekcji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Zmierz żądany kąt cięcia za pomocą kątomierza i zaznacz go po wewnętrznej stronie formy bazowej dla każdej próbki (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
	<li>Na przygotowaną formę bazową nałożyć płytką warstwę podłoża zamrażającego (optyczna tomografia koherentna [OCT]). Upewnij się, że jest wystarczająco dużo podłoża do zamrażania, aby przykryć próbki.
	<ol>
		<li>Unikaj pęcherzyków powietrza podczas nakładania medium zamrażającego, zalewając dyszę butelki z pożywką i dodając niezbędną ilość pożywki do jednego rogu formy bazowej przed przesunięciem płaszczyzny poziomej formy podstawowej, tak aby podłoże było równomiernie rozprowadzone na całej powierzchni.</li>
		<li>Powoli ściskaj butelkę podczas dozowania środka zamrażającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj lód do zlewki o pojemności 1 l, umieść formę bazową z zamrażarką w łaźni lodowej i inkubuj przez co najmniej 10 minut, aby schłodzić podłoże.</li>
</ol>
3. Przygotowanie suchego lodu: kąpiel 100% etanolowa
<ol>
	<li>Przygotuj kąpiel z suchym lodem i 100% etanolem w dygestorium, dodając jedną część 100% etanolu do jednej części suchego lodu w wiaderku na lód.</li>
	<li>Użyj jednorazowego naczynia aluminiowego lub złóż folię aluminiową w łódkę wystarczająco dużą, aby zmieściła się jednorazowa forma podstawowa. Upewnij się, że naczynie lub łódka jest wystarczająco duża, aby forma podstawy leżała całkowicie płasko.</li>
	<li>Umieść naczynie lub łódkę w wannie i przykryj wiadro. Odczekaj 5-10 minut, aż wiadro ostygnie przed zamrożeniem próbek.</li>
</ol>
4. Eutanazja próbek
<ol>
	<li>Losowo wybierz danio pręgowanego do podziału. Jeśli próbki różnią się wielkością, podziel je na grupy według względnej wielkości, aby ułatwić dokładne wyrównanie (zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje). Umieść większe ryby i mniejsze ryby w osobnych naczyniach.</li>
	<li>Napełnij zlewkę wodą z systemu rybnego i umieść zlewkę w pojemniku na lód. Otocz zlewkę lodem.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę wody za pomocą termometru. Pozwól, aby temperatura ustabilizowała się w zakresie 2-4 °C.</li>
	<li>Za pomocą siatki lub sitka umieścić jedną grupę ryb w wodzie o temperaturze 4 °C. Ryby powinny być całkowicie zanurzone w wodzie i nie mieć kontaktu z lodem. Po ustaniu ruchu operkularnego dodaj lód do wody, aby upewnić się, że temperatura nie spadnie poniżej 4 °C. Pozostaw ryby w wodzie o temperaturze 4 °C na 10 minut 
	UWAGA: Kontynuuj osadzanie, wyrównywanie i błyskawiczne zamrażanie każdej grupy uśpionych próbek przed eutanazją następnej grupy. Za każdym razem wymieniaj wodę.</li>
</ol>
5. Osadzanie i wyrównywanie
<ol>
	<li>Rybę poddaną eutanazji należy zebrać po zanurzeniu w wodzie o temperaturze 4 °C na 10 minut. Wyjmij rybę z wody za pomocą kleszczy z cienką końcówką, chwytając ją za płetwę ogonową i osusz, delikatnie dociskając ją do chłonnej, niestrzępiącej się chusteczki. 
	UWAGA: W przypadku sekcji o wysokiej jakości bardzo ważne jest ograniczenie czasu między wyjęciem ryb z wody o temperaturze 4 °C a błyskawicznym zamrożeniem</li>
	<li>Pracując z przygotowaną formą bazową w kąpieli lodowej pod mikroskopem stereoskopowym (10-krotne powiększenie), umieść każdą próbkę w formie bazowej wzdłuż punktów odniesienia we właściwej orientacji i delikatnie przykryj próbki kolejną cienką warstwą pożywki zamrażającej. 
	UWAGA: Nie napełniaj całej formy środkiem zamrażającym. Zamiast tego używaj tylko cienkiej warstwy, tylko tyle, aby pokryć wszystkie próbki.</li>
	<li>Użyj anatomicznego punktu odniesienia, aby precyzyjnie wyrównać rybę z liniami zaznaczonymi po wewnętrznej stronie formy podstawowej. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby dostosować orientację każdej ryby, tak aby były wyrównane i w tej samej orientacji. Unikaj tworzenia się pęcherzyków w podłożu zamrażającym, poruszając się powoli.</li>
	<li>Nałóż kawałek suchego lodu na dno formy bazowej pod próbki, aż zostaną miejscowo zamrożone na miejscu. Utrzymuj poziomą płaszczyznę formy podstawowej, aby uniknąć przesuwania próbek poza ich punkty odniesienia przed zamrożeniem na miejsce z suchym lodem.</li>
	<li>Umieść formę bazową z próbkami na aluminiowej łodzi lub naczyniu w kąpieli z suchym lodem: 100% etanolem. Upewnij się, że łódź unosi się na powierzchni wanny, a forma podstawy pozostaje sucha. Przykryj kąpiel i pozwól próbkom unosić się na wodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiń zamrożoną formę bazową w folię i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do cięcia. Powtórz kroki 4.2-5.6 dla pozostałych grup.</li>
</ol>
6. Kriosekcja
<ol>
	<li>Przynieś zamrożone formy bazowe do wstępnie schłodzonego kriostatu w celu kriosekcji i umieść je w komorze kriostatu. Transportuj zamrożone bloki w pudełku z suchym lodem, aby zapobiec rozmrożeniu.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko do obrazowania przestrzennego in situ z magazynu i umieść je we wstępnie schłodzonym uchwycie na szkiełka. Przechowuj uchwyt szkiełek ze szkiełkiem do obrazowania przestrzennego w komorze kriostatu o temperaturze -22 °C do czasu, gdy będzie gotowy do pobrania skrawków z obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Wyjmij zamrożone próbki z formy podstawowej, a następnie zamroź je w uchwycie ze świeżym medium do zamrażania. Zamroź je na uchwycie tak, aby powierzchnia cięcia była skierowana w stronę ostrza.</li>
	<li>Umieść świeże, drobne ostrze mikrotomu w kriostacie.</li>
	<li>Dopasuj formę do ostrza i przytnij obszar zainteresowania (zalecana grubość wykończenia 20-50 μm). Upewnij się, że oznaczenia wykonane wewnątrz formy są przenoszone na zamrożony blok próbki, aby pomóc zidentyfikować lokalizację w próbkach.</li>
