Name: Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę IBEX z etykietowaniem Click-iT EdU do wykrywania komórek dzielących się w naprawie skóry myszy. Otwarty pipeline obrazowania umożliwia wysokoprzepustową analizę proliferacji bez umiejętności programowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Centrum Mikroskopii i Analizy Obrazów za wsparcie w zakresie mikroskopu MD ImageXpress oraz Centrum Usług Zwierząt Laboratoryjnych w hodowli myszy. L.S. zostało sfinansowane z dwóch grantów Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (310030_192075 i 310030_207801), grantu Szwajcarskiej Fundacji Badań nad Rakiem (KLS-5391-08-2021) oraz przez SKINTEGRITY. Konsorcjum badawcze CH. S.S. był finansowany z grantu podoktorskiego Uniwersytetu w Zurychu (FK-22-056).

<ol><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+Mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation.</a> Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+-+aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing - aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276 (5309), 75-81 (1997).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Harsum, S., Clarke, J. D. W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reciprocal+relationship+between+cutaneous+nerves+and+repairing+skin+wounds+in+the+developing+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A reciprocal relationship between cutaneous nerves and repairing skin wounds in the developing chick embryo.</a> Dev Biol. 238 (1), 27-39 (2001).</li>
<li>Barker, A. R., Rosson, G. D., Dellon, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+denervated+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Wound healing in denervated tissue.</a> Ann Plast Surg. 57 (3), 339-342 (2006).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+nerve-dependent+and+independent+roles+on+mammalian+hind+limb+tissue+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9846-9851 (2014).</li>
<li>Donnerer, J., Schuligoi, R., Stein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+content+and+transport+of+substance+P+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+sensory+nerves+innervating+inflamed+tissue%3A+Evidence+for+a+regulatory+function+of+nerve+growth+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased content and transport of substance P and calcitonin gene-related peptide in sensory nerves innervating inflamed tissue: Evidence for a regulatory function of nerve growth factor in vivo.</a> Neuroscience. 49 (3), 693-698 (1992).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Derm+Venereol%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Derm Venereol. 96 (5), 587-597 (2016).</li>
<li>Johnston, A. P. W., Naska, S., Jones, K., Jinno, H., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-mediated+regulation+of+adult+neural+crest+precursors+and+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sox2-mediated regulation of adult neural crest precursors and skin repair.</a> Stem Cell Rep. 1 (1), 38-45 (2013).</li>
<li>Napoli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+the+ERK-signaling+pathway+in+controlling+Schwann+cell+plasticity+and+peripheral+nerve+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo.</a> Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).</li>
<li>Johnston, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+Schwann+cell+precursors+secreting+paracrine+factors+are+required+for+regeneration+of+the+mammalian+digit+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated Schwann cell precursors secreting paracrine factors are required for regeneration of the mammalian digit tip.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 433-448 (2016).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Uxa, S., Castillo-Binder, P., Kohler, R., Stangner, K., Müller, G. A., Engeland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Ki-67 gene expression.</a> Cell Death Differ. 28 (12), 3357-3370 (2021).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8 (1), 14836(2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Sci Rep. 7 (1), 4358(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Parfejevs, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-activated+glial+cells+promote+wound+healing+of+the+adult+skin+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Injury-activated glial cells promote wound healing of the adult skin in mice.</a> Nat Commun. 8 (1), 14396(2018).</li>
<li>Peña, O. A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+skin+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of skin wound healing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (8), 599-616 (2024).</li>
<li>Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolism+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration.</a> Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).</li>
<li>Dowsett, M., Dunbier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biomarkers+and+new+understanding+of+traditional+markers+in+personalized+therapy+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging biomarkers and new understanding of traditional markers in personalized therapy for breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (24), 8019-8026 (2008).</li>
<li>Dowsett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Ki67+in+breast+cancer%3A+Recommendations+from+the+International+Ki67+in+Breast+Cancer+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Assessment of Ki67 in breast cancer: Recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group.</a> J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).</li>
<li>Gerdes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+tumour-cell+growth+fraction+in+malignant+non-Hodgkin%27s+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of tumour-cell growth fraction in malignant non-Hodgkin's lymphomas.</a> Lancet. 330 (8556), 448-449 (1987).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization%3A+A+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.

