Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Protokół ten łączy multipleksową metodę obrazowania optycznego, IBEX oraz oznakowanie Click-iT EDU, aby wykrywać i kategoryzować dzielące się typy komórek w wysoce dynamicznych procesach, takich jak naprawa skóry. Ponadto oferujemy nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów do pozyskiwania i analizy obrazów o wysokiej przepustowości. Posmaruj płytę 24-dołkową 200 mikrolitrami żelatyny chromowo-aluminiowej i inkubuj ją przez 15 minut na wstrząsaczce z wahaczkami.

Następnie całkowicie usuń żelatynę i susz powłokę przez 60 minut w piekarniku w temperaturze 40 stopni. Tkankę osadzoną w OCT przetnij na głębokość 15 do 30 mikrometrów przy kriostatie i szybko przenieś ją do powlekanej dołki zawierającej dwa mililitry PBS. Ostrożnie usuń PBS pipetą o jednym mililitrze, aby utrzymać przekrój tkanki wyśrodkowany w dołku.

Aby skutecznie to zrobić, powoli zasysaj PBS od krawędzi dołka, regulując pozycję pipety w razie potrzeby, aby zapobiec przesuwaniu się tkanki. Susz fragmenty chusteczki przez godzinę w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nawadniaj się 1 mililitrem PBS przez pięć minut.

Przepuszczaj tkankę 500 mikrolitrami 0,5% Tritonu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Krótko umyj tkankę dwa razy PBS i wykonaj reakcję Click-iT przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chroń próbki przed światłem.

Krótko umyj chusteczkę dwa razy PBS. Blokuj przez godzinę z buforem blokującym w temperaturze pokojowej. Dodaj pierwotne przeciwciała na pierwszy cykl.

I inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Myj PBS trzy razy. Wykonaj barwienie przeciwciał wtórnych.

W pierwszym cyklu należy stosować przeciwciała wtórne dla niesprzężonych przeciwciał pierwotnych razem z jądrowym barwieniem przeciwbarwnikiem. Inkubuj próbki chronione przed światłem przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj tkankę trzy razy jednym mililitrem PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Zostaw około 500 mikrolitrów PBS w każdym dołku i przynieś płytkę do mikroskopu. W oprogramowaniu Meta Express kliknij Screening, a następnie Acquisition Setup. Kliknij przycisk Wyrzuć.

Oczyść dno płytki 70% etanolem i włożyć płytkę do mikroskopu. Kliknij przycisk Load Plate. W zakładkach Obiektyw i Kamera wybierz pożądane powiększenie.

Jako tryb akwizycji wybierz konfokalny 51-mikrometrowy režim szczeliny. W zakładce Tablica wybierz model tablicy. Przejdź do zakładki Tablice Strony Odwiedzaj.

W sekcji Opcje lokalizacji kliknij na stałą liczbę lokalizacji. Ustaw liczbę zarówno kolumn, jak i wierszy tak, aby mniej więcej cała studnia była pokryta. Kliknij na miejsca nakładające się 10%. Wybierz tylko pierwszy odwiert do przejęcia, klikając prawym przyciskiem myszy odpowiadający mu odwiert na mapie płyt.

Przejdź do zakładki Acquisition Autofocus. Aby ustawić ostrość do dobrej, wybierz opcję płyty i dolnego otworu. Aby ustawić autofokus na stronie, wybierz opcję Wszystkie miejsca.

Przejdź do zakładki Długości fal i wybierz liczbę barwników, które mają być obrazowane w bieżącym cyklu. Przejdź do zakładki pierwszej długości fali. Wybierz laser z przesunięciem Z dla pozycjonowania Z i kliknij przycisk Calculate Offset, aby ustawić właściwą wysokość obrazowania.

Wybierz obraz, na którym próbka jest najlepiej ostra. Naciśnij przycisk Focus. Pokazano ostry obraz tkanki.

Ustaw moc oświetlenia na 50%, ustaw docelową maksymalną intensywność na 2000 i naciśnij Autoekspozycję. Dla serii Z wybierz obraz z serii Z i projekcją 2D, a do korekcji cieniowania wybierz tylko cieniowanie FL. Powtórz kroki dla innych długości fal, ale zamiast lasera z przesunięciem Z, wybierz przesunięcie Z z W1 i wybierz zero.

Przejdź do kroku serii Z i wpisz pożądany rozmiar kroku. Kliknij przycisk Focus. Przeciągnij strzałkę z aktualną pozycją, aż dotrzesz do dolnej części chusteczki i kliknij przycisk Set B.

Przeciągnij strzałkę pozycji na górę chusteczki i kliknij przycisk Ustaw T. Kliknij F2, Stop, naciśnij Start Live ponownie. Upewnij się, że etap znajduje się w pierwszej studni, klikając na nią lewym przyciskiem.

Znajdź brzeg tkanki i zaznacz wszystkie miejsca zawierające tkankę do pobrania, klikając prawym przyciskiem. Przejdź do zakładki Run i wpisz nazwę tablicy. Kliknij na Zapisz Protokół.

Ustaw region pozyskiwania dla wszystkich pozostałych odwiertów. Uruchom Control, Journal, rozpocznij nagrywanie, a potem natychmiast Control, Journal, zatrzymaj nagrywanie. Zapisz utworzony dziennik i otwórz go ponownie za pomocą Control, Journal, Edit Journal.

W lewym panelu przejdź do Plate Acquisition, załaduj protokół z pliku i kliknij Plate Acquisition, aby dodać te kroki do magazynu. Kliknij dwukrotnie na Edytuj Pobieranie Płyty, załaduj protokół z pliku i wybierz protokół zapisany dla pierwszego dołu. Powtarzaj kroki dla każdego dołka do zdobycia, zawsze ładując odpowiedni protokół.

Kliknij na Run Journal, aby rozpocząć akwizję. 30 minut przed końcem dziennika zacznij przygotowywać odczynnik wybielający. Rozpuścić 10 miligramów borowodniku litu w 10 mililitrach podwójnie destylowanego H2O i przepuścić przez filtr o średnicy 0,22 mikrometra.

Wyjedź na 10 minut. Roztwór powinien zacząć tworzyć bąbelki. Aby zapewnić efektywne wybielanie, użyj odczynnika wybielającego w ciągu czterech godzin po przygotowaniu.

Dodaj roztwór wybielający do próbek i inkubuj przez 15 minut, utrzymując próbki wystawione na działanie światła otoczenia. Na tkance powinny pojawić się małe pęcherzyki. Przemyj wybielone próbki trzy razy jednym mililitrem PBS przez pięć minut, każdy w temperaturze pokojowej.

Dodaj główne przeciwciała na kolejny cykl i wysiabuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Multipleksowane obrazowanie IBEX w połączeniu z oznakowaniem EDU Click-iT ujawnia różne struktury i typy komórek proliferujących w uszkodzonej skórze. Znakowanie EDU na próbkach kriozachowanych wykazuje podobność podczas stosowania znakowania immunofluorescencji przeciwciał dla KI-67 na przekrojach tkanek osadzonych w parafinie, a także przy znakowaniu komórek KI 67 za pomocą cytometrii przepływowej.

Stosowanie tego protokołu pozwala na dokładne wykrywanie proliferacji komórek w złożonych procesach biologicznych. Co więcej, open source pipeline przetwarzania obrazów nie wymaga doświadczenia programistycznego i generuje pliki, które można przetwarzać za pomocą oprogramowania niekomercyjnego, takiego jak Fiji czy quPath. Ponadto protokół ten nie wymaga kosztownego sprzętu i dlatego może być stosowany w większości środowisk badawczych.