Name: Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę badania odwracalnej agregacji peptydu Aβ 1-40 na powierzchni nanocząstek złota przy użyciu spektroskopii SERS. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych trybów wibracyjnych wpływających na składanie białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.Y. jest wspierany przez NSF-MRI Grant #2117780. Fundacja Geneseo wsparła początkowy etap tego projektu. A. I. jest wdzięczna absolwentom Wydziału Chemii SUNY Geneseo Summer Research Scholarship ('19 Rhodes Award i '20 Lipkowitz Award) oraz Dreyfus Foundation Undergraduate Summer Research Scholarship za ich wsparcie.

1. Przygotowanie nanocząsteczek złota powlekanych Aβ1-40
<ol>
	<li>Za pomocą igły strzykawki dodaj 1 mL destylowanej wody dejonizowanej do 1 mg liofilizowanego Aβ1-40 (MW: 4,2 kDa, czystość HPLC 98%). Mieszaj roztwór w wirówce vortex przez około 30 s i upewnij się, że w roztworze w temperaturze pokojowej (RT; ~20 °C) nie obserwuje się żadnych cząstek stałych.
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie roztwory zapasowe, używając wody dejonizowanej i destylowanej (~18 MΩ·cm).</li>
		<li>Określ stężenie spektroskopowo, wykorzystując absorpcję tyrozyny przy 275 nm32, dla której współczynnik ekstynkcji molowej ε275 wynosi 1390 cm-1·M-1.</li>
		<li>Przechowuj roztwory zapasowe Aβ1-40 w temperaturze -80 °C. (Patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o produktach handlowych Aβ1-40.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmroź roztwór zapasowy peptydów około 5 min przed rozpoczęciem gromadzenia danych. W probówce wirówkowej o pojemności 15 mL wymieszaj 8 μL roztworu peptydów z 800 μL koloidalnego złota. Dodaj 4,2 mL destylowanej wody dejonizowanej, a następnie wymieszaj próbkę w wirówce vortex przez 10 s30,31,33,34.</li>
	<li>Ustal stężenie peptydów Aβ1-40 na poziomie 1,8 nmol i dostosuj stosunek peptydów Aβ1-40. Liczba koloidów złota powinna mieścić się w zakresie od ~500:1 do ~2000:125.</li>
</ol>
2. Iteracyjna zmiana pH i monitorowanie odpowiadającego przesunięcia pasma SPR
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę roztworu na określoną wartość (np. 25 °C) za pomocą modułu kontroli temperatury spektrofotometru UV-Vis-NIR (ultrafioletowego, widzialnego i bliskiej podczerwieni).</li>
	<li>Zmonitoruj początkowe pH roztworu próbki za pomocą pH-metru i ustaw je na wartość nieco poniżej pH 7. Zarejestruj widmo absorpcyjne w zakresie od 400 nm do 1000 nm.</li>
	<li>Zmień pH próbki na ~pH 4 (tj. pH 4,0 ± 0,3), dodając objętości 10 μL 0,1 M HCl, a następnie zarejestruj widmo absorpcyjne w zakresie od 400 nm do 1000 nm.</li>
	<li>Zmień pH próbki na ~pH 10 (tj. pH 10 ± 0,3), dodając objętości 10 μL 0,1 M NaOH, a następnie zarejestruj widmo absorpcyjne w zakresie od 400 nm do 1000 nm.</li>
	<li>Zmieniaj pH między pH 4 a pH 10 za pomocą HCl i NaOH 10 razy, rejestrując widmo absorpcyjne w sposób ciągły w temperaturze 25 ± 0,2 °C29,30. 
	UWAGA: Dla wszystkich roztworów próbek gęstość optyczna maksimum pasma SPR była utrzymywana na poziomie około 0,2. Przewiduje się wystąpienie efektu buforowego ze względu na pozostałą w roztworze sól buforową. W związku z tym końcową wartość pH określano po potwierdzeniu stanu równowagi. Wartość pH mierzono bezpośrednio w kuwecie pomiarowej za pomocą mikroelektrody pH o dokładności ±0,005 pH.</li>
	<li>Pobierz zestaw danych w formacie ASCII zawierający długości fal jako funkcję absorbancji. Wyznacz średnią pozycję maksimów pasm za pomocą programu Peak Fit.
	<ol>
		<li>Wykreśl zestaw danych, aby zobrazować gęstość optyczną jako funkcję długości fali (nm), korzystając z funkcji Plot.</li>
		<li>Zaznacz początkowe długości fal maksimów λ1, λ2 i λ3, wybierając ich przybliżone pozycje na wykreślonych danych, a następnie dopasuj dane za pomocą funkcji RUN.</li>
		<li>Uzyskaj wykres zawierający centralny szczyt dla każdego z nich (λi), XCi, wraz z powierzchnią każdego pasma (Ai).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj wyznaczone pozycje i powierzchnie maksimów do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią pozycję maksimum dla danego pH.
	<ol>
		<li>Wyznacz czynnik wagowy ai dla każdego centrum maksimum λi, porównując powierzchnię pasma (Ai) do całkowitej powierzchni wszystkich pasm według wzoru: <img alt="Wzór obliczania równowagi, $ a_i = A_i/\Sigma_j A_j $, równanie analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">.</li>
		<li>Wyznacz średnią pozycję maksimum, <img alt="Symbol λ_peak; schemat identyfikacji optycznej długości fali maksimum, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> (pH) korzystając z równania (1). 
		<img alt="Wzór spektroskopowy λ_peak(pH)=Σa_i(pH)λ_i(pH), stosowany w analizie widmowej zależnej od pH." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">   (1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj wykres odwracalności zgodnie z poniższą procedurą:
	<ol>
		<li>Zestaw w tabeli średnie pozycje maksimów, <img alt="Symbol λ_peak; schemat identyfikacji optycznej długości fali maksimum, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">, jako funkcję numeru każdej „operacji”, n, jako <img alt="Symbol λ_peak; schemat identyfikacji optycznej długości fali maksimum, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> vs. n. Przyjmij numer operacji n = 1 dla próbki przed dodaniem kwasu przy ~pH 7. Zwiększaj numer operacji o 1 przy każdej zmianie pH na ~pH 4 za pomocą HCl lub na ~pH 10 za pomocą NaOH. Przyjmij n parzyste dla warunków kwasowych (tj. ~pH 4) i n nieparzyste dla warunków zasadowych (tj. pH 10).</li>
		<li>Przeanalizuj pozycję maksimum dla każdego n, <img alt="Symbol λ_peak; schemat identyfikacji optycznej długości fali maksimum, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> (n) = λ(n), korzystając ze wzoru30 
		<img alt="Wzór matematyczny, λ(n)=A+B(n-1)^C+De^(n-1)^E cos(nπ), równanie, modelowanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4">    (2) 
		UWAGA: Początkową średnią pozycję maksimum dla n = 1 reprezentuje A. Parametry B i C wyrażają przesunięcie pozycji maksimum zależne od n. Parametr D stanowi amplitudę czynnika tłumienia E powtórzeń. Użyj funkcji sinus, aby zobrazować oscylację pozycji maksimum jako funkcję n.</li>
		<li>Przenieś zestaw danych (x, y) do oprogramowania Origin i wykonaj wykres.</li>
		<li>Utwórz funkcję Customized zdefiniowaną w równaniu (2) w sekcji Nonlinear Curve Fitting Function Of Analysis. Wpisz początkowe wartości A, B, C, D i E, a następnie kliknij RUN, aby zakończyć dopasowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie TEM
	<ol>
		<li>Przygotuj próbki TEM z koloidów złota o rozmiarze 20 nm powlekanych Aβ1-40 na miedzianych siatkach powlekanych Formvarem. Zbadaj próbki za pomocą TEM pracującego przy napięciu 80 kV.</li>
		<li>Wykonaj zdjęcia przy nominalnym powiększeniu 28 000x lub 71 000x za pomocą 4-megapikselowej cyfrowej kamery CCD model XR-40 (AMT). Wykonaj zdjęcia TEM dla złota 20 nm powlekanego Aβ1-40 dla każdego numeru operacji n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 i 10 (pH 4) oraz n = 3, 5, 7 i 9 (pH 10).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie Ramanowskie i badanie odwracalnej agregacji
<ol>
	<li>Nanieś 100 μL roztworu na dysk mikowy (średnica 1 cm) dla każdej próbki przy numerze operacji n. Próbki suszyć przez noc przed dokonaniem pomiaru.</li>
	<li>Wykonaj obrazy w świetle białym dla każdego numeru operacji n. Przygotuj osobne próbki na dyskach mikowych, zmieniając sukcesywnie pH w zakresie od ~pH 4 do ~pH 10 dla każdego numeru operacji n (Rysunek 3).</li>
	<li>Wykonaj obraz Ramanowski dla każdego numeru operacji n przy użyciu lasera o długości fali λ = 633 nm i mocy 0,5 ± 0,05 mW, z rozdzielczością przestrzenną ~0,43 μm w siatce o wymiarach 100 × 100 pikseli, przy czasie całkowania 500 ms/spektrum dla zakresu między ~200 cm-1 a ~2 800 cm-1 (Rysunek 4).</li>
	<li>Wykreśl reprezentatywne widma dla każdego n w funkcji n i skonstruuj trójwymiarowe widmo SERS w funkcji n dla 20 nm złota powleczonego Aβ1-40 (Rysunek 5A). Wykorzystaj widok z góry trójwymiarowego widma SERS jako mapę konturową (Rysunek 5B), aby wyodrębnić konkretne mody związane z określonymi warunkami pH (tj. ~pH 4 i ~pH 10). Wyodręb wszystkie cechy spektralne wzmocnione wyłącznie dla nparzystych lub wyłącznie dla nnieparzystych.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów w związku z tą pracą, aby ujawnić.