Proliferacja komórek jest jednym z czterech głównych etapów naprawy skóry, a przejście między fazą zapalną a fazą proliferacji jest kluczowe dla udanego procesu naprawy20. Dobrze zregulowana odpowiedź immunologiczna jest niezbędna, ponieważ długotrwałe zapalenie może prowadzić do przewlekłych ran, co jest istotnym globalnym problemem zdrowotnym 1,21. Proliferacja to kluczowy proces biologiczny, ważny nie tylko dla naprawy tkanek, ale także...

Skóra jest największym organem ludzkiego ciała i pierwotną barierą chroniącą ciało przed środowiskiem zewnętrznym1. W konsekwencji jest narażona na szereg zewnętrznych wyzwań, które ograniczają jego funkcję bariery. Dlatego skóra rozwinęła złożone mechanizmy przywracające integralność i funkcjonalność tkanek po uszkodzeniu. Gojenje ran skórnych przebiega w trzech nakładających się etapach: zapalenie, proliferacja oraz dojrzewanie/przebudowanie. Te trzy etapy obejmują kilka różnych typów komórek, takich jak włókniki skórne i komórki odpornościowe, które współdziałają w celu przywrócenia początkowych właściwości biologicznych uszkodzonej tkanki skóry 1,2,3.
Skóra jest narządem o gęstym unerwieniu i wiadomo, że unerwienie nerwów jest kluczowe dla pomyślnego procesu naprawy 4,5,6. Poza sygnalizacją aksonalną 4,7,8, glej obwodowy, zwykle oplatający aksony, uczestniczy w pomyślnej regeneracji tkanek 9,10,11. Jednak rola niedostatecznie reprezentowanych typów komórek, takich jak obwodowe komórki glejowe, pozostaje słabo poznana w dynamicznych procesach, takich jak regeneracja tkanek skóry. Aby lepiej określić funkcję tych komórek, kluczowe jest przeanalizowanie mikrośrodowiska komórkowego oraz sąsiednich typów komórek, z którymi mogą one oddziaływać podczas procesu regeneracji. Ponadto, ponieważ proliferacja komórek jest kluczowym etapem regeneracji tkanek, ważne jest dokładne wykrywanie i klasyfikowanie typów proliferujących się komórek w trakcie procesu naprawy.
Opracowano multipleksowane, wysoko-contentowe, metody obrazowania optycznego, takie jak IBEX12, które służą do charakteryzacji składu komórkowego, wizualizacji i ilościowej identyfikacji interakcji między komórkami oraz rozkładania wzorców mikrośrodowiskowych w złożonych tkankach w rozdzielczości przestrzennej. Podczas gdy inne metody multipleksowania wymagają specjalistycznych instrumentów i zastrzeżonych odczynników, szczególną zaletą IBEX jest możliwość jego ustanowienia przy stosunkowo niskich kosztach, korzystając z komercyjnie dostępnych przeciwciał, odczynników i mikroskopów dostępnych w standardowym środowisku badawczym. Podczas gdy przeciwciała anty-Ki-67, często stosowane w panelach IBEX, niezawodnie oznaczają proliferujące się typy komórek w wielu tkankach13,14, liczba komórek Ki-67-dodatnich (Ki-67+) została zaniżona w porównaniu z innymi metodami w stałych przekrojach mrożonej tkanki ostrych ran skóry myszy. Dlatego połączyliśmy chemię Click-iT EdU z IBEX i stwierdziliśmy, że liczba komórek EdU+ dokładniej odzwierciedla całkowitą liczbę komórek proliferujących uzyskaną innymi metodami.
Ponadto, dzięki zastosowaniu w pełni zautomatyzowanego obrotowego mikroskopu konfokalnego dyskowego, ustanowiono wysokoprzepustowy workflow do iteracyjnego obrazowania przekrojów tkanek umieszczonych na 24-dołkowej płycie. Powstałe obrazy są następnie przetwarzane przez połączenie wielu otwartych narzędzi Pythona w nowy pipeline przetwarzania obrazów, który koryguje obrazy pod kątem nierównomiernego oświetlenia, wykonuje łączenie poszczególnych kafelków, a ostatecznie rejestruje obrazy. Szczegółowo, biblioteka BaSiCPy15 była wykorzystywana do korekcji oświetlenia, biblioteka m2stitch do łączenia obrazów oraz korelacja fazowo-krzyżowa do rejestracji cyklu. Zarejestrowane obrazy są zapisywane jako OME-TIFF i mogą być następnie ładowane do konwencjonalnego oprogramowania do analizy obrazów, takich jak Fiji17 i QuPath18, gdzie obrazy są następnie dalej przetwarzane, a także kategoryzacja typów komórek i inne pomiary, takie jak obliczanie intensywności i odległości. Łącznie obecny protokół pozwolił nam przeprowadzić szczegółową, bardzo efektywną charakterystykę głównych typów komórek regenerującej się skóry, ze szczególnym uwzględnieniem mikrośrodowiska komórkowego otaczającego populację obwodowych komórek glejowych.