	<li>Wyreguluj formę podczas fazy przycinania tak, aby powierzchnia cięcia była równoległa do oznaczeń referencyjnych w medium zamrażającym.</li>
	<li>Zbierz skrawki na standardowym dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym i sprawdź je w jasnym polu, aby potwierdzić, kiedy przycinanie nie jest już konieczne.</li>
	<li>Wyjąć szkiełko do obrazowania przestrzennego z komory kriostatu i umieścić je w łaźni lodowej o temperaturze 4 °C. Trzymaj suwak w uchwycie na suwak. Upewnij się, że zjeżdżalnia nie ulega zamoczeniu.</li>
	<li>Rozpocznij kriosekcję (zalecane 10-14 μm; <silna klasa="xfig">Rysunek 3) i zbierać skrawki na dodatnio naładowane szkiełka, aż do osiągnięcia obszaru zainteresowania w próbkach. Sprawdź sekcje za pomocą jasnego pola, aby potwierdzić, że obszar zainteresowania będzie następną sekcją z formy.</li>
	<li>Przynieś szkiełko do obrazowania przestrzennego pojedynczej komórki z powrotem do komory kriostatu. Wyjmij szkiełko z uchwytu szkiełka i zbierz sekcje z dokładnego obszaru zainteresowania na szkiełko do obrazowania przestrzennego rząd po rzędzie za pomocą pędzla z cienką końcówką, aby zapobiec zwijaniu się sekcji.
	<ol>
		<li>Wciśnij róg pustej, zamrażającej pożywki do stolika noża tylną stroną pędzla, tak aby sekcja pozostała płaska podczas chwytania szkiełka do zbierania.</li>
		<li>Użyj górnej części prowadnicy jako punktu obrotu, powoli opuść suwak na sekcję i pozwól, aby sekcje przylegały do suwaka przez 3 sekundy przed podniesieniem suwaka ze stolika noża.</li>
		<li>Pracuj od lewej do prawej podczas zbierania skrawków w obszarze obrazowania szkiełka i jeśli to możliwe, nakładaj na siebie warstwy pustej, zamrażającej pożywki.</li>
		<li>Użyj kolorowych obramowań papieru jako odniesienia, aby umieścić sekcje w obszarze obrazowania szkiełka, jeśli tkanka jest słabo widoczna</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Po zebraniu odcinków z obszaru zainteresowania umieść szkiełko z powrotem w uchwycie szkiełka. Jeśli na szkiełku do obrazowania przestrzennego nie ma już próbek do pobrania, należy przechowywać szkiełko w temperaturze -80 °C przez okres do 2 tygodni, aż będzie gotowe do analizy instrumentu za pomocą platformy obrazowania przestrzennego in situ. Jeśli konieczne jest pobranie skrawków z wielu form, umieść szkiełko do obrazowania przestrzennego z powrotem w łaźni lodowej o temperaturze 4 °C i powtórz kroki 6.3-6.11 z następną formą.</li>
	<li>Zbierz skrawki przed i po sekcjach obszaru zainteresowania z każdej formy na standardowym dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), aby sprawdzić, czy wyrównanie próbki i jakość przekroju są wystarczające przed przystąpieniem do analizy.</li>
</ol>
7. Naprawianie próbki
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka referencyjne z kriostatu i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby przykleić sekcje do szkiełka.</li>
	<li>Utrwalić skrawki, umieszczając je w pojemniku na szkiełka z 4% paraformaldehydem (Tabela 1) na 20 minut.</li>
	<li>Umyj sekcje, umieszczając je w pojemniku na szkiełko z wodą destylowaną na 3 minuty.</li>
	<li>Kontynuuj barwienie HE lub wysusz i przechowuj szkiełka w temperaturze -80 °C do przyszłego barwienia.</li>
</ol>
8. Barwienie sekcji HE
<ol>
	<li>Odwodnić i oczyścić sekcje, inkubując szkiełka w 100% etanolu przez 2 minuty, 95% (Tabela 2) etanolu przez 2 minuty, a następnie w wodzie z kranu przez 1 minutę. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.</li>
	<li>Wybarwić jądra i rozróżnić je przez inkubację szkiełek w hematoksylinie przez 2 min 45 s, wodzie z kranu przez 1 min, 0,3% zakwaszonym alkoholu (tabela 3) przez 1 min, a następnie pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.</li>
	<li>Zabarwić składniki cytoplazmatyczne i odwodnić przez inkubację szkiełek w Eozynie Y 1% przez 45 s, 50% etanolu (Tabela 4) przez 1 min, 95% etanolu przez 1 minutę i 100% etanolu przez 1 min. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.</li>
	<li>Oczyść sekcje, inkubując szkiełka w ksylenie przez 1 minutę. Zamontuj i przykryj szkiełka, nakładając kroplę podłoża montażowego na górną trzecią część szkiełka za pomocą pipety transferowej i powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe na wierzch podłoża montażowego za pomocą kleszczy.</li>
</ol>
9. Przestrzenne obrazowanie transkryptomiczne i analiza przekrojów
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka obrazowe z pamięci w temperaturze -80 °C i zobrazuj za pomocą platformy obrazowania przestrzennego in situ do przestrzennej analizy transkryptomicznej. 
	UWAGA: Dokładne kroki związane z obrazowaniem zostaną określone przez platformę obrazowania przestrzennego.</li>
	<li>Przegląd wskaźników kontroli jakości platformy transkryptomicznej przestrzennej. Ważne wskaźniki, które należy sprawdzić, to liczba wykrytych komórek, mediana transkryptów na komórkę, transkrypcje jądrowe na 100μm2 oraz całkowita liczba zdekodowanych transkryptów wysokiej jakości każdego genu w zestawie sondy. 
	UWAGA: Te wskaźniki kontroli jakości nie mają uniwersalnych progów, a oczekiwania dotyczące tych progów będą się różnić w zależności od użytej próbki i panelu genów.</li>
	<li>Odczytywanie danych wyjściowych wykrywalnych transkryptów RNA, określanie, które transkrypty są niskiej jakości na podstawie wskaźników kontroli jakości eksperymentu, i odfiltrowywanie transkryptów niskiej jakości. Przeanalizuj pozostałe transkrypcje wysokiej jakości pod kątem ich rozmieszczenia przestrzennego w obrębie sekcji.</li>
	<li>Wyświetlanie segmentacji komórkowej sekcji i komórek klastrowych w oparciu o zainteresowania eksperymentalne. Porównaj transkrypty RNA w klastrach komórkowych regionu zainteresowania w grupach danio pręgowanego w różnym wieku na tym samym slajdzie.</li>
</ol>