Kluczową kwestią w badaniach konformacji peptydów jest utrzymanie próbki, ponieważ próbki ulegną pogorszeniu, jeśli będą niewłaściwie przechowywane. Próbki peptydów otrzymano w postaci liofilizowanej i zaczęły się denaturować po ponownym uwodnieniu destylowaną wodą dejonizowaną, nawet gdy były przechowywane w temperaturze -80 °C. Czystość koloidów złota została zweryfikowana za pomocą analizy kontroli jakości. W celu utrzymania stabilności koloidów przechowywano je w temperaturze 4 °C i nie zamrażano. Roztwory koloidu złota były przygotowywane świeże do każdego eksperymentu, ponieważ roztwór buforowy soli destabilizowałby koloid złota. Roztwory HCl i NaOH przygotowywano świeże dla każdego eksperymentu.
Wyzwania techniczne związane z ręcznym odczytem i zapisem pH roztworu za pomocą delikatnych przyrządów przy jednoczesnej zmianie pH w zakresie od 4 do 10 ograniczają precyzję raportowanych przez nas wyników. W związku z tym nie zaobserwowaliśmy spójnych wyników w natężeniu sygnałów SERS. To prawdopodobnie wprowadziło błąd do amplitudy, która została użyta dla wykresu konturowego. Przyszłe prace mające na celu weryfikację modów związanych z nparzystymi lub nnieparzystymi mogą wprowadzić mutacje w celu zastąpienia aminokwasów w sekwencji Aβ 1-40, które, jak twierdzimy, są zaangażowane w zmianę konformacyjną białka, takie jak pojedyncze reszty tyrozyny lub asparaginy.
"Oddziaływanie między monomerem Aβ1-40 a powierzchnią złota uważa się za oddziaływanie dipolowe, a poziom wiązań wodorowych został postawiony w pracy przez H. Schmidbauera i wsp.55. W osobnej pracy badaliśmy spektroskopię SERS w funkcji ilości Aβ1-40 w warunkach kwaśnych, wyekstrahowano tworzenie adsorpcji zależnej od nanowielkości56. W przypadku złota o długości 20 nm spekulowano, że wiązanie C=C lub -C-N histydyny (His) inicjuje adsorpcję; Jednak w przypadku złota o długości fali 80 nm tryb oddychania pierścieniem benzenowym fenyloalaniny (Phe) lub tyrozyny (Tyr) dociera do powierzchni złota w celu zainicjowania adsorpcji. Uznano, że proces adsorpcji Aβ1-40 na powierzchni złota w warunkach obojętnych lub zasadowych (pH ~ 10) utrzymuje hydrofilowy koloid złota pokryty Aβ1-40 , ponieważ w stanie wodnym nie powstają żadne osady. Jednak osady obserwowano przy pH 4, co sugeruje, że agregaty były hydrofobowe.
Obrazy TEM i obrazy w świetle białym tylko pośrednio pokazują dowody agregacji. Podjęliśmy próbę przeprowadzenia spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) w celu skorelowania morfologii obserwowanej w odwracalnej agregacji ze strukturami drugorzędowymi. Jednak rozpraszające się linie bazowe uniemożliwiły nam uzyskanie powtarzalnych sygnałów CD. Zamiast tego zastosowaliśmy spektroskopię Ramana, skupiając się bardziej na modach wzmocnionych albo gdy agregacja (rozłożona konformacja Aβ1-40) zachodziła pod pH ~4, albo gdy dezagregacja (rozwinięta konformacja Aβ1-40) pod pH ~10. W związku z tym najlepsze spekulacje na temat identyfikacji struktury drugorzędowej w tej pracy ograniczały się do monitorowania węzłów związanych ze strukturami drugorzędnymi. Wykazano to w obserwacji arkusza β na wysokości 1628 cm-1, szczególnie w warunkach pH 4.
W badaniu tym zaobserwowano tylko zmianę konformacji peptydów dla koloidów złota o średnicy 20 nm i zbadano tylko n do 10. Właściwości konformacji i agregacji peptydu Aβ 1-40 mogą być zmienione przez wielkość cząstki, do której adsorbują się do56. Dlatego potrzebne są dalsze prace, aby zrozumieć właściwości peptydów, które opierają się na połączeniu sieciowym między monomerami oraz tych, na które wpływają właściwości fizyczne powierzchni adsorpcji. W badanych przez nas warunkach tylko koloidy złota o średnicy 20 nm wykazywały odwracalność morfologii agregacji, a mechanizmy wpływu średnicy koloidu na odwracalność tej właściwości nie są znane. Zwiększenie n do 20 może dostarczyć więcej informacji na temat zależnego od modu stopnia odwracalności morfologii agregacji. Badania nad tym, w jaki sposób wielkość koloidu złota wpływa na agregację peptydów beta amyloidu, przyniosą ważne informacje na temat mechanizmów molekularnych patologii choroby Alzheimera.

