Name: Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę biodrukowania 3D rusztowań z rdzeniem i osłonką do kontrolowanego uwalniania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w leczeniu ran przewlekłych. Protokół poprawia skuteczność terapii regeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Saida Al-Hashmi i Abdulrahmana Almharbiego z Happy Production za ich doskonałą pracę przy filmowaniu. Wyrażamy również naszą wdzięczność Ministerstwu Szkolnictwa Wyższego, Badań Naukowych i Innowacji oraz Uniwersytetowi w Nizwa za wsparcie finansowe i zapewnienie niezbędnych środków.

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi ustalonymi przez Narodową Komisję Bioetyki oraz Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nizwa. Zgoda etyczna dla tego badania została udzielona na podstawie zezwolenia ID: VCGSR, AREC/01/2023. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych, zapewniając optymalną kontrolę środowiska, prawidłowe odżywianie i kompleksową opiekę w celu ochrony ich dobrostanu przez cały czas trwania badania. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były ściśle przestrzegane zgodnie z polityką instytucjonalną, międzynarodowymi standardami opieki nad zwierzętami i wytycznymi ARRIVE.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Pobrać fiolkę z MSCs (przejście #2) z magazynu ciekłego azotu i obchodzić się z nią przy użyciu technik aseptycznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, upewniając się, że zostaną usunięte, gdy tylko pozostanie mały fragment lodu.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę, w skład której wchodzi MSC SFM Basal Media, uzupełniona 1% (v/v) MSC SFM XenoFree, 1% (v/v) GlutaMAX i 0,01% (v/v) gentamycyny. Dodać 1 ml podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki w ilości 3 do 5 kropli co 5 s do fiolki, a następnie delikatnie wymieszać. Przenieść całą zawartość fiolki z MSCs do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki, w warunkach aseptycznych, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio wyważona.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki. Następnie przenieść komórki do kolby T25 zawierającej 4 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Delikatnie przechylić kolbę, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 2 dni, zastępując je świeżym, wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożem. Używaj delikatnego pipetowania, aby uniknąć rozerwania komórek. Po osiągnięciu zbiegu 70%-80% należy odessać zużytą pożywkę z kolby T25.</li>
	<li>Umyj komórki 3 ml świeżego PBS, aby usunąć pozostałości. Upewnij się, że kolba jest całkowicie pokryta podczas prania.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny do kolby T25, inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-7 minut i uważnie monitorować oderwanie pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>W razie potrzeby delikatnie postukać w kolbę, aby zapewnić całkowite odłączenie komórek. Dodaj wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę do kolby i pipetuj w górę iw dół po powierzchni, aby ułatwić odłączenie komórek. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym podłożu i policzyć komórki za pomocą hemocytometru Neubauera. Przenieść komórki do kolby T75. Zapewnić gęstość wysiewu 5 000 komórek/cm2 dla optymalnego wzrostu.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po 72 godzinach inkubacji komórek zebrać kondycjonowane podłoże z komórek do izolacji EVs. Zużyć natychmiast po pobraniu.</li>
</ol>
2. Izolacja EV
<ol>
	<li>Odwirować 13 ml zebranej kondycjonowanej pożywki o stężeniu 800 x g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Delikatnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm, aby usunąć duże cząstki.</li>
	<li>Dodać 5 ml buforu strącającego do przefiltrowanej pożywki kondycjonowanej i dokładnie wymieszać, aby wymieszać. Upewnij się, że roztwór jest jednorodny.</li>
	<li>Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie się pojazdów elektrycznych. Odwirować mieszaninę przy stężeniu 3,220 g przez 30 minut w temperaturze 20 °C. Sprawdzić równowagę probówek.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Ponownie odwirować osad przy 3,220 x g przez 5 sekund, aby usunąć resztki cieczy.</li>
	<li>Delikatnie odpipetuj granulkę EV w 200 μl PBS, aby uniknąć uszkodzenia EV. Zmierz stężenie białka EV zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw do oznaczania białek BCA).</li>
	<li>Wykonaj Western blotting w celu wykrycia markerów specyficznych dla EV (CD63, CD81 i CD9), aby zweryfikować fenotyp EV18. Analiza potwierdziła obecność tych markerów, potwierdzając tożsamość EVs19.</li>
	<li>Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia RNazą, zaleca się stosowanie go bezpośrednio, bez dodatkowego przechowywania. W razie potrzeby przechowuj pojazdy elektryczne w temperaturze -80 °C do dalszego użytku. Podziel zawiesinę EV na 40 μl objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
3. Oznakowanie pojazdów elektrycznych za pomocą PKH-26
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,238 g HEPES w około 90 ml sterylnej ultraczystej wody w sterylnym pojemniku. Użyj świeżo przygotowanego roztworu HEPES. Dodać 0,85 g NaCl do roztworu HEPES.</li>
		<li>Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH lub HCl, w zależności od potrzeb, za pomocą skalibrowanego pH-metru. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm, aby go wysterylizować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 4 μl barwnika PKH-26 w 1 ml przygotowanego buforu. Dokładnie wymieszać pipetą, aby zapewnić jednorodność.</li>