<ol><li>Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+tissue+architecture+using+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics.</a> Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nat Rev Genet. 22, 627-644 (2021).</li>
<li>Duhan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics%3A+background%2C+technologies%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics: background, technologies, applications, and challenges.</a> Mol Biol Rep. 51, 600(2024).</li>
<li>Ståhl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+gene+expression+in+tissue+sections+by+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics.</a> Science. 353 (6294), 78-82 (2016).</li>
<li>Colman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+and+targeted+sequencing+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+on+the+iSeq100+and+MiSeq%3A+A+performance%2C+ease-of-use%2C+and+cost+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Med%22%5BJournal%5D)">Whole-genome and targeted sequencing of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis on the iSeq100 and MiSeq: A performance, ease-of-use, and cost evaluation.</a> PLOS Med. 16 (4), e1002194(2019).</li>
<li>Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: zebrafish.</a> Development. 146 (18), dev167692(2019).</li>
<li>Mohideen, M. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology-based+screen+for+zebrafish+mutants+with+abnormal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Histology-based screen for zebrafish mutants with abnormal cell differentiation.</a> Dev Dyn. 228 (3), 414-423 (2003).</li>
<li>Copper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fixation+and+embedding+techniques+for+optimized+histological+preparation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 38-46 (2018).</li>
<li>Stock, R. J., Labudovich, M., Ducatman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+first-trimester+liver+cell+adenoma%3A+diagnosis+by+fine-needle+aspiration+cytology+with+cytochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic first-trimester liver cell adenoma: diagnosis by fine-needle aspiration cytology with cytochemical and ultrastructural study.</a> Obstet Gynecol. 66 (2), 287-290 (1985).</li>
<li>Petukhov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+segmentation+in+imaging-based+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell segmentation in imaging-based spatial transcriptomics.</a> Nat Biotechnol. 40 (3), 345-354 (2022).</li>
<li>Meyer, T., Tiburcy, M., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrotissues-on-a-plate+models+for+phenotypic+drug+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrotissues-on-a-plate models for phenotypic drug screens.</a> Adv Drug Deliv Rev. 140, 93-100 (2019).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Yu, K., Xing, J., Zhang, J., Zhao, R., Zhang, Y., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+multiple+cycles+of+freeze-thawing+on+the+RNA+quality+of+lung+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Effect of multiple cycles of freeze-thawing on the RNA quality of lung cancer tissues.</a> Cell Tissue Bank. 18 (3), 433-440 (2017).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biol. 21 (1), 57(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji ani nie występują w konflikcie interesów w związku z tym raportem.