Fibrylogeneza peptydów beta amyloidu 1-40 (Aβ 1-40) lub 1-42 (Aβ 1-42) została dokładnie zbadana jako kluczowy składnik w tworzeniu blaszek amyloidowych, które są przyczyną choroby Alzheimera1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Kluczowym mechanizmem fibrylogenezy jest oligomeryzacja peptydów Aβ 1-40 lub Aβ 1-42 w celu utworzenia neurotoksycznego agregatu białkowego, a ponadto przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu zrozumienia mechanizmów tworzenia oligomerów 12,13,14. Podjęliśmy podejście polegające na zbadaniu peptydów amyloidogennych tworzących agregaty na powierzchni nano-złota i zidentyfikowaniu czynników, które są odpowiedzialne za tworzenie sieci między peptydami, które znajdują się z dala od powierzchni złota15,16,17,18,19,20,21,22.
Aβ 1-40 przyjmują konformację rozłożoną (A) w warunkach kwaśnych (pH ~4) i konformację fałdowaną (B) w warunkach podstawowych (pH ~10). Zaobserwowaliśmy rozproszone cząstki koloidu złota pokryte Aβ 1-40 o pH ~10 i duże agregaty koloidu złota pokryte Aβ 1-40 o pH ~ 4 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) < klasa sup = "xref" >23,<klasa sup = "xref">24. Rozwinięta konformacja Aβ 1-40 w warunkach kwaśnych sprzyja tworzeniu się sieci peptydów między monomerami Aβ 1-40 na powierzchni złota-nanocząstek, co powoduje tworzenie się agregatów koloidu złota (patrz A w <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1). Gdy monomer Aβ 1-40 utrzymuje złożoną konformację na zasadowym lub obojętnym pH, Aβ 1-40, monomery nie łączą się w agregaty, a powlekane nanocząstki złota pozostają jako pojedyncze rozproszone cząstki (patrz B w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Możemy zatem zbadać proces, w jaki sposób peptydy Aβ 1-40 przechodzą zmiany konformacyjne w sieci i tworzą agregaty, mierząc przesunięcie pasma SPR w zakresie warunków pH25,26,27,28,29,30,31.
Przetestowaliśmy kilka różnych rozmiarów nanocząsteczek złota i stwierdziliśmy, że koloid złota o długości fali 20 nm wykazywał najbardziej widoczny odwracalny proces samoorganizacji monomerów Aβ 1-40 w odpowiedzi na zewnętrzną zmianę pH (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jest to wyraźna wskazówka odwracalnej zmiany w konformacji peptydów, w której warunki kwasowe (A) indukują konformację rozłożoną, wzmacniając sieć i prowadząc do agregacji koloidów złota. Stwierdzono, że podstawowy warunek (B) indukuje pofałdowaną konformację monomerów26,27,28,29,30,31.