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała i odczynniki&nbsp;</td><td>ŹRÓDŁO</td><td>IDENTYFIKATOR</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td><silne>przeciwciała</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Alexa Fluor 647 (cykl 2) & c.</td><td>BioLegend</td><td>Cat#102516</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AB_2161029</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45 Alexa Fluor 488 (Cykl 2) & bez śladu;</td><td>BioLegend</td><td>Cat#103122</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AB_493531</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 FITC (Cykl 1) &nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat#151212</td><td>1:50</td></tr><tr><td>AB_2814055</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurczak Ki-67 (ck)</td><td>LSBio</td><td>Cat#LS-C772946</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Ki-67 rat (rt)&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat#652402</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AB_11204254</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (cykl 3) &nbsp;</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>Katalog#837710</td><td>1:300</td></tr><tr><td>AB_2734613</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p75NTR (Cykl 1) &nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>Cat#8238&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; AB_10839265</td><td>1:1500</td></tr><tr><td>Vimentin Alexa Fluor 488 (Cykl 3) &nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat#699305</td><td>1:100</td></tr><tr><td>AB_2888889</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 osioł antykróliczy</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Katalog#711-605-152</td><td></td></tr><tr><td><silne>odczynniki</mocne>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellvis 24-dołkowa szklana płytka dolna</td><td>Cellvis&nbsp;</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna chromu aluminiowego</td><td>Dostawa dla nowicjuszy</td><td>Katalog#1033A</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Katalog#14533; CAS# 23491-52-3</td><td></td></tr><tr><td>LiBH4, borowodnikiem litu, 95%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#10438443</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura</td><td>Biosystems Switzerland</td><td>Katalog#7109-4583</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Katalog#10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy mikroskopowe Superfrost Plus Adhesion&nbsp;</td><td>Epredia</td><td>Cat#J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Kat#T8787</td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczotka do włosów&nbsp;</td><td>Faust AG</td><td>Cat#9172051 i 9172050</td><td></td></tr><tr><td>Łopatka mikrotomu&nbsp;</td><td>Biosystems Switzerland</td><td>Cat#207500011</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Urządzenia molekularne, ImageXpress Confocal HT.ai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#HBMCR4220</td><td></td></tr><tr><td>Shaker rocker</td><td>Edmund B&uuml; hler GmbH</td><td>Cat#32310015</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