Niniejszy raport zawiera szczegółowe rozwiązania wielu wyzwań technicznych związanych z danio pręgowanym jako organizmem modelowym w przestrzennej analizie transkryptomicznej podczas opracowywania. Aby sprostać tym wyzwaniom, nasz kompaktowy układ próbek optymalizuje koszty na powstających przestrzennych platformach transkryptomicznych1. Kriosekcja larw danio pręgowanego w celu obrazowania przestrzennego jest wyzwaniem. Skrawki powinny zachowywać wystarczającą strukturę tkankową i jakość transkryp...

Ocena przestrzennie odrębnych wzorców ekspresji w tkance pozostaje kluczowa dla naszego zrozumienia wpływów genomowych na rozwój, raka i choroby1,2,3. Transkryptomika przestrzenna łączy techniki ekspresji multipleksowej z przestrzenną rejestracją ekspresji w tkankach. "Transkryptomika przestrzenna" została po raz pierwszy ukuta przez Ståhla i współpracowników4, w której zamontowane próbki raka były badane przy użyciu sekwencjonowania in situ nowej generacji. Od tego czasu "transkryptomika przestrzenna" jest stosowana jako uniwersalne rozwiązanie do wysokoprzepustowych badań ekspresji w połączeniu z rejestracją przestrzenną. Chociaż są to potężne narzędzia, są to również kosztowne przedsięwzięcia, które często wymagają dużych inwestycji instytucjonalnych i kosztów laboratoryjnych, zanim będzie można wygenerować dane5. Strategie mające na celu minimalizację kosztów przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości danych cieszą się dużym zainteresowaniem.
Danio rerio, Danio rerio, stały się ważnym systemem modelowym do badania biologii rozwojowej i oferują sposób na zwielokrotnienie analiz całych organów (i organizmów) kręgowców na ograniczonej przestrzeni. Danio pręgowany jest mały (4-6 mm jako larwy i 2-3 cm jako dorosłe) i może składać setki przezroczystych jaj na raz6. Zarodki danio pręgowanego są zapładniane zewnętrznie i szybko się rozwijają, co pozwala naukowcom na wprowadzenie transgenów we wczesnych stadiach rozwoju, aby łatwo generować allele przyrostu i utraty funkcji7. Dopasowanie wielu próbek do jednego szkiełka to atrakcyjna strategia obniżania kosztów. Ich wysoka płodność i niewielkie rozmiary sprawiają, że danio pręgowany jest idealnym kandydatem do multipleksowania przestrzennych testów transkryptomicznych, które mają ograniczoną przestrzeń dla okazów8.
Kriosekcja larw danio pręgowanego to wymagająca technika. Wiele przestrzennych platform transkryptomicznych nie zostało zoptymalizowanych pod kątem skrawków parafiny danio pręgowanego i wymaga kriosekcji podczas pracy z danio pręgowanym jako organizmem modelowym w celu zachowania struktury tkanki i zachowania transkryptów RNA. Ponadto niewielki rozmiar danio pręgowanego utrudnia uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji i skuteczną analizę wielu próbek. Zadanie to staje się trudniejsze podczas pracy z larwami danio pręgowanego, które są mniejsze i bardziej kruche niż ich dorosłe odpowiedniki. Aby sprostać tym wyzwaniom, opisujemy metodę, która niezawodnie wyrównuje wiele próbek i efektywnie wykorzystuje obszar obrazowania platform obrazowania przestrzennego w celu uzyskania wielu wysokiej jakości sekcji na jednym slajdzie, które mogą być następnie obrazowane i analizowane przez platformy obrazowania przestrzennego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W tym przypadku metoda ta jest stosowana do platformy przestrzennego obrazowania transkryptomicznego.