	<li>Zawiesić oczyszczone EV w 1 ml PBS w stężeniu 700 μg/ml. Dodać 1 ml zawiesiny EVs do 1 ml przygotowanego roztworu PKH-26. W przypadku grupy kontrolnej z samym barwnikiem dodać 1 ml kompletnej pożywki bez EV do 1 ml roztworu PKH-26. Wszystkie kolejne kroki są wykonywane również dla grupy kontrolnej, aby uwzględnić potencjalną niespecyficzną agregację lub tworzenie miceli.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj EVs, delikatnie odwracając rurkę 10x-15x. Inkubować mieszaninę przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej, zapewniając równomierną ekspozycję EV na barwnik.</li>
	<li>Przygotować 2 ml świeżego 1% roztworu BSA, używając sterylnej ultraczystej wody i dodać go do 2 ml otrzymanej mieszaniny w celu wygaszenia reakcji etykietowania. Delikatnie wymieszaj, aby zapobiec agregacji.</li>
	<li>Skoncentruj EV oznaczone PKH-26 zgodnie z wyżej wymienionym protokołem (kroki 2.2-2.7). Ponownie zawiesić oznaczone EV w 300 μl PBS. Odpipetować próbkę EVs z oznaczeniem PKH-26 do probówki filtrującej o mocy 30 kDa.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie wolny barwnik PKH-26 i małe cząsteczki przejdą przez membranę do filtratu, podczas gdy EV znakowane PKH-26 zostaną zatrzymane w retentacie.</li>
	<li>Po wstępnym odwirowaniu odrzucić filtrat i dodać 300 μl PBS do retentatu. Delikatnie zawiesić EV w PBS, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zmycia pozostałego wolnego barwnika lub małych cząsteczek.</li>
	<li>Potwierdzić brak PKH-26 w roztworze filtratu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli zostanie wykryty jakikolwiek barwnik, powtórz kroki prania.</li>
	<li>Zebrać górny roztwór za pomocą mikropipety i wyjąć filtr z probówki zbiorczej. Ostrożnie odwróć filtr (odwróć go do góry nogami).</li>
	<li>Odwirować odwrócony filtr o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pomoże to zebrać zatrzymane PKH-26-EV z membrany filtracyjnej do nowej probówki zbiorczej. W następnym kroku skorzystaj bezpośrednio z PKH-26-EV.</li>
</ol>
4. 3D Bio-printing
<ol>
	<li>Przygotowanie biotuszy
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży 4,5% (w/v) roztwór alg sodu, używając sterylnej ultraczystej wody. Mieszać przez noc w temperaturze 60 °C, aby roztwór całkowicie się rozpuścił.</li>
		<li>Rozpuść CMCh w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać 3,8% (w/v) roztwór. Przygotuj świeże. Mieszać przez noc w temperaturze 60 °C do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Odwirować przygotowane biotusze o stężeniu 3 220 x g przez 10 minut w temperaturze 25°C, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogą zakłócać proces drukowania.</li>
		<li>Wymieszać przygotowane 3 ml roztworu Alg z oznakowanymi EV lub kontrolą samą z barwnikiem za pomocą mieszalnika strzykawkowego, aby uzyskać stężenie 0,01% (w/v) EV. Zapewnij równomierne rozprowadzenie poprzez delikatne mieszanie.</li>
		<li>Za pomocą mieszalnika strzykawkowego połączyć 1 ml CMCh ze świeżo przygotowanym roztworem AlgLyase w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mU/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 1A, jednocześnie załaduj biotusz Alg/Exo do części rdzeniowej i biotusz CMCh/AlgLyase do części osłonowej zestawu strzykawki rdzeń/osłona.</li>
	<li>Pozostaw biotusze na 15 minut przed wydrukowaniem.</li>
	<li>Konfiguracja drukarki 3D bio
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania 3D-bioprinter, utwórz konstrukcję rusztowania, wybierając kształt cylindryczny z ukośnym wzorem wypełnienia. W tym celu należy ustawić średnicę i wysokość cylindra odpowiednio na 20 mm i 1,1 mm. Skonfiguruj wielkość porów na 1 mm.</li>
		<li>Ustaw prędkość pompowania dyszy rdzenia i osłony na 1 mm/s przy grubości 0,25 mm na warstwę i ustaw prędkość ruchu na 6 mm/s. Wydrukuj cztery warstwy o grubości 0,25 mm na warstwę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij drukowanie na folii poliestrowej.</li>
	<li>Użyj nawilżacza z chlorkiem wapnia w aerozolu (2.2%), aby usieciować rusztowanie podczas procesu wytłaczania. Umieść dyszę nawilżacza w odległości około 20 cm od głowicy wytłaczającej, aby zapewnić skuteczne sieciowanie bez naruszania konstrukcji rusztowania. W celu dalszego sieciowania zanurzyć rusztowanie w roztworze chlorku wapnia (2,2%) na 10 minut.</li>
	<li>Opłucz rusztowanie 3x sterylną, ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia i niezwiązanego biotuszu.</li>
	<li>Upewnij się, że rusztowanie jest przechowywane w sterylnym środowisku w temperaturze 4 °C, aby zachować integralność i funkcjonalność rusztowania przez okres do trzech miesięcy.</li>
</ol>
5. Śledzenie wydania EV
<ol>
	<li>Stworzenie kolistego modelu rany skórnej
	<ol>
		<li>Znieczulenie samców heterozygotycznych myszy z cukrzycą Akita (8 tygodni) poprzez podanie dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (70 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg). Umieść znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej lub kocu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, oceniając brak reakcji odruchowych (np. szczypanie palca u nogi) i monitoruj częstość oddechów. Aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia, nałóż sterylną weterynaryjną maść okulistyczną na oczy.</li>
		<li>Przygotuj obszar skóry grzbietowej, najpierw goląc go za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Unikaj podrażnień lub obrażeń skóry. Zdezynfekuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi rundami peelingu na bazie jodu i alkoholu.</li>