High-throughput Imaging and Analysis Workflow for Evaluating Skin Cell Phenotypes and Proliferation States in Tissue Samples

Urazy skóry inicjują złożoną kaskadę regeneracyjną, która angażuje różne typy komórek. Wśród nich komórki glejowe obwodowe odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu sukcesu procesu naprawy. Jednak nasza wiedza na temat tych procesów pozostaje niepełna ze względu na ograniczenia obecnych technologii. Dlatego zastosowano metodę iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) do charakteryzowania zmian w składzie komórkowym skóry za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko białkom eksprysowanym przez kluczowe typy komórek i struktury zaangażowane w regenerację tkanek. Co ważne, przeciwciała skierowane przeciwko markerom proliferacji komórek często zaniżają liczbę komórek dzielących się w skórze. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, chemia Click-iT EdU została połączona z metodą IBEX, co pozwoliło na szczegółową charakterystykę proliferujących typów komórek. Korzystając z w pełni zautomatyzowanego obrotowego mikroskopu konfokalnego dyskowego, opracowano wysokoprzepustowy workflow do iteracyjnego obrazowania próbek podzielonych na płytki 24-dołkowe. Poza rozszerzeniem metody IBEX do oceny stanów komórek in situ za pomocą Click-iT EdU, wprowadzono także nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów do korekcji, łączenia i rejestracji obrazów, który może być używany przez badaczy bez dużego doświadczenia programistycznego. Ponadto dostarczona jest szczegółowa dokumentacja dotycząca przetwarzania i wizualizacji wysoce multipleksowanych danych obrazowych (przy użyciu konwencjonalnego oprogramowania do analizy obrazów, w tym Fiji i QuPath). Podsumowując, protokół ten podkreśla wszechstronność protokołu IBEX i pokazuje jego adaptację do ugruntowanej konwencjonalnej platformy obrazowania. Warto zauważyć, że połączenie IBEX z oznakowaniem Click-iT EdU umożliwia wykrywanie i kategoryzację aktywnie dzielących się typów komórek w nienaruszonych tkankach oraz podczas wysoce dynamicznych procesów o rozdzielczości przestrzennej.

Metoda ta pozwala na odpowiednie wykrywanie proliferujących się typów komórek poprzez połączenie chemii EdU Click-iT z IBEX w stałych zamrożeniach przekrojach skóry myszy. Wykrywanie proliferujących typów komórek porównano za pomocą różnych metodologii, w szczególności oznaczania proliferujących się typów komórek przeciwciałem Ki-67 oraz wykrywania proliferacji komórek za pomocą podejścia chemicznego EdU Click-iT (Rysunek 1). Zaobserwowaliśmy, że znakowanie p...

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Skin injuries initiate a complex regenerative cascade that engages various cell types. Amongst those, peripheral glial cells play a critical role in ...

