Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju
7 marca 2025
Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.
Na początek zbierz zarodki danio pręgowanego we wczesnym stadium po trzech dniach od zapłodnienia na szalce Petriego. Za pomocą mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów ustawionej na objętość 100 mikrolitrów, przenieś jeden zdrowo wyglądający wykluty zarodek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Teraz należy odpipetować niezbędną ilość badanej substancji chemicznej do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
Następnie dostosuj całkowitą objętość do 2,4 mililitra za pomocą podłoża E3. Przygotować kontrolę pojazdu zgodnie z rozpuszczalnikiem użytym do rozpuszczenia podstawowej badanej substancji chemicznej. Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów usuń istniejący roztwór E3 z każdej studzienki płytki 96-dołkowej.
Za pomocą ośmiokanałowej mikropipety zastąpić ją 100 mikrolitrami przygotowanego podłoża testowego dla każdego stężenia. Upewnij się, że bada się łącznie 24 larwy na stężenie. Po 24 godzinach użyj stereoskopowego mikroskopu świetlnego, aby wykonać ocenę morfologiczną.
Oceń morfologię za pomocą metody binarnej, gdzie brak oznacza normalną morfologię, a obecny wskazuje na nieprawidłowość morfologiczną. Po zakończeniu nacinania usuń 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Zastąp go 50 mikrolitrami świeżo przygotowanej pożywki testowej.
Usuń i zapisz wszelkie martwe larwy, a następnie wysiaduj larwy w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza w 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym cyklu ciemności. Danio pręgowany po pięciu dniach od zapłodnienia wykazywał różne fenotypy po dwóch dniach ekspozycji na lek. Niedotknięte danio pręgowane ryby obserwowano normalnie, podczas gdy łagodny obrzęk osierdzia był widoczny u niektórych ryb.
U innych obserwowano ciężki obrzęk osierdzia, któremu towarzyszył krwotok z żółtka i wydłużenie żółtka. Zaobserwowano również opóźniony rozwój ze zmniejszoną pigmentacją, pęcherzem pławnym i długością całkowitą. Dodatkowe fenotypy obejmowały danio pręgowanego z nabrzmiałym żółtkiem i załamaną płetwą ogonową, brakiem płetwy ogonowej i zakrzywioną struną grzbietową.
Ciężkie przypadki wykazywały skrócenie i śmierć z martwicą.
Przegląd
To badanie opisuje protokół przesiewowego testowania leków u larw rybki zwanych danio pręgowanym, w wieku 3-7 dni po zapłodnieniu, koncentrując się na ocenach morfologicznych po ekspozycji na leki. Celem jest analiza różnych fenotypowych wyników wynikających z różnych chemicznych obróbek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Przesiewowe testowanie leków
- Biologia rozwoju
- Danio pręgowane jako organizmy modelowe
Tło
- Larwy danio są wartościowe do oceny efektów rozwojowych leków.
- Ocena morfologiczna dostarcza informacji na temat fenotypów indukowanych przez leki.
- Zrozumienie tych efektów może pomóc w przesiewowym badaniu toksyczności i badaniach farmakologicznych.
Stosowane metody
- Ekspozycja na leki w kontrolowanym środowisku.
- Larwy danio jako system biologiczny.
- Punktacja morfologiczna przy użyciu mikroskopu stereoskopowego.
Główne wyniki
- Obserwowano zróżnicowane fenotypy po ekspozycji na leki, w tym normalną morfologię, łagodne do ciężkiego obrzęku osierdzia i opóźnienia rozwojowe.
- Zarejestrowano specyficzne anomalie, takie jak brak pęcherza pławny i zmieniona morfologia płetw.
- Wykazano wpływ obróbek chemicznych na rozwój danio.
Wnioski
- To badanie ilustruje zastosowanie danio do oceny efektów leków na rozwój.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia toksyczności chemikaliów i ich konsekwencji w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized small molecule screening and toxicity testing in early-stage zebrafish larvae addresses a critical gap in preclinical safety assessment. This protocol enables reproducible, quantitative evaluation of compound-induced morphological changes, supporting predictive confidence in early drug discovery. Integrating robust zebrafish-based toxicity data informs portfolio triage and de-risks downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of compound toxicity in a vertebrate model system.
- Supports biological de-risking by identifying developmental liabilities early.
- Facilitates functional target validation through observable phenotypic outcomes.
- Improves predictive confidence for advancing chemical series.
Screening & Assay Development
- Establishes a standardized, scalable workflow for high-throughput toxicity screening.
- Delivers reproducible, quantifiable morphological endpoints for assay development.
- Supports screening readiness by defining optimal plate formats and exposure conditions.
- Enables reliable comparison of compound effects across batches and studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early toxicity findings with translational safety biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical risk assessment.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on vertebrate model data.
- Reduces late-stage attrition by flagging developmental toxicants early.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish-based protocol fits at the intersection of early discovery and preclinical safety, bridging in vitro screening and mammalian model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for compound safety and developmental impact.
- Screening: Delivers standardized, reproducible toxicity readouts suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Provides binary and quantitative morphological data for robust statistical analysis.
- Translational Research: Offers early alignment with vertebrate safety endpoints relevant to human risk.
- Enterprise Reuse: Protocol standardization enables cross-program and cross-site adoption for consistent safety evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early safety assessment.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and assay standardization across discovery teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of safer chemical entities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry and morphological assessment.
- Needs access to multiwell plate handling and stereo microscopy infrastructure.
- Demands cross-team agreement on scoring criteria and exposure parameters.
- Adaptable to various compound classes but limited to early developmental toxicity endpoints.
- Dependent on rigorous statistical analysis for reliable interpretation of binary and quantitative data.