<table><tbody><tr><td>Peptyd beta amyloidu 1-40 (A&beta; 1&ndash; 40 peptyd)</td><td>r-peptyd (Bogart, GA, USA)</td><td>A-1156-2</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>CCD AMT</td><td>XR-40 4-megapikselowy CCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Destylowana woda dejonizowana z systemu wodnego Milli-Q- Millipore</td><td>Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka -86 <s>oC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Chilly Willy&nbsp; Identyfikator jednostki serii RLE 187004 numer kompilacji 40.04</td><td></td></tr><tr><td>Złoty koloid (10 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td>15703-20</td><td></td></tr><tr><td>Złoty koloid (100 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td>15711-22</td><td></td></tr><tr><td>Złoty koloid (15 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td>15704-20</td><td></td></tr><tr><td>Złoty koloid (20 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, Stany Zjednoczone)</td><td>15705-20</td> Koloid złota (30 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15706-21 Złoty koloid (40 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15707-21 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złoty koloid (50 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td>15708-21</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Złoty koloid (60 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15709-22 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złoto koloidowe (80 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td>15710-22</td><td></td></tr><tr><td>Najwyższej jakości krążki mikowe V1AFM 10 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>#50</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny roztwór wzorcowy, 1,0 N</td><td>Fluka</td><td>Lot# SHBB4705V&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 318949-2L</td><td></td></tr><tr><td>Makro kwitet kwarcowy Ścieżka światła 10 mm</td><td>Nauka o ognistej muchy&nbsp;</td><td>Type1-MC-PathMikroelektroda pH 10mm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td><td>Model 9618S (MFG nr 9Y8E0050)</td><td></td></tr><tr><td>Peak Fit Program</td><td>Origin (Northampton, MA, USA)</td><td>OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Academic)</td><td></td></tr><tr><td>pH 4,00 Roztwór buforowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Nr kat. 34170-127</td><td></td></tr><tr><td>pH 7,00 Roztwór buforowy&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SB107-4 Lot 191041</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>HORIBA</td><td>Model F-72G (MFG nr B27M0017)</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet &nbsp; Maxi Porady 1&ndash; 5 ml</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>02-707-467</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>02-717-135</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1000 ml</td><td>Fisher</td><td>02-717-156</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1&ndash; 200 ml</td><td>Fisher</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>Pikultarka Fisher Brand Elite 0.5&ndash; 5 ml</td><td></td><td></td> pipeter Fisher QU05317 <td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite 100&ndash; 1000 ml</td><td></td><td></td> pipeter Fisher QU01672 <td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite 10&ndash; 100 ml</td><td>Fisher</td><td>MU10985</td><td></td></tr><tr><td>Pipeter Fisher Brand Elite 1&ndash; 10 ml</td><td>Fisher</td><td>MU08178</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorotlenku sodu 1,0 m</td><td>Fluka</td><td>Lot#05096BPV&nbsp; &nbsp; 319511-2L</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI Co</td><td>Morgagni model 268&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki TempAssure PCR, płaskie nakrętki, naturalne&nbsp;</td><td>USA Naukowy</td><td></td><td>polipropylen. 0,2 ml indywidualne cienkościenne probówki z dołączonymi matowymi płaskimi nasadkami</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis-NIR</td><td>Varian</td><td>CARY 5000 UV1106M074</td><td></td></tr><tr><td>WI Tec alpha300R Konfokalny mikroskop Ramana</td><td>WITec-Oxford Instrument</td><td>XMB3000-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka zależnej od ph odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

Characterization of pH-Dependent Reversible Self-Assembly of Amyloid Beta 1-40-Coated Gold Colloids