		<li>Za pomocą sterylnego stempla do biopsji skóry zaznacz okrągły obszar o średnicy 6 mm na skórze, a następnie wytnij zaznaczoną tkankę nożyczkami chirurgicznymi, aby utworzyć ranę skórną o pełnej grubości na grzbietowej powierzchni każdej myszy.</li>
		<li>Delikatnie umieść biodrukowane rusztowanie 3D zawierające EV z oznaczeniem PKH bezpośrednio na łożysku rany. Upewnij się, że rusztowanie całkowicie zakrywa powierzchnię rany z minimalnymi kieszeniami powietrznymi, lekko naciskając sterylnymi kleszkami. Upewnij się, że zwierzę jest ściśle obserwowane po zabiegu i pozostaje pod opieką, dopóki w pełni nie odzyska przytomności i nie będzie w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie fluorescencyjne
	<ol>
		<li>Po 2 godzinach, 4 godzinach, 8 godzinach, 24 godzinach od implantacji znieczulić myszy za pomocą izofluranu. W celu indukcji znieczulenia umieść myszy w komorze systemu obrazowania in vivo (IVIS) i wystaw je na działanie 2%-3% izofluranu w tlenie. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu. Po znieczuleniu przenieś myszy do systemu IVIS i utrzymuj je za pomocą 1%-2% izofluranu w tlenie dostarczanym przez kanały nosowe. Sprawdź, czy zwierzęta są w pełni znieczulone i stabilne przed przystąpieniem do obrazowania.</li>
		<li>Użyj systemu IVIS do wychwytywania sygnałów fluorescencyjnych z pojazdów elektrycznych oznaczonych PKH uwalnianych z rusztowania. W kreatorze obrazowania wybierz opcję Obrazowanie fluorescencyjne i aktywuj filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika PKH. Dostosuj ustawienia kamery, w tym pole widzenia i wysokość obiektu, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału. Zapewnij spójne pozycjonowanie we wszystkich punktach czasowych obrazowania, aby umożliwić dokładne porównania. Rozpocznij pobieranie obrazów i zapisz wynikowe dane.</li>
		<li>Określ ilościowo natężenie sygnału fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania IVIS. Umożliwi to śledzenie uwalniania pojazdów elektrycznych w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic wounds.</a> Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).</li>
<li>Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+functional+wound+dressings%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Recent advances in functional wound dressings.</a> Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+trends+in+therapeutic+algorithm+of+chronic+wound+healers%3A+Recent+advances+in+drug+delivery+systems%2C+concepts-to-clinical+application+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Ther+Drug+Carrier+Syst%22%5BJournal%5D)">Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).</li>
<li>Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+dressings%3A+Current+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Poly+Sci%22%5BJournal%5D)">Wound dressings: Current advances and future directions.</a> J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).</li>
<li>Ding, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+skin+wound+healing%3A+Roles%2C+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Military+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges.</a> Military Med Res. 10 (1), 36(2023).</li>
<li>Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-based+biovectors+in+chronic+wound+healing%3A+Biogenesis+and+delivery+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).</li>
<li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).</li>
<li>Han, P., Ivanovski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+bioprinted+extracellular+vesicles+for+tissue+engineering-a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective.</a> Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+Rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-mediated+extracellular+vesicles+for+enhanced+wound+healing%3A+The+latest+progress%2C+and+their+prospects+for+3d+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).</li>
<li>Keener, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+extracellular+vesicles+can+enhance+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How extracellular vesicles can enhance drug delivery.</a> Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).</li>
<li>Han, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+bioprinted+small+extracellular+vesicles+from+periodontal+cells+enhance+mesenchymal+stromal+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function.</a> Biomater Adv. 158, 213770(2024).</li>
<li>Born, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+released+of+bioactive+mesenchymal+stromal+cell-derived+extracellular+vesicles+from+3d-printed+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).</li>
<li>Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+tissue+constructs+using+coaxial+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting.</a> Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).</li>
<li>Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coaxial+nozzle-assisted+3d+bioprinting+with+built-in+microchannels+for+nutrients+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery.</a> Biomaterials. 61, 203-215 (2015).</li>