Protokół ten łączy multipleksową metodę obrazowania optycznego, IBEX oraz oznakowanie Click-iT EDU, aby wykrywać i kategoryzować dzielące się typy komórek w wysoce dynamicznych procesach, takich jak naprawa skóry. Ponadto oferujemy nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów do pozyskiwania i analizy obrazów o wysokiej przepustowości. Posmaruj płytę 24-dołkową 200 mikrolitrami żelatyny chromowo-aluminiowej i inkubuj ją przez 15 minut na wstrząsaczce z wahaczkami.Następnie całkowicie usuń żelatynę i susz powłokę przez 60 minut w piekarniku w temperaturze 40 stopni. Tkankę osadzoną w OCT przetnij na głębokość 15 do 30 mikrometrów przy kriostatie i szybko przenieś ją do powlekanej dołki zawierającej dwa mililitry PBS. Ostrożnie usuń PBS pipetą o jednym mililitrze, aby utrzymać przekrój tkanki wyśrodkowany w dołku.Aby skutecznie to zrobić, powoli zasysaj PBS od krawędzi dołka, regulując pozycję pipety w razie potrzeby, aby zapobiec przesuwaniu się tkanki. Susz fragmenty chusteczki przez godzinę w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nawadniaj się 1 mililitrem PBS przez pięć minut.Przepuszczaj tkankę 500 mikrolitrami 0,5% Tritonu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Krótko umyj tkankę dwa razy PBS i wykonaj reakcję Click-iT przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chroń próbki przed światłem.Krótko umyj chusteczkę dwa razy PBS. Blokuj przez godzinę z buforem blokującym w temperaturze pokojowej. Dodaj pierwotne przeciwciała na pierwszy cykl.I inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Myj PBS trzy razy. Wykonaj barwienie przeciwciał wtórnych.W pierwszym cyklu należy stosować przeciwciała wtórne dla niesprzężonych przeciwciał pierwotnych razem z jądrowym barwieniem przeciwbarwnikiem. Inkubuj próbki chronione przed światłem przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj tkankę trzy razy jednym mililitrem PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Zostaw około 500 mikrolitrów PBS w każdym dołku i przynieś płytkę do mikroskopu. W oprogramowaniu Meta Express kliknij Screening, a następnie Acquisition Setup. Kliknij przycisk Wyrzuć.Oczyść dno płytki 70% etanolem i włożyć płytkę do mikroskopu. Kliknij przycisk Load Plate. W zakładkach Obiektyw i Kamera wybierz pożądane powiększenie.Jako tryb akwizycji wybierz konfokalny 51-mikrometrowy režim szczeliny. W zakładce Tablica wybierz model tablicy. Przejdź do zakładki Tablice Strony Odwiedzaj.W sekcji Opcje lokalizacji kliknij na stałą liczbę lokalizacji. Ustaw liczbę zarówno kolumn, jak i wierszy tak, aby mniej więcej cała studnia była pokryta. Kliknij na miejsca nakładające się 10%. Wybierz tylko pierwszy odwiert do przejęcia, klikając prawym przyciskiem myszy odpowiadający mu odwiert na mapie płyt.Przejdź do zakładki Acquisition Autofocus. Aby ustawić ostrość do dobrej, wybierz opcję płyty i dolnego otworu. Aby ustawić autofokus na stronie, wybierz opcję Wszystkie miejsca.Przejdź do zakładki Długości fal i wybierz liczbę barwników, które mają być obrazowane w bieżącym cyklu. Przejdź do zakładki pierwszej długości fali. Wybierz laser z przesunięciem Z dla pozycjonowania Z i kliknij przycisk Calculate Offset, aby ustawić właściwą wysokość obrazowania.Wybierz obraz, na którym próbka jest najlepiej ostra. Naciśnij przycisk Focus. Pokazano ostry obraz tkanki.Ustaw moc oświetlenia na 50%, ustaw docelową maksymalną intensywność na 2000 i naciśnij Autoekspozycję. Dla serii Z wybierz obraz z serii Z i projekcją 2D, a do korekcji cieniowania wybierz tylko cieniowanie FL. Powtórz kroki dla innych długości fal, ale zamiast lasera z przesunięciem Z, wybierz przesunięcie Z z W1 i wybierz zero.Przejdź do kroku serii Z i wpisz pożądany rozmiar kroku. Kliknij przycisk Focus. Przeciągnij strzałkę z aktualną pozycją, aż dotrzesz do dolnej części chusteczki i kliknij przycisk Set B.Przeciągnij