Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

Zakres badań ma na celu opracowanie zaawansowanego bioaktywnego opatrunku na rany do skutecznego leczenia ran przewlekłych. Rusztowanie zapewni kontrolę, degradację i skuteczne miejscowe dostarczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Obecny protokół ma na celu przezwyciężenie ograniczeń konwencjonalnego opatrunku ran w leczeniu przewlekłego stanu zapalnego. W szczególności brak kontroli, degradacja i terminowe uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Protokół ten oferuje podejście Tuneable do dostarczania środków terapeutycznych, w tym genów, w odpowiednim czasie do różnych zastosowań.

Wszystkie wyniki dostarczają nowych informacji na temat dostosowywania rusztowania do różnych typów ran i ulepszania terapii regeneracyjnych poprzez ładowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych określonymi cząsteczkami bioaktywnymi.

Nasze laboratorium zamierza zbudować translacyjną platformę badawczą zajmującą się gojeniem się ran cukrzycowych.

[Narrator] Na początek szybko rozmrozić fiolkę z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjąć fiolkę, gdy pozostanie mały fragment lodu. Przenieść całą zawartość fiolki z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej kompletne podłoże. Odwirować komórki w stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki. Następnie przenieść komórki do kolby T25 zawierającej cztery mililitry kompletnego podłoża. Delikatnie przechylić kolbę T25, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70% do 80%, odessać zużyte podłoże z kolby T25. Dodaj trzy mililitry świeżego PBS do kolby, aby usunąć wszelkie pozostałości komórek. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% roztworu trypsyny do kolby i inkubować. Monitoruj odklejanie komórek pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu. Teraz dodać cztery mililitry wstępnie ciepłej, kompletnej pożywki do kolby i pipetować w górę iw dół po powierzchni, aż do oderwania. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej wirówki dwie. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym podłożu i policzyć komórki. Następnie przenieś komórki do kolby T75 o gęstości wysiewu 5,000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubować kolbę T75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 72 godzinach zbierz kondycjonowaną pożywkę z komórek w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV, odwiruj 13 mililitrów zebranej kondycjonowanej pożywki o stężeniu 800 G przez 15 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Użyj filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra, aby przefiltrować supernatant i usunąć duże cząstki. Teraz dodaj pięć mililitrów buforu opadowego do przefiltrowanej pożywki kondycjonowanej. Dokładnie wymieszaj mieszaninę, aby upewnić się, że jest jednorodna. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wytrącenie się pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 3,220 G przez 30 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Upewnij się, że rurki są wyważone. Ostrożnie wyrzucić sklarat bez naruszania osadu i ponownie odwirować przez pięć sekund. Teraz delikatnie ponownie zawiesza granulat EV w 200 mikrolitrach PBS, aby uniknąć uszkodzenia pęcherzyków. Wykonaj western blotting, aby wykryć markery specyficzne dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w tym CD63, CD81 i CD9. Przygotuj świeży 4,5% roztwór alginianu sodu w sterylnej ultraczystej wodzie. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Następnie rozpuść karboksymetylocelulozę w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać 3,8% roztwór. Odwirować przygotowane atramenty biologiczne o stężeniu 3 220 G przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby usunąć pęcherzyki, które mogą zakłócać proces drukowania. Teraz użyj miksera strzykawkowego i wymieszaj trzy mililitry przygotowanego roztworu alginianu sodu z oznaczonymi EV lub kontrolą Dialymmi. Delikatnie dobrze wymieszaj, aby zapewnić jednolitą zawiesinę. Użyj innego mieszalnika strzykawkowego, aby połączyć jeden mililitr karboksymetylocelulozy ze świeżo przygotowanym roztworem lyazy alginianowej w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mili jednostki na mililitr. Jednocześnie załaduj biotusz EV z alginianu sodu do części rdzenia, a biotusz z alginianu karboksymetylocelulozy do części osłonowej zestawu strzykawki. Uruchom oprogramowanie drukarki biologicznej 3D. Wybierz kształt cylindryczny z ukośnym wzorem wypełnienia, aby utworzyć konstrukcję rusztowania. Ustaw średnicę cylindra na 20 milimetrów, a wysokość na 1,1 milimetra. Skonfiguruj rozmiar porów na jeden milimetr. Ustaw prędkość pompowania dyszy rdzenia i osłony na jeden milimetr na sekundę przy grubości 0,25 milimetra na warstwę. Skonfiguruj prędkość ruchu do sześciu milimetrów na sekundę i wydrukuj cztery warstwy w temperaturze pokojowej. Użyj nawilżacza z chlorkiem wapnia w aerozolu, aby usieciować rusztowanie podczas procesu wytłaczania. Rozpocznij drukowanie rusztowania na folii poliestrowej. Umieść dyszę nawilżacza w odległości około 20 centymetrów od głowicy wytłaczającej, aby zapewnić skuteczne sieciowanie. Zanurz rusztowanie w 2,2% roztworze chlorku wapnia na 10 minut, aby zakończyć sieciowanie. Opłucz rusztowanie trzykrotnie sterylną ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia i niezwiązanego biotuszu. Ogol skórę grzbietową znieczulonej myszy dla diabetyków OCTA za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia, unikając podrażnień lub obrażeń skóry. Teraz utwórz sześciomilimetrową okrągłą ranę skórną o pełnej grubości na grzbietowej powierzchni każdej myszy. Delikatnie umieść rusztowanie 3D Bioprinted zawierające pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oznaczone PKH na łożysku rany. Upewnij się, że rusztowanie całkowicie zakrywa powierzchnię rany i lekko dociśnij sterylnymi kleszkami, aby zminimalizować kieszenie powietrzne. Przenieś znieczulone myszy do systemu obrazowania IVIS po dwóch, czterech godzinach, ośmiu godzinach i 24 godzinach po implantacji. W kreatorze obrazowania należy wybrać opcję obrazowania fluorescencyjnego i aktywować filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika PKH. Dostosuj ustawienia kamery, w tym pole view i wysokość obiektu, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału. Rozpocznij pobieranie obrazów, zapisz wynikowe dane. Następnie zwolnij sygnały fluorescencyjne z oznaczonych EV. EV alginianowe w rusztowaniu liazy alginianowej karboksymetylocelulozy wykazywały szybszy profil uwalniania w porównaniu z EV alginianu w samej karboksymetylocelulozie, szczególnie w dwu- i czterogodzinnych punktach czasowych.