<li>Deshayes, S., Kasko, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+biomaterials+with+engineered+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Poly+Sci+A+Poly+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymeric biomaterials with engineered degradation.</a> J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyperbranched+poly+%28%CE%B2-amino+ester%29+hydrogels+with+on-demand+degradation+profiles+to+match+wound+healing+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes.</a> Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).</li>
<li>Vakilian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+local+delivery+of+extracellular+vesicles+loaded+with+si-tnf-%CE%B1%2C+via+a+core-sheath+3d-bio-printed+scaffold+as+an+effective+wound+dressing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Delivery+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing.</a> J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).</li>
<li>Mirsanei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+and+dexamethasone+on+macrophage+polarization+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammopharmacology%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions.</a> Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).</li>
<li>Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-embedded+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-embedded materials.</a> J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).</li>
<li>Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+applications+of+adipose-derived+stem+cell-extracellular+vesicles+in+the+inflammation+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing.</a> Front Immunol. 14, 1214757(2023).</li>
<li>Lou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-based+therapeutics+for+the+regeneration+of+chronic+wounds%3A+Current+knowledge+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives.</a> Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).</li>
<li>Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+strategies+for+enhancing+diabetic+wound+healing+from+the+perspective+of+spatial+inflammation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Mater%22%5BJournal%5D)">Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns.</a> Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+hydrogel-based+engineered+extracellular+vesicles+delivery+for+complicated+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing.</a> Theranostics. 14 (11), 4198(2024).</li>
<li>Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+modulators+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as modulators of wound healing.</a> Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).</li>
<li>Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synergistic+effect+of+surface+topography+and+sustained+release+of+tgf-%CE%B21+on+myogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).</li>
<li>Jayaraman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+drugs+in+electrosprayed+nanoparticles+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering.</a> Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).</li>
<li>Huang, X., Brazel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+importance+and+mechanisms+of+burst+release+in+matrix-controlled+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems.</a> J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).</li>
<li>Smith, A. M., Senior, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+with+tuneable+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels with tuneable properties.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).</li>
<li>Yan, X., Sha, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+strategies+for+enhanced+drug+penetration+and+retention+in+the+airway+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa.</a> Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).</li>
<li>Pant, B., Park, M., Park, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+applications+of+core-sheath+nanofibers+prepared+by+coaxial+electrospinning%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review.</a> Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).</li>
<li>Pinheiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Intelligent+delivery+strategies+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications.</a> J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).</li>
<li>Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+locus%2C+mody4%2C+distal+to+d7mit189+on+chromosome+7+determines+early-onset+niddm+in+nonobese+c57bl%2F6+%28akita%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice.</a> Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).</li>
<li>Fang, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+db%2Fdb+mouse+in+translational+wound+healing+research%3A+Is+the+noncnzo10+polygenic+mouse+model+superior%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior.</a> Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).</li>
<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Sellers, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mouse+models%3A+Immune+variation+and+efficacy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing.</a> Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Kluczowym aspektem protokołu jest konstrukcja rusztowania z rdzeniem i osłoną, która jest niezbędna do osiągnięcia wydajnej dostawy pojazdów elektrycznych. Konstrukcja zawiera Alg jako materiał rdzenia i połączenie CMCh z Alglyase jako osłoną. Taka konfiguracja ułatwia kontrolowane i szybkie uwalnianie pojazdów elektrycznych. Materiał rdzenia, Alg, otacza pojazdy elektryczne, zapewniając ich ochronę i lokalne dostarczanie. Osłona, składająca się z CMCh i Alglyase, umożliwia przyspieszoną degradację rdzenia Alg, co ma klu...