Charakterystyka Aβ 1-40 pokrytego powierzchniami nano-złotych koloidalnych cząstek została przeprowadzona przy użyciu spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Obserwowane zależne od pH przesunięcie pasma SPR cząstek złota o długości fali 20 nm pokrytych Aβ 1-40 było skorelowane z naprzemiennością agregacji i dezagregacji obserwowaną na obrazach TEM. pH ~4 indukowało rozwiniętą konformację, a pH ~10 indukowało pofałdowaną konformację Aβ 1-40 na powierzchni złota. Ten odwracalny proces agregacji zaobserwowano za pomocą obrazowania ramanowskiego, gdy pH stopniowo zmieniało się z pH 4 na pH 10. Zaobserwowaliśmy zależną od pH zmianę morfologii Aβ 1-40 na powierzchni złota, gdzie przy pH 4 zaobserwowano klarowne agregaty. Zaobserwowaliśmy jednak bardzo subtelne różnice w widmie spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS) między warunkami pH 4 i pH 10, przy czym najbardziej uderzającą różnicą jest gęstość widmowa w zakresie od 250 cm-1 do 1750 cm-1. W szczególności analiza modalna odwracalnej agregacji wykazała, że agregaty zostały utworzone przez rozwiniętą konformację Aβ 1-40, która obejmowała przekrój pierścienia benzenowego tyrozyny i fenyloalaniny. I odwrotnie, demontaż agregatów był związany ze zmianami konformacyjnymi w fałdowaniu białek Aβ 1-40 z udziałem histydyny, glutaminy, metioniny i kwasu asparaginowego.