<table><tbody><tr><td>1 L Zlewka</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>200 proof czysty etanol</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>VWR</td><td>0714</td><td>zakwaszony alkohol</td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aluminiowa Szkiełka nakrywkowe</td><td>Epredia</td><td>24X50-1,5-001G</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa forma bazowa</td><td>Fisher HealthCare</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Topnik DPX do wody</td><td></td><td></td><td></td>destylowanej</tr><tr><td>Łącznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>do histologii</td></tr><tr><td>Granulki</td><td></td><td></td><td></td>suchego lodu</tr><tr><td>Dumont #5SF Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna-Y Alkoholowa</td><td>Epredia</td><td>71204</td><td>Eozyna Y 1%</td></tr><tr><td>Gill 1 Hematoksylina</td><td>Epredia</td><td>72411</td><td>Hematoksyliną</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>chłonna, niestrzępiąca się chusteczka</td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania laboratoryjnego</td><td>VWR</td><td>89097-934</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomowe MX35 Ultra</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microme HM 525</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>23-730-571</td><td>medium zamrażające</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td> Marker <td>permanentny PFA</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>52877-886</td><td></td></tr><tr><td>Kątomierz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeClear Substytut ksylenu</td><td>Fisherbrand</td><td>68551-16-6</td><td>Substytut ksylenu</td></tr><tr><td>Ostrza jednokrawędziowe</td><td>American Line</td><td>66-0407</td><td></td></tr><tr><td>Steriomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>4350639000</td><td>Stemi 305 z podwójną diodą LED (4355259020) i stanowiskiem K lab (4354259010)</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Plus VWR</td><td></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenium V1 Szkiełko</td> do <td>przestrzennego obrazowania transkryptomicznego</td> <td>10X/Xenium</td><td>3000941</td></tr></tbody></table>

przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Spatially Compact Arrangement of Larval Zebrafish Sections for Spatial Transcriptomic Analysis