Przewlekłe rany, często związane z nadmiernym stanem zapalnym, wymagają szybkiego leczenia, aby zapobiec poważnym powikłaniom, takim jak infekcje i martwica tkanek, które mogą prowadzić do amputacji. Pomimo postępów, obecne metody leczenia są nadal kosztowne, niewygodne, mają skutki uboczne i ograniczoną skuteczność, co podkreśla potrzebę stosowania większej liczby opatrunków leczniczych1,2,3. Opracowanie nowej generacji opatrunków przeznaczonych specjalnie do leczenia ran przewlekłych ma zasadnicze znaczenie dla sprostania tym wyzwaniom. Co więcej, złożona natura gojenia się ran wymaga materiałów opatrunkowych o różnych właściwościach, w tym nawilżaniu, elastyczności, przyczepności, bioaktywności i biodegradowalności4. Badanie to ma na celu opracowanie bioinżynieryjnego opatrunku na rany, który integruje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z rusztowaniem wydrukowanym biologicznie w 3D, aby zapewnić kontrolowane środowisko terapeutyczne i przyspieszyć gojenie się ran przewlekłych.
EV pochodzące z komórek macierzystych wspomagają przewlekłe gojenie się ran poprzez promowanie reakcji przeciwzapalnych, wzrostu komórek, migracji i tworzenia naczyń krwionośnych5. Dodatkowo, EV mogą dostarczać bioaktywne cząsteczki, w tym leki małocząsteczkowe, konstrukty genów i białek do leczenia ran przewlekłych6. Co więcej, ich zdolność do ochrony ładunku przed degradacją enzymatyczną poprawia stabilność i biodostępność środków terapeutycznych, oferując wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi czynnikami wzrostu i lekami małocząsteczkowymi, które często szybko ulegają degradacji in vivo7. Pomimo tych zalet, skuteczne i trwałe dostarczanie pojazdów elektrycznych do tkanek docelowych pozostaje poważnym wyzwaniem.
Rusztowania do biodruku 3D mogą służyć jako platforma dostarczania dla pojazdów elektrycznych, aby zwiększyć ich efekty terapeutyczne8. Rusztowania te naśladują naturalne środowiska komórkowe i pozwalają na kontrolowane uwalnianie EVs9,10. Chronią również EV przed degradacją, zwiększając stabilność ich mikroRNA i białek11. Han i in. wykazali, że pojazdy elektryczne mogą być skutecznie uwalniane z biodrukowanych rusztowań GelMA w 3D. To uwolnienie doprowadziło do poprawy przyczepiania komórek i zwiększonej ekspresji genów związanych ze szlakami mechanotransdukcji w mezenchymalnych komórkach macierzystych ludzkiej poduszeczki tłuszczowej policzków (hBFP-MSC) wysiewanych na rusztowaniach12. Born i wsp., optymalizując stężenie środka sieciującego, osiągnęli kontrolowane uwalnianie EV. Podejście to wykazało skuteczność w promowaniu angiogenezy i oferuje obiecującą metodę regulowanego dostarczania EVs13.
Bioprinting 3D-Liner umożliwia tworzenie złożonych, wielomateriałowych struktur poprzez drukowanie materiału rdzenia zamkniętego w osłonie. Rdzeń może zawierać komórki, czynniki wzrostu lub leki, podczas gdy osłonka zapewnia mechaniczne wsparcie i ochronę lub działa jako bariera. Metoda ta ma zastosowanie w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, takich jak tworzenie sieci naczyniowych, naśladowanie naturalnych struktur tkankowych i tworzenie systemów dostarczania leków. Pozwala to na precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem i składem materiału, zwiększając funkcjonalność i znaczenie biologiczne konstruktów. W porównaniu z alternatywnymi technikami, biodruk 3D z rdzeniem i osłoną zapewnia precyzyjną kontrolę nad dystrybucją i składem materiału, poprawiając funkcjonalność i znaczenie biologiczne konstruktów14,15.
Inżynieryjna degradacja w opatrunkach na rany oferuje takie korzyści, jak zmniejszenie dyskomfortu podczas zmian, wilgotne środowisko do gojenia i kontroli infekcji, terminowe dostarczanie terapii i optymalna regeneracja tkanek16,17,18. Hydrożele alginianowe (Alg) i karboksymetylocelulozowe (CMCh) są biokompatybilne i skuteczne w dostarczaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) do ran, przyspieszając gojenie poprzez komunikację komórkową i zmniejszając stan zapalny18. W tym badaniu EV zostały zintegrowane z rdzeniem Alg, podczas gdy osłona CMCh i AlgLyase (AlgLyase) została użyta, aby umożliwić szybką degradację opatrunku i dostarczanie EVs. Ta konstrukcja osłony rdzenia ułatwia szybkie uwalnianie pojazdów elektrycznych w odpowiedzi na degradację rusztowania, zwiększając ich skuteczność terapeutyczną i rozwiązując ograniczenia istniejących metod leczenia ran przewlekłych. Głównym celem tego badania jest opracowanie bioinżynieryjnego opatrunku, który przyspiesza gojenie się ran poprzez integrację kontrolowanego uwalniania EV z responsywnie degradowalnym rusztowaniem, co ostatecznie poprawi wyniki leczenia ran przewlekłych.