Po przyłączeniu Aβ1-40 do powierzchni złotych nanocząsteczek koloidalnych, pasmo SPR w okolicach maksimum absorpcji 530 nm uległo znacznemu przesunięciu w stronę czerwieni do pozycji piku ok. 650 nm po zakwaszeniu roztworu (pH 4)35. Na podstawie obrazów TEM ustaliliśmy, że cechy spektroskopowe obserwowane przy pH 4 odpowiadają tworzeniu się agregatów koloidu złota z prawdopodobnie rozfałdowaną konformacją i sieciowaniem z otaczającymi rozfałdowanymi monomerami Aβ1-40 zaadsorbowanymi na powierzchni złota30. Zaobserwowaliśmy, że monomery Aβ1-40 powracają do konformacji sfałdowanej w warunkach zasadowych (pH 10), co prowadzi do deformacji agregatów w sposób quasi-odwracalny. Proces ten był widoczny poprzez zmianę średniej pozycji piku pasma (<img alt="symbol λ_peak; schemat identyfikacji długości fali piku optycznego, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">(n)), która przesuwała się między krótszą a dłuższą długością fali, a także poprzez różnice w morfologii (rozproszonej vs. zagregowanej) na obrazach TEM pomiędzy warunkami zasadowymi (pH = 10) a kwaśnymi (pH = 4). Wcześniej zaobserwowano, że część monomeru Aβ1-40 pozostaje rozfałdowana nawet po przywróceniu zasadowych warunków roztworu36. Wideo 1 przedstawia zależną od pH zmianę barwy Aβ1-40 oraz gołego koloidu złota o rozmiarze 20 nm.
Dla porównania przeprowadzono badanie wpływu zmian pH na koloid czystego złota o rozmiarze 20 nm (Rysunek 5C i D). W miarę postępu zmian pH zaobserwowano wzrost klasteryzacji koloidów złota, co odnotowano w przesunięciu pasma SPR, obrazach TEM oraz obrazach w świetle białym. Co interesujące, pojawiło się kilka linii widm SERS, zależnie od wartości nnieparzyste oraz nparzyste. Na przykład dla nparzyste (pH ~4) intensywnie obserwowano linię przy 275 cm-1, przypisaną modowi związanemu z Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 lub modowi liganda Au-Cl-38. Z drugiej strony, dla nparzyste, przy 1008 cm-1 zaobserwowano drgania rozciągające C-N39, a przy 1291 cm-1 szeroko obserwowano drgania giętne CH239 oraz deformacje CH240.
W przeciwieństwie do wyraźnej, zależnej od pH i odwracalnej morfologii agregacji zaobserwowanej w obrazowaniu światłem białym, w cechach spektralnych widma SERS pomiędzy nnieparzystym a nparzystym występowały stosunkowo subtelne różnice. W pierwszym przybliżeniu gęstość linii spektralnych w obszarze między 250 cm-1 a 1750 cm-1 była wyższa dla nnieparzystych niż dla nparzystych. Linie spektralne w obszarze linii upadkowych (fingerprint region), 1250 cm-1 i 1750 cm-1 (pasma amidowe I, II i III) dla nnieparzystych wykazywały mniej rozdzielone cechy spektralne, co sugeruje albo poszerzenie, albo wzrost gęstości spektralnej. Na Rysunku 6 mapa konturowa przedstawiona na Rysunku 5B (Rysunek 6B) została zorganizowana z sygnałami SERS przy 761 cm-1 (czerwone) i 1395 cm-1 (niebieskie), reprezentującymi odpowiednio nacisk na nnieparzyste i nparzyste (Rysunek 6C). Jako reprezentatywne widma SERS dla nnieparzystych i nparzystych, u góry przedstawiono widma SERS dla n = 7 (czerwone) i n = 4 (niebieskie) (Rysunek 6A). Aby wykazać zgodność z przesunięciem pasma SPR dla 20 nm złota powlekanego Aβ1-40, z boku przedstawiono wykres przesunięcia pasma z Rysunku 3 (Rysunek 6D).
Choć dysponujemy wstępnymi danymi dotyczącymi pełnej atrybucji obserwowanego widma SERS, odnotowujemy tutaj kilka istotnych cech przesunięcia Ramanowskiego. Linie widmowe (i prawdopodobne przypisania) wzmocnione dla nnieparzystych znajdują się głównie w obszarze poniżej 1000 cm-1: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (przesunięcie NH induolu, drgania rozciągające C-C w Met)39, 974 cm-1 (Glu, drgania rozciągające C-COO- w Asp, moda związana z cytrynianem)39,48,49. Przesunięcie Ramanowskie wzmocnione dla nparzystych wykazało istotne cechy spektroskopowe w obszarze linii fingerprintowych (Amid I, II i III): 1166 cm-1 (deformacja N-H+ w Tyr)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amid III)39,50,51, 1395 cm-1 (symetryczne drgania rozciągające COO- lub drgania nożycowe CH2- CH3- w Glu)39,48, 1585 cm-1 (drgania rozciągające pierścienia CC w Phe, asymetryczne rozciąganie grupy karboksylowej -Au, drgania rozciągające COO- cytrynianu, deformacja pierścienia benzenowego)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, drgania rozciągające C=C w Tyr, drgania rozciągające CC pierścienia w Phe, drgania rozciągające pierścienia benzenowego i COO- w Phe i Tyr oraz asymetryczne rozciąganie OH)39,41,48,50,51 oraz 1628 cm-1 (podpik Amidu I charakterystyczny dla międzycząsteczkowych struktur β-kartek53, C=O oraz sprzężone mody wibracyjne CN/NH szkieletu białkowego pochodzące z struktur typu równoległych β-kartek, akumulacja zagregowanego Aβ54, random coils, β-zwroty, β-spinki)48. Sekwencje pojawiające się dla nnieparzystych lub nparzystych przedstawiono na Rysunku 7. Ogólnie, dla nparzystych, odpowiadających odwracalnej agregacji lub rozfałdowanej konformacji Aβ1-40, w zmianie konformacyjnej peptydy znacząco zaangażowane były: Phe/Tyr zawierające pierścień benzenowy, symetryczne rozciąganie COO-, mody nożycowe CH2- CH3- Glu oraz deformacja -NH+ Tyr. Podczas rozpadu agregatów, który obserwowano, gdy peptydy przyjmowały konformację sfałdowaną odpowiadającą modom dominującym dla nnieparzystych, zaangażowane wydawały się być Glu, Asp, Met, His i Ala.
