Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

Moje badania koncentrują się na uzyskaniu krytycznych informacji potwierdzających amyloid beta 1-40, gdy jest on absorbowany przez powierzchnię nanocząstek złota i zachodzi w odwracalnym procesie agregacji. Wyzwaniem, przed którym stoimy w tej dziedzinie badawczej, jest uzyskanie informacji termicznej, chemicznej i dynamicznej o procesie agregacji odwrotnej. Wspaniałym odkryciem tego projektu jest to, że jesteśmy w stanie zidentyfikować konkretny tryb ruchu lub wibracji przyczyniający się do potwierdzenia potwierdzenia obecności amyloidu beta 1-40, gdy są one absorbowane przez powierzchnię nanocząstek złota.

Ogromną zaletą stosowania SERS (powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii rozpraszania Ramana) jest wykrywanie bardzo małych, słabych sygnałów rozpraszania w celu zidentyfikowania trybu, który jest krytyczny dla spowodowania fałdowania i rozwijania. Jednocześnie jesteśmy w stanie określić morfologię agregatów. Odkrycia, które jesteśmy w stanie uzyskać w ramach tego projektu, to kluczowa interakcja białko-białko, która będzie ważna dla wywołania oligomeru i która doprowadzi do fibrogenezy.

Na początek za pomocą mikropipety dodaj jeden mililitr destylowanej wody dejonizowanej do jednego miligrama liofilizowanego beta-amyloidu lub A beta 1-40. Mieszaj roztwór za pomocą mieszadła wirowego przez około 30 sekund. Upewnij się, że w roztworze w temperaturze pokojowej, około 20 stopni Celsjusza, nie pozostały żadne cząstki stałe.

Następnie przygotuj roztwory podstawowe peptydów, używając wody dejonizowanej i destylowanej. Określić stężenie peptydu, mierząc spektroskopowo absorpcję tyrozyny przy 275 nanometrach. Roztwory podstawowe A beta 1-40 należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Rozmrozić podstawowy roztwór peptydowy około pięć minut przed zebraniem danych. W 15-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj osiem mikrolitrów roztworu peptydu z 800 mikrolitrami koloidalnych cząstek złota. Dodaj 4,2 mililitra dejonizowanej wody destylowanej, a następnie wiruj próbkę przez 10 sekund.

Ustal stężenie peptydów A beta 1-40 na 1,8 nanomola i dostosuj stosunek peptydów do złotych cząstek koloidalnych w określonym zakresie. Korzystając z jednostki sterującej temperaturą spektrofotometru UV w zakresie widzialnym, ustaw roztwór na temperaturę pokojową, około 22 stopnie Celsjusza. Monitorować początkowe pH roztworu próbki za pomocą pH-metru i dostosować je do wartości nieco poniżej pH siedem.

Zbierz widmo absorpcyjne w zakresie od 400 do 800 nanometrów. Następnie dostosuj pH próbki do około pH cztery, dodając 1,0 mikrolitra z przyrostem 1,0 molowego kwasu solnego. Zbierz widmo absorpcyjne w tym samym zakresie od 400 do 800 nanometrów.

Następnie dostosuj pH próbki do około 10 pH, dodając około 1,5 mikrolitra przyrostu 1,0 molowego wodorotlenku sodu. Zbierz widmo absorpcyjne w tym samym zakresie długości fal od 400 do 800 nanometrów. Następnie zmień pH między pH 4 a pH 10 10 razy, dodając kwas solny lub wodorotlenek sodu.

Stale zbieraj widmo absorpcyjne w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Uzyskaj zestaw danych ASCII długości fal w funkcji absorbancji. Użyj programu PeakFit, aby wyodrębnić średnie pozycje pików pasma.

Korzystając z funkcji wykresu, wykreśl zestaw danych, aby zobrazować gęstość optyczną w funkcji długości fali. Zidentyfikuj i oznacz początkowe szczytowe długości fal, lambda jeden i lambda dwa, wybierając ich przybliżone pozycje na wykreślonych danych. Dopasuj dane za pomocą funkcji dopasowania szczytowego programu początkowego.

Uzyskaj wykres przedstawiający centralne pozycje pików dla każdej lambdy oznaczonej jako XCI, wraz z odpowiadającymi jej obszarami pasma, oznaczonymi jako AI. Eksportuj wyodrębnione pozycje szczytowe i odpowiadające im obszary do programu arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Oblicz współczynnik wagowy, AI, dla każdego środka piku, porównując obszar pasma z całkowitym obszarem całych pasm przy użyciu wyświetlonego wzoru. Następnie wyodrębnij średnią pozycję szczytu, korzystając z równania wyświetlanego na ekranie.

Aby wygenerować wykres odwracalności, należy sporządzić tabelę średnich pozycji pików w funkcji numeru operacji N. Przypisz operację o numerze N, jak podano na ekranie. Przeanalizuj pozycję piku w N przy użyciu wyświetlonego wzoru. Przenieś obliczony zestaw danych do oprogramowania źródłowego i wykreśl go.

Wybierz nieliniowe dopasowanie krzywej do analizy, wprowadź wartości początkowe dla A, B, C, D i E, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zakończyć proces dopasowywania krzywej. Aby przeprowadzić obrazowanie ramanowskie, dla każdej próbki w operacji numer N umieścić 100 mikrolitrów roztworu na krążku mikowym o średnicy jednego centymetra. Pozostaw próbki do wyschnięcia na noc przed pomiarem.

Następnie zbierz obrazy światła białego dla każdej operacji o numerze N. Przygotuj oddzielną próbkę na nowym krążku miki, ponieważ pH jest stale zmieniane w zakresie od 4 do 10. Zbierz obraz Ramana dla każdego numeru operacji i korzystając z wymienionych specyfikacji lasera o długości fali 633 nanometrów. Przechwytuj obrazy w siatce o wymiarach 100 na 100 pikseli z określonym czasem integracji, skupiając się na żądanym obszarze widmowym.

Wykreślić reprezentatywne widmo dla każdej operacji o numerze N wyrównane jako funkcja N. Skonstruuj trójwymiarową spektroskopię Ramana wzmocnioną powierzchniowo lub widmo SERS jako funkcję N dla złota o grubości 20 nanometrów pokrytego beta 1-40. Wykorzystaj widok widma z góry jako mapę konturową, aby wyodrębnić określone tryby związane z określonym stanem pH. Identyfikuj cechy spektralne ulepszone wyłącznie przy parzystych lub nieparzystych numerach operacji.

Pasmo SPR nanocząstek złota pokrytych A beta 1-40 przesunęło się z 530 nanometrów do około 650 nanometrów, gdy roztwór stał się bardziej kwaśny. Odpowiadało to tworzeniu się złotych agregatów koloidalnych z rozwiniętymi monomerami A beta 1-40, jak zaobserwowano przez TEM. Widoczna była również zależna od pH zmiana koloru złota pokrytego A beta 1-40.

Odwracalne, zależne od pH przesunięcie średniego pasma osiągało szczyt między krótszą a dłuższą długością fali, a naprzemienna morfologia rozproszona i zagregowana obserwowana w TEM potwierdziła quasi-odwracalny charakter procesu. Obrazowanie w świetle białym wykazało wyraźny, odwracalny wzór agregacji odpowiadający zmianom pH, podczas gdy widma SERS wykazywały subtelne zmiany zależne od pH w obszarze odcisku palca.