<table><tbody><tr><td>23 G Fioletowa precyzyjna stożkowa dysza</td><td>Cellink</td><td>KT0000002000</td><td>Aby zapewnić precyzyjne wytłaczanie biotuszy przy minimalnym zatykaniu</td></tr><tr><td>Liaza alginianowa (AlgLyase)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1603-100MG</td><td>Algyase to enzym, który rozkłada alginian.</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 30 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC9030</td><td>Służy do mycia BCA z oznaczeniem PKH-26 EVs</td></tr><tr><td>Zestaw testowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>10678484</td><td>Do oznaczania stężenia białka/EV</td></tr><tr><td>Bioprinting System</td><td>Regemat</td><td>V1</td><td>Do wytwarzania rusztowania osłonki rdzeniowej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>sigma-aldrich</td><td>05470-5G</td><td>Aby zatrzymać reakcję PKH 26&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306-100G</td><td>Do sieciowania i stabilizacji biotuszy w inżynierii tkankowej</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td>2-16P</td><td>Służy do izolacji EVs</td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>Służy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>Telstar</td><td>Bio II Advance</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>CryoCube&nbsp; Seria F570 - Zamrażarka ULT</td><td>Eppendorf</td><td>F571240035</td><td>Do przechowywania mikroskopu</td></tr><tr><td>fluorescencyjnego</td><td>EV OLYMPUS&nbsp;</td><td>IX73P1F&nbsp;</td><td>Służy do sprawdzania pozostałości PKH-26 w filtracie</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/mL)</td><td>Thermofisher</td><td>15750</td><td>Antybiotyk do pożywek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I CTS, (100X), płyn</td><td>Thermofisher</td><td>A12860</td><td>Suplement do pożywek do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td>Przygotowanie buforu&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>Sztuka. Nie.&nbsp; 6763.3</td><td>Przygotowanie buforu&nbsp;</td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza o wysokiej lepkości (CMCh)</td><td>BDH</td><td>27929 4T</td><td>CMCh jest rozpuszczalną w wodzie pochodną celulozy.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>&nbsp; NB-170R</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Obrazowanie Invivo</td><td>PerkinElmer</td><td>IVIS Lumina XRMS Series III&nbsp;</td><td>Aby śledzić uwalnianie pojazdów elektrycznych, in vivo</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>SalvisLAB</td><td>MC35</td><td>Do przygotowania biotuszy</td></tr><tr><td>miRCURY Zestawy egzosomów do izolacji egzosomów</td><td>Qiagen</td><td>76743</td><td>Izolacja Evs</td></tr><tr><td>NaOh</td><td>Daejung</td><td>1310-73-2</td><td>Przygotowanie buforu&nbsp;</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>J61196. AP</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PKH 26</td><td>MCE</td><td>154214-55-8</td><td>Czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania EVs</td></tr><tr><td>Alginian sodu (Alg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0682-100G</td><td>Naturalny polisacharyd pochodzący z brązowych wodorostów.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>Art-Nr-P029.1</td><td>Preparat buforowy&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro BM Mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>Thermofisher</td><td>A1382901</td><td>Mezenchymalne komórki macierzyste</td></tr><tr><td>StemPro MSC SFM XenoFree</td><td>Thermofisher</td><td>A1067501</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%</td><td>Thermofisher</td><td>25050014</td><td>Dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>Vortex-Mixer</td><td>Daihan Scientific</td><td>VM-10</td><td>Służy do mieszania buforu strącającego z kondycjonowaną pożywką</td></tr></tbody></table>

optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3d rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

Optimizing Extracellular Vesicle Delivery Using a Core-Sheath 3D-Bioprinted Scaffold for Chronic Wound Management

To badanie przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania rusztowań z 3D-biodrukowanymi w celu przyspieszenia gojenia się przewlekłych ran. Protokół polega na izolowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), znanych ze swoich właściwości regeneracyjnych i immunomodulujących. Te pojazdy elektryczne są następnie włączane w unikalną konstrukcję rusztowania. Rusztowanie posiada rdzeń złożony z alginianu załadowanego EV, otoczony osłoną wykonaną z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Ta innowacyjna konstrukcja zapewnia kontrolowaną degradację rusztowania, jednocześnie sprzyjając wydajnemu i kontrolowanemu uwalnianiu EV w miejscu rany. Protokół obejmuje kluczowe kroki, w tym przygotowanie i charakterystykę pojazdów elektrycznych, formułowanie biotuszy do biodruku 3D oraz optymalizację parametrów drukowania w celu osiągnięcia pożądanej architektury rdzeń-osłona. Łącząc integralność strukturalną i bioaktywność, rusztowanie ma na celu wyeliminowanie ograniczeń konwencjonalnych opatrunków na rany, oferując ukierunkowane podejście do przyspieszenia regeneracji tkanek i zmniejszenia stanu zapalnego w ranach przewlekłych. Metoda ta zapewnia powtarzalną i skalowalną strategię opracowywania zaawansowanych biomateriałów o potencjalnych zastosowaniach klinicznych w leczeniu ran przewlekłych. W protokole podkreślono również kluczowe kwestie związane z osiąganiem spójnych wyników, zapewniając zdolność adaptacji do przyszłych zastosowań terapeutycznych.

Uwalnianie in vivo EV z rusztowań Alg-EVs/CMCh oraz Alg-EVs/CMCh-AlgLyase przedstawiono na Rysunku 1B,C. Zgodnie z oczekiwaniami, rusztowanie Alg-EVs/CMCh-AlgLyase wykazało szybszy profil uwalniania w porównaniu do Alg-EVs/CMCh, szczególnie w punktach czasowych 2 h i 4 h. Uwalnianie EV z hydrożeli jest regulowane przez kombinację mechanizmów fizykochemicznych, w tym dyfuzję, pęcznienie, erozję i degradację20. Dzięki wykorzystaniu AlgLyase, ru...

To badanie przedstawia protokół wytwarzania rusztowań drukowanych biologicznie w 3D do przewlekłego gojenia ran. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane z mezenchymalnych komórek macierzystych i ładowane do rdzenia (alginianu) za pomocą osłonki wykonanej z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Taka konstrukcja umożliwia kontrolowaną degradację rusztowania i wydajne uwalnianie pojazdów elektrycznych.

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

This study outlines a detailed protocol for the fabrication of core-sheath 3D-bioprinted scaffolds designed to enhance chronic wound healing. The protocol ...