<img alt="Schemat zwijania białek z widmami absorpcyjnymi (500-800 nm) i obrazami mikroskopowymi do analizy strukturalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Absorbancja i morfologia zależne od pH. Przedstawiono widmo absorpcji przy pH 4 (A) i pH 10 (B) dla nanocząsteczek złota (20 nm) powlekanych Aβ1-40, a także odpowiadające im obrazy TEM, schematy agregacji/dyspersji cząstek oraz zdjęcia roztworów w probówkach. A przedstawia rozfałdowaną konformację monomerów Aβ1-40 w warunkach kwasowych, a B przedstawia konformację sfałdowaną w warunkach zasadowych. Schematy monomerów Aβ1-40 w każdej konformacji oraz morfologie agregacji/dyspersji są przedstawione obok obrazów TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres przesunięcia widmowego zależnego od pH; Δλ_peak w funkcji cykli (n); analiza nanocząsteczek; wynik eksperymentu" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Odwracalność samoorganizacji zależna od wielkości nano-. Przesunięcie średniej pozycji piku pasma SPR, <img alt="symbol λ_peak; schemat identyfikacji długości fali piku optycznego, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">, w funkcji liczby operacji, n, dla wszystkich badanych rozmiarów cząsteczek koloidu złota. Podano również przybliżone wartości pH oraz odpowiadające im etapy agregacji przedstawione na Rysunku 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy widmowej z agregacją cząstek zależną od pH; obrazy mikroskopowe, różne n, λpeak względem n." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: <img alt="symbol λ_peak; analiza widmowa; koncepcja pomiaru optycznego; schemat" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 5"> oraz obrazy TEM/światła białego dla każdego numeru operacji. Wartość <img alt="symbol λ_peak; schemat identyfikacji optycznej długości fali szczytowej, istotny dla badań spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2"> jako funkcja numeru operacji, n, została naniesiona dla złota 20 nm powlekanego Aβ1-40 (zamknięte kółka) oraz koloidu złota 20 nm (otwarte kółka), wraz z reprezentatywnymi obrazami TEM (A i C)/światła białego (B i D) dla wybranych numerów operacji (n = 1, 2, 3, 7 i 8 oznaczone strzałkami) dla złota 20 nm powlekanego Aβ1-40 (A i B) oraz koloidu złota 20 nm (C i D). Czcionka czarna oznacza pH 7, czcionka niebieska oznacza pH 4, a czcionka czerwona oznacza pH 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy mikroskopowej i SERS; pokazujący rozkłady cząstek dla n=2 i n=3 oraz wyniki widmowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy w świetle białym i Ramanowskie.Obraz w świetle białym, obraz Ramanowski oraz widmo SERS dla (A) n = 2 oraz (B) n = 3; i) obraz w świetle białym w szerokim polu widzenia, ii) obraz w świetle białym w obszarze, w którym wykonano obraz Ramanowski (oznaczony czerwonym kwadratem w i)), iii) połączony obraz Ramanowski dwóch komponentów, iv) obraz Ramanowski komponentu 1 oraz jego v) widmo SERS z iv), vi) obraz Ramanowski komponentu 2 oraz vii) widmo SERS z vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza spektroskopii Ramana z trójwymiarowymi wykresami widm i wizualizacją danych przesunięcia Ramanowskiego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Mapa konturowa widma SERS dla nnieparzystych, nparzystych oraz nwszystkich. (A) Trójwymiarowa mapa widma SERS w zakresie od 250 cm-1 do 1750 cm-1 jako funkcja n dla 20 nm złota pokrytego Aβ1-40, z mapą konturową przedstawioną w (B) na górze. (C) Trójwymiarowa mapa widma SERS w zakresie od 250 cm-1 do 1750 cm-1 jako funkcja n dla 20 nm złota, z mapą konturową przedstawioną w (D) na górze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza widm ramana; obejmuje sygnały SERS, wykres przesunięcia ramana, proces dopasowania widma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Mapa konturowa widma SERS. Mapa konturowa widma SERS w zależności od n (1-10). (A) Absorbancja przy 1395 cm-1 (niebieski) i 761 cm-1 (czerwony). (B-D) Dolny panel przedstawia widmo SERS, a prawy panel pokazuje amplitudę zmiany natężenia sygnału sygnałów SERS dla każdego n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig06largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy sekwencji białek; aminokwasy, strzałki wzmocnienia stanu złożonego/rozłożonego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig07v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Charakterystyczne sekwencje Aβ1-40. Sekwencje przypisane do znaczącego udziału przy nnieparzystym (odpowiadające formowaniu konformacji złożonej) są zaznaczone czerwonymi strzałkami skierowanymi w dół, a sekwencje przypisane do znaczącego udziału przy nparzystym (odpowiadające formowaniu konformacji rozłożonej) są zaznaczone niebieskimi strzałkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig07largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Zależna od pH zmiana barwy Aβ1-40 i koloidu czystego złota o rozmiarze 20 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/Movie%20Abeta-Gold%20Color%20Change.wmv" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Tutaj prezentujemy systematyczną metodę opisującą quasi-odwracalną samoorganizację agregatów złota o długości 20 nm pokrytych amyloidem beta 1-40 (Aβ 1-40). Zależna od nanorozmiaru, quasi-odwracalna sieć między peptydami została skorelowana z określonymi aminokwasami lub sekcjami monomeru Aβ 1-40.

Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

The characterization of A&#946;1-40 coated over the nano-gold colloidal particle surfaces was conducted using surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy ...

Moje badania koncentrują się na uzyskaniu krytycznych informacji potwierdzających amyloid beta 1-40, gdy jest on absorbowany przez powierzchnię nanocząstek złota i zachodzi w odwracalnym procesie agregacji. Wyzwaniem, przed którym stoimy w tej dziedzinie badawczej, jest uzyskanie informacji termicznej, chemicznej i dynamicznej o procesie agregacji odwrotnej. Wspaniałym odkryciem tego projektu jest to, że jesteśmy w stanie zidentyfikować konkretny tryb ruchu lub wibracji przyczyniający się do potwierdzenia potwierdzenia obecności amyloidu beta 1-40, gdy są one absorbowane przez powierzchnię nanocząstek złota.Ogromną zaletą stosowania SERS (powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii rozpraszania Ramana) jest wykrywanie bardzo małych, słabych sygnałów rozpraszania w celu zidentyfikowania trybu, który jest krytyczny dla spowodowania fałdowania i rozwijania. Jednocześnie jesteśmy w stanie określić morfologię agregatów. Odkrycia, które jesteśmy w stanie uzyskać w ramach tego projektu, to kluczowa interakcja białko-białko, która będzie ważna dla wywołania oligomeru i która doprowadzi do fibrogenezy.Na początek za pomocą mikropipety dodaj jeden mililitr destylowanej wody dejonizowanej do jednego miligrama liofilizowanego beta-amyloidu lub A beta 1-40. Mieszaj roztwór za pomocą mieszadła wirowego przez około 30 sekund. Upewnij się, że w roztworze w temperaturze pokojowej, około 20 stopni Celsjusza, nie pozostały żadne cząstki stałe.Następnie przygotuj roztwory podstawowe peptydów, używając wody dejonizowanej i destylowanej. Określić stężenie peptydu, mierząc spektroskopowo absorpcję tyrozyny przy 275 nanometrach. Roztwory podstawowe A beta 1-40 należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Rozmrozić podstawowy roztwór peptydowy około pięć minut przed zebraniem danych. W 15-mililitrowej probówce wirówkowej wymieszaj osiem mikrolitrów roztworu peptydu z 800 mikrolitrami koloidalnych cząstek złota. Dodaj 4,2 mililitra dejonizowanej wody destylowanej, a następnie wiruj próbkę przez 10 sekund.Ustal stężenie peptydów A beta 1-40 na 1,8 nanomola i dostosuj stosunek peptydów do złotych cząstek koloidalnych w określonym zakresie. Korzystając z jednostki sterującej temperaturą spektrofotometru UV w zakresie widzialnym, ustaw roztwór na temperaturę pokojową, około 22 stopnie Celsjusza. Monitorować początkowe pH roztworu próbki za pomocą pH-metru i dostosować je do wartości nieco poniżej pH siedem.Zbierz widmo absorpcyjne w zakresie od 400 do 800 nanometrów. Następnie dostosuj pH próbki do około pH cztery, dodając 1,0 mikrolitra z przyrostem 1,0 molowego kwasu solnego. Zbierz widmo absorpcyjne w tym samym zakresie od 400 do 800 nanometrów.Następnie dostosuj pH próbki do około 10 pH, dodając około 1,5 mikrolitra przyrostu 1,0 molowego wodorotlenku sodu. Zbierz widmo absorpcyjne w tym samym zakresie długości fal od 400 do 800 nanometrów. Następnie zmień pH między pH 4 a pH 10 10 razy, dodając kwas solny lub wodorotlenek sodu.Stale zbieraj widmo absorpcyjne w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Uzyskaj zestaw danych ASCII długości fal w funkcji absorbancji. Użyj programu PeakFit, aby wyodrębnić średnie pozycje pików pasma.Korzystając z funkcji wykresu, wykreśl zestaw danych, aby zobrazować gęstość optyczną w funkcji długości fali. Zidentyfikuj i oznacz początkowe szczytowe długości fal, lambda jeden i lambda dwa, wybierając ich przybliżone pozycje na wykreślonych danych. Dopasuj dane za pomocą funkcji dopasowania szczytowego programu początkowego.Uzyskaj wykres przedstawiający centralne pozycje pików dla każdej lambdy oznaczonej jako XCI, wraz z odpowiadającymi jej obszarami pasma, oznaczonymi jako AI. Eksportuj wyodrębnione pozycje szczytowe i odpowiadające im obszary do programu arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Oblicz współczynnik wagowy, AI, dla każdego środka piku, porównując obszar pasma z całkowitym obszarem całych pasm przy użyciu wyświetlonego wzoru. Następnie wyodrębnij średnią pozycję szczytu, korzystając z równania wyświetlanego na ekranie.Aby wygenerować wykres odwracalności, należy sporządzić tabelę średnich pozycji pików w funkcji numeru operacji N. Przypisz operację o numerze N, jak podano na ekranie. Przeanalizuj pozycję piku w N przy użyciu wyświetlonego wzoru. Przenieś obliczony zestaw danych do oprogramowania źródłowego i wykreśl go.Wybierz nieliniowe dopasowanie krzywej do analizy, wprowadź wartości początkowe dla A, B, C, D i E, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zakończyć proces dopasowywania krzywej. Aby przeprowadzić obrazowanie ramanowskie, dla każdej próbki w operacji numer N umieścić 100 mikrolitrów roztworu na krążku mikowym o średnicy jednego centymetra. Pozostaw próbki do wyschnięcia na noc przed pomiarem.Następnie zbierz obrazy światła białego dla każdej operacji o numerze N. Przygotuj oddzielną próbkę na nowym krążku miki, ponieważ pH jest stale zmieniane w zakresie od 4 do 10. Zbierz obraz Ramana dla każdego numeru operacji i korzystając z wymienionych specyfikacji lasera o długości fali 633 nanometrów. Przechwytuj obrazy w siatce o wymiarach 100 na 100 pikseli z określonym czasem integracji, skupiając się na żądanym obszarze widmowym.Wykreślić reprezentatywne widmo dla każdej operacji o numerze N wyrównane jako funkcja N. Skonstruuj trójwymiarową spektroskopię Ramana wzmocnioną powierzchniowo lub widmo SERS jako funkcję N dla złota o grubości 20 nanometrów pokrytego beta 1-40. Wykorzystaj widok widma z góry jako mapę konturową, aby wyodrębnić określone tryby związane z określonym stanem pH. Identyfikuj cechy spektralne ulepszone wyłącznie przy parzystych lub nieparzystych numerach operacji.Pasmo SPR nanocząstek złota pokrytych A beta 1-40 przesunęło się z 530 nanometrów do około 650 nanometrów, gdy roztwór stał się bardziej kwaśny. Odpowiadało to tworzeniu się złotych agregatów koloidalnych z rozwiniętymi monomerami A beta 1-40, jak zaobserwowano przez TEM. Widoczna była również zależna od pH zmiana koloru złota pokrytego A beta 1-40.Odwracalne, zależne od pH przesunięcie średniego pasma osiągało szczyt między krótszą a dłuższą długością fali, a naprzemienna morfologia rozproszona i zagregowana obserwowana w TEM potwierdziła quasi-odwracalny charakter procesu. Obrazowanie w świetle białym wykazało wyraźny, odwracalny wzór agregacji odpowiadający zmianom pH, podczas gdy widma SERS wykazywały subtelne zmiany zależne od pH w obszarze odcisku palca.

characterization-ph-dependent-reversible-self-assembly-amyloid-beta-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Fotowywołane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) umożliwia charakteryzację rozkładu wielkości oligomerów w metastabilnych mieszaninach białek. Prezentujemy zastosowanie metody PICUP w odniesieniu do trzech reprezentatywnych peptydów amyloidogennych: form 40- i 42-resztkowych białka amyloid β oraz kalcytoniny, a także do kontrolnego peptydu – czynnika uwalniającego hormon wzrostu.

Fotostymulowane sieciowanie niemodyfikowanych białek (PICUP) zastosowane do peptydów amyloidogennych

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Opisano metodę wielkoskalowego oczyszczania wewnątrzkomórkowej domeny białka APP (AICD). Opisano również metodologię indukcji agregacji AICD in vitro oraz jej wizualizację za pomocą mikroskopii sił atomowych. Przedstawione metody są przydatne do biochemicznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz badania wpływu chaperonów molekularnych na jej agregację.

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Błony amyloidowe są formowane przez liczne białka, a powstałe włókna mają strukturę "krzyżowego arkusza β". Opisujemy tutaj, jak próbki włókien amyloidowych mogą być przygotowywane do dyfrakcji rentgenowskiej włókien i jak wzory mogą być analizowane.

Amyloid i architektura krzyżowa beta

Poznaj metodę badania odwracalnej agregacji peptydu Aβ 1-40 na powierzchni nanocząstek złota przy użyciu spektroskopii SERS. Technika ta umożliwia identyfikację kluczowych trybów wibracyjnych wpływających na składanie białka.

Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

Przeglądaj więcej filmów