Techniki transkryptomicznej przestrzennej są zaawansowanym narzędziem w badaniach biomedycznych do wizualizacji przestrzennie zarejestrowanych wzorców ekspresji genów. Obrazowanie i analiza wielu próbek za pomocą platform obrazowania przestrzennego może być kosztowna. Przeprowadzanie tych testów w wielu warunkach eksperymentalnych, jak to widać w badaniach rozwojowych, dodatkowo zwiększa koszty. Aby obniżyć koszty, badanie to miało na celu optymalizację technik i strategii przestrzennego rozmieszczenia próbek transkryptomicznych do badań rozwojowych. W tym przypadku w badaniu wykorzystano danio pręgowanego, który jest dobrze ugruntowanym modelem kręgowców rozwojowych, który jest przezroczysty podczas rozwoju, ma ~70% genetycznej homologii do ludzi i wysoce opisany genom idealny do analizy transkryptomicznej. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, rozwój danio pręgowanego pozwala również na kompaktowe umieszczanie odcinków szeregowych w kilku powtórzeniach biologicznych. W niniejszym dokumencie informujemy o zoptymalizowanym utrwalaniu, kriosekcji i niezawodnym wyrównaniu wielu próbek ryb w obszarze obrazowania platformy obrazowania przestrzennego do hybrydyzacji in situ. Dzięki tej metodzie danio pręgowany w wieku zaledwie 15 dni po zapłodnieniu (dpf) z co najmniej 4 różnych form i do 174 skrawków może być z powodzeniem kriosekcyjny, zbierany w obszarze obrazowania 22 mm 10,5 mm (dla przestrzennego szkiełka transkryptomicznego in situ) i przetwarzany jednocześnie. Opierając się na jakości przekroju, wyrównaniu próbki i wielkości próbki na szkiełku, metoda ta u danio pręgowanego optymalizuje wydajność i koszt na próbkę technik transkryptomicznych przestrzennych.

W tej metodzie (Rysunek 1) danio pręgowany jest wykorzystywany jako model zwierzęcy do badania przestrzennie rozdzielczych wzorców ekspresji genów. Wydajne mrożenie i krojenie larw danio pręgowanego do obrazowania przestrzennego jest zadaniem trudnym. Przekroje muszą być wysokiej jakości, aby zachować strukturę tkanki i wykrywalność genów (Rysunek 4). Przekroje zawierające wiele próbek, przeznaczone do efektywnego obrazowania przestrzennego, muszą być precyzyjni...

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Spatial transcriptomic techniques are a sophisticated tool in biomedical research to visualize spatially registered gene expression patterns. Imaging and ...

W laboratorium Morhardta używamy danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania rozwoju i funkcji pęcherza moczowego. Zidentyfikowaliśmy funkcjonalny pęcherz moczowy, który wypełnia się i opróżnia u danio pręgowanego. Chociaż danio pręgowany jest mały, staraliśmy się wykorzystać jego rozmiar, aby ekonomicznie wykorzystać techniki transkryptomiki przestrzennej i naszą wiedzę na temat pęcherza kręgowców.Techniki transkryptomiki przestrzennej mogą szybko stać się drogie, jeśli odczynniki i sprzęt nie zostaną zoptymalizowane. Protokół ten zapewnia sprawdzoną technikę osiągnięcia tego celu przy użyciu danio pręgowanego i zapewnia wgląd w oczekiwane wyniki i łagodzenie problemów, które mogą pojawić się w wyniku tej technologii. Oprócz ekonomicznego wykorzystania drogich technologii transkryptomiki przestrzennej, prace te pozwoliły nam na przeprowadzenie przestrzennych analiz transkryptomicznych na dużą skalę zasadniczo całych narządów w kilku epokach, przy jednoczesnej minimalizacji efektów wsadowych.Na początek ostudź kriostat do 22 stopni Celsjusza i zbierz wszystkie potrzebne przedmioty. Przygotuj jednorazową plastikową formę do wyrównania próbki. Umieść kawałek taśmy laboratory

spatially-compact-arrangement-larval-zebrafish-sections-for-spatial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Opisano użycie automatycznego systemu wideo 3D, który może śledzić pojedyncze osoby i grupy danio pręgowanych. Jako przykład zastosowania badamy wpływ antagonisty receptora NMDA MK-801 na ławice danio pręgowanego.

Wykorzystanie zautomatyzowanego systemu śledzenia 3D do rejestrowania osobników i ławic dorosłych ryb pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę przestrzennej analizy transkryptomicznej w larwach Danio rerio, która umożliwia ekonomiczne badanie rozwoju pęcherza moczowego przy minimalizacji efektów wsadowych.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Przeglądaj więcej filmów