Zakres badań ma na celu opracowanie zaawansowanego bioaktywnego opatrunku na rany do skutecznego leczenia ran przewlekłych. Rusztowanie zapewni kontrolę, degradację i skuteczne miejscowe dostarczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Obecny protokół ma na celu przezwyciężenie ograniczeń konwencjonalnego opatrunku ran w leczeniu przewlekłego stanu zapalnego. W szczególności brak kontroli, degradacja i terminowe uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Protokół ten oferuje podejście Tuneable do dostarczania środków terapeutycznych, w tym genów, w odpowiednim czasie do różnych zastosowań.Wszystkie wyniki dostarczają nowych informacji na temat dostosowywania rusztowania do różnych typów ran i ulepszania terapii regeneracyjnych poprzez ładowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych określonymi cząsteczkami bioaktywnymi.Nasze laboratorium zamierza zbudować translacyjną platformę badawczą zajmującą się gojeniem się ran cukrzycowych.[Narrator] Na początek szybko rozmrozić fiolkę z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć fiolkę, gdy pozostanie mały fragment lodu. Przenieść całą zawartość fiolki z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej kompletne podłoże. Odwirować komórki w stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki. Następnie przenieść komórki do kolby T25 zawierającej cztery mililitry kompletnego podłoża. Delikatnie przechylić kolbę T25, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70% do 80%, odessać zużyte podłoże z kolby T25. Dodaj trzy mililitry świeżego PBS do kolby, aby usunąć wszelkie pozostałości komórek. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% roztworu trypsyny do kolby i inkubować. Monitoruj odklejanie komórek pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Teraz dodać cztery mililitry wstępnie ciepłej, kompletnej pożywki do kolby i pipetować w górę iw dół po powierzchni, aż do oderwania. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej wirówki dwie. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym podłożu i policzyć komórki. Następnie przenieś komórki do kolby T75 o gęstości wysiewu 5,000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubować kolbę T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 72 godzinach zbierz kondycjonowaną pożywkę z komórek w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV, odwiruj 13 mililitrów zebranej kondycjonowanej pożywki o stężeniu 800 G przez 15 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Użyj filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra, aby przefiltrować supernatant i usunąć duże cząstki. Teraz dodaj pięć mililitrów buforu opadowego do przefiltrowanej pożywki kondycjonowanej. Dokładnie wymieszaj mieszaninę, aby upewnić się, że jest jednorodna. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wytrącenie się pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 3,220 G przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Upewnij się, że rurki są wyważone. Ostrożnie wyrzucić sklarat bez naruszania osadu i ponownie odwirować przez pięć sekund. Teraz delikatnie ponownie zawiesza granulat EV w 200 mikrolitrach PBS, aby uniknąć uszkodzenia pęcherzyków. Wykonaj western blotting, aby wykryć markery specyficzne dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w tym CD63, CD81 i CD9. Przygotuj świeży 4,5% roztwór alginianu sodu w sterylnej ultraczystej wodzie. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Następnie rozpuść karboksymetylocelulozę w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać 3,8% roztwór. Odwirować przygotowane atramenty biologiczne o stężeniu 3 220 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pęcherzyki, które mogą zakłócać proces drukowania. Teraz użyj miksera strzykawkowego i wymieszaj trzy mililitry przygotowanego roztworu alginianu sodu z oznaczonymi EV lub kontrolą Dialymmi. Delikatnie dobrze wymieszaj, aby zapewnić jednolitą zawiesinę. Użyj innego mieszalnika strzykawkowego, aby połączyć jeden mililitr karboksymetylocelulozy ze świeżo przygotowanym roztworem lyazy alginianowej w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mili jednostki na mililitr. Jednocześnie załaduj biotusz EV z alginianu sodu do części rdzenia, a biotusz z alginianu karboksymetylocelulozy do części osłonowej zestawu strzykawki. Uruchom oprogramowanie drukarki biologicznej 3D. Wybierz kształt cylindryczny z ukośnym wzorem wypełnienia, aby utworzyć konstrukcję rusztowania. Ustaw średnicę cylindra na 20 milimetrów, a wysokość na 1,1 milimetra. Skonfiguruj rozmiar porów na jeden milimetr. Ustaw prędkość pompowania dyszy rdzenia i osłony na jeden milimetr na sekundę przy grubości 0,25 milimetra na warstwę. Skonfiguruj prędkość ruchu do sześciu milimetrów na sekundę i wydrukuj cztery warstwy w temperaturze pokojowej. Użyj nawilżacza z chlorkiem wapnia w aerozolu, aby usieciować rusztowanie podczas procesu wytłaczania. Rozpocznij drukowanie rusztowania na folii poliestrowej. Umieść dyszę nawilżacza w odległości około 20 centymetrów od głowicy wytłaczającej, aby zapewnić skuteczne sieciowanie. Zanurz rusztowanie w 2,2% roztworze chlorku wapnia na 10 minut, aby zakończyć sieciowanie. Opłucz rusztowanie trzykrotnie sterylną ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia i niezwiązanego biotuszu. Ogol skórę grzbietową znieczulonej myszy dla diabetyków OCTA za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia, unikając podrażnień lub obrażeń skóry. Teraz utwórz sześciomilimetrową okrągłą ranę skórną o pełnej grubości na grzbietowej powierzchni każdej myszy. Delikatnie umieść rusztowanie 3D Bioprinted zawierające pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oznaczone PKH na łożysku rany. Upewnij się, że rusztowanie całkowicie zakrywa powierzchnię rany i lekko dociśnij sterylnymi kleszkami, aby zminimalizować kieszenie powietrzne. Przenieś znieczulone myszy do systemu obrazowania IVIS po dwóch, czterech godzinach, ośmiu godzinach i 24 godzinach po implantacji. W kreatorze obrazowania należy wybrać opcję obrazowania fluorescencyjnego i aktywować filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika PKH. Dostosuj ustawienia kamery, w tym pole view i wysokość obiektu, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału. Rozpocznij pobieranie obrazów, zapisz wynikowe dane. Następnie zwolnij sygnały fluorescencyjne z oznaczonych EV. EV alginianowe w rusztowaniu liazy alginianowej karboksymetylocelulozy wykazywały szybszy profil uwalniania w porównaniu z EV alginianu w samej karboksymetylocelulozie, szczególnie w dwu- i czterogodzinnych punktach czasowych.

optimizing-extracellular-vesicle-delivery-using-core-sheath-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

W tym manuskrypcie demonstrujemy przygotowanie biohybrydowego hydrożelowego biotuszu zawierającego grafen do użycia w inżynierii tkanek obwodowych. Za pomocą tego biohybrydowego materiału 3D przeprowadzany jest protokół różnicowania neuronalnego komórek macierzystych. Może to być ważny krok w kierunku wprowadzenia podobnych biomateriałów do kliniki.

Przygotowanie i charakterystyka biohybrydowego biotuszu hydrożelowego 3D na bazie grafenu do neuroinżynierii obwodowej

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Poznaj metodę biodrukowania 3D rusztowań z rdzeniem i osłonką do kontrolowanego uwalniania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w leczeniu ran przewlekłych. Protokół poprawia skuteczność terapii regeneracyjnych.

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

Przeglądaj więcej filmów