strzałkę pozycji na górę chusteczki i kliknij przycisk Ustaw T. Kliknij F2, Stop, naciśnij Start Live ponownie. Upewnij się, że etap znajduje się w pierwszej studni, klikając na nią lewym przyciskiem.Znajdź brzeg tkanki i zaznacz wszystkie miejsca zawierające tkankę do pobrania, klikając prawym przyciskiem. Przejdź do zakładki Run i wpisz nazwę tablicy. Kliknij na Zapisz Protokół.Ustaw region pozyskiwania dla wszystkich pozostałych odwiertów. Uruchom Control, Journal, rozpocznij nagrywanie, a potem natychmiast Control, Journal, zatrzymaj nagrywanie. Zapisz utworzony dziennik i otwórz go ponownie za pomocą Control, Journal, Edit Journal.W lewym panelu przejdź do Plate Acquisition, załaduj protokół z pliku i kliknij Plate Acquisition, aby dodać te kroki do magazynu. Kliknij dwukrotnie na Edytuj Pobieranie Płyty, załaduj protokół z pliku i wybierz protokół zapisany dla pierwszego dołu. Powtarzaj kroki dla każdego dołka do zdobycia, zawsze ładując odpowiedni protokół.Kliknij na Run Journal, aby rozpocząć akwizję. 30 minut przed końcem dziennika zacznij przygotowywać odczynnik wybielający. Rozpuścić 10 miligramów borowodniku litu w 10 mililitrach podwójnie destylowanego H2O i przepuścić przez filtr o średnicy 0,22 mikrometra.Wyjedź na 10 minut. Roztwór powinien zacząć tworzyć bąbelki. Aby zapewnić efektywne wybielanie, użyj odczynnika wybielającego w ciągu czterech godzin po przygotowaniu.Dodaj roztwór wybielający do próbek i inkubuj przez 15 minut, utrzymując próbki wystawione na działanie światła otoczenia. Na tkance powinny pojawić się małe pęcherzyki. Przemyj wybielone próbki trzy razy jednym mililitrem PBS przez pięć minut, każdy w temperaturze pokojowej.Dodaj główne przeciwciała na kolejny cykl i wysiabuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Multipleksowane obrazowanie IBEX w połączeniu z oznakowaniem EDU Click-iT ujawnia różne struktury i typy komórek proliferujących w uszkodzonej skórze. Znakowanie EDU na próbkach kriozachowanych wykazuje podobność podczas stosowania znakowania immunofluorescencji przeciwciał dla KI-67 na przekrojach tkanek osadzonych w parafinie, a także przy znakowaniu komórek KI 67 za pomocą cytometrii przepływowej.Stosowanie tego protokołu pozwala na dokładne wykrywanie proliferacji komórek w złożonych procesach biologicznych. Co więcej, open source pipeline przetwarzania obrazów nie wymaga doświadczenia programistycznego i generuje pliki, które można przetwarzać za pomocą oprogramowania niekomercyjnego, takiego jak Fiji czy quPath. Ponadto protokół ten nie wymaga kosztownego sprzętu i dlatego może być stosowany w większości środowisk badawczych.

high-throughput-imaging-analysis-workflow-for-evaluating-skin-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Tutaj opisujemy zastosowanie metody Iterative Bleaching Extended Multiplicity (IBEX), wykorzystującą komercyjnie dostępne, zautomatyzowane barwienia tkanek oraz rozważania optymalizacyjne dla stosowania odczynników opartych na wzmacnianiu sygnału tyramidowego.

Iteracyjne wybielanie zwiększa wielość poprzez zastosowanie automatyzacji barwienia w kluczowych obiektach

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Przedstawiamy tutaj półautomatyczny protokół identyfikacji i ilościowej identyfikacji i ilościowej identyfikacji komórek odpornościowych i nieimmunologicznych w przekrojach skóry za pomocą SCAnED, darmowego makro opartego na ImageJ do segmentacji skóry.

SCAnED – otwartoźródłowe makro do segmentacji skóry do półautomatycznego wykrywania komórek i jąder w przegrodach skóry naskórnej i skórnej

Poznaj metodę IBEX z etykietowaniem Click-iT EdU do wykrywania komórek dzielących się w naprawie skóry myszy. Otwarty pipeline obrazowania umożliwia wysokoprzepustową analizę proliferacji bez umiejętności programowania.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Przeglądaj więcej filmów