Name: Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji jąder w badaniach mięśni szkieletowych przy użyciu otwartego oprogramowania. To podejście eliminuje błąd obserwatora i poprawia normalizację danych metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez National Institutes of Health/National Institute on Aging (R01AG084597; DEL i HYL) oraz przez fundusze start-upowe z Texas Tech University (DEL). Autorzy pragną podziękować programom Texas Tech University Undergraduate Research Scholars i TrUE Scholars za udzielenie wsparcia finansowego naukowcom licencjackim, którzy przyczynili się do tej pracy (REH, MRD, CJM, AKW). Dziękujemy również doktorom Lauren S. Gollahon i Michaelowi P. Massettowi za łaskawe podzielenie się swoją przestrzenią laboratoryjną i sprzętem.

<ol><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioenergetic+health+index%3A+A+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci%22%5BJournal%5D)">The bioenergetic health index: A new concept in mitochondrial translational research.</a> Clin Sci. 127 (6), 367-373 (2014).</li>
<li>Desousa, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+ATP+production+rates+using+the+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer.</a> EMBO Rep. 24 (10), e56380(2023).</li>
<li>Rayamajhi, M., Zhang, Y., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+of+pyroptosis+by+measuring+released+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammasome%22%5BJournal%5D)">detection of pyroptosis by measuring released lactate dehydrogenase activity.</a> Inflammasome. 1040, 85-90 (2013).</li>
<li>Baskic, D., Popovic, S., Ristic, P., Arsenijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cycloheximide-induced+apoptosis+in+human+leukocytes%3A+Fluorescence+microscopy+using+annexin+V%2Fpropidium+iodide+versus+acridin+orange%2Fethidium+bromide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Analysis of cycloheximide-induced apoptosis in human leukocytes: Fluorescence microscopy using annexin V/propidium iodide versus acridin orange/ethidium bromide.</a> Cell Biol Int. 30 (11), 924-932 (2006).</li>
<li>Duplanty, A. A., Siggins, R. W., Allerton, T., Simon, L., Molina, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+mitochondrial+respiration+is+decreased+in+chronic+binge+alcohol+administered+simian+immunodeficiency+virus-infected+antiretroviral-treated+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Reps%22%5BJournal%5D)">Myoblast mitochondrial respiration is decreased in chronic binge alcohol administered simian immunodeficiency virus-infected antiretroviral-treated rhesus macaques.</a> Physiol Reps. 6 (5), e13625(2018).</li>
<li>Levitt, D. E., Bourgeois, B. L., Rodríguez-Graciani, K. M., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+impairs+bioenergetics+and+differentiation+capacity+of+myoblasts+from+Simian+immunodeficiency+virus-infected+female+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Alcohol impairs bioenergetics and differentiation capacity of myoblasts from Simian immunodeficiency virus-infected female Macaques.</a> Int J Mol Sci. 25 (4), 2448(2024).</li>
<li>Larsen, T. A., Goodsell, D. S., Cascio, D., Grzeskowiak, K., Dickerson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+DAPI+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Str+Dyn%22%5BJournal%5D)">The structure of DAPI bound to DNA.</a> J Biomol Str Dyn. 7 (3), 477-491 (1989).</li>
<li>Bazhulina, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Hoechst+33258+and+its+derivatives+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Str+Dyn%22%5BJournal%5D)">Binding of Hoechst 33258 and its derivatives to DNA.</a> J Biomol Str Dyn. 26 (6), 701-718 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomet+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytomet A. 69A (8), 805-814 (2006).</li>
<li>Hamada, S., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI+staining+improved+for+quantitative+cytofluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry.</a> Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).</li>
<li>Levitt, D. E., Chalapati, N., Prendergast, M. J., Simon, L., Molina, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-impaired+myogenic+differentiation+is+associated+with+decreased+myoblast+glycolytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol-impaired myogenic differentiation is associated with decreased myoblast glycolytic function.</a> Alcohol Clin Exp Res. 44 (11), 2166-2176 (2020).</li>
<li>Levitt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+bioenergetic+health+and+function+in+people+living+with+HIV%3A+association+with+glucose+tolerance+and+alcohol+use%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul%2C+Integ+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle bioenergetic health and function in people living with HIV: association with glucose tolerance and alcohol use.</a> Am J Physiol Regul, Integ Comp Physiol. 321 (5), R781-R790 (2021).</li>
<li>Levitt, D. E., Adler, K. A., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEMA+3+staining%3A+A+simple+alternative+for+the+assessment+of+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HEMA 3 staining: A simple alternative for the assessment of myoblast differentiation.</a> Curr Prot Stem Cell Biol. 51 (1), e101(2019).</li>
<li>Solem, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolem%2C+JE+%22Programming+computer+vision+with+Python%22">Programming computer vision with Python</a>. , O'Reilly. Sebastopol, CA. (2012).</li>
<li>Delery, E. C., Levitt, D. E., Amedee, A. M., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat%2C+high+sucrose+diet+promotes+increased+expression+of+ACE2+receptor+in+the+SIV-infected+host%3A+implications+for+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Nutrition%22%5BJournal%5D)">High fat, high sucrose diet promotes increased expression of ACE2 receptor in the SIV-infected host: implications for SARS-CoV-2 infection.</a> Front Nutrition. 11, 1458106(2024).</li>
<li>Corrà, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+an+automated+method+compared+with+manual+methods+for+the+quantification+of+intraepidermal+nerve+fiber+in+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advantages of an automated method compared with manual methods for the quantification of intraepidermal nerve fiber in skin biopsy.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 80 (7), 685-694 (2021).</li>
<li>Neves, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reliability+of+the+isotropic+fractionator+method+for+counting+total+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">The reliability of the isotropic fractionator method for counting total cells and neurons.</a> J Neurosci Meth. 326, 108392(2019).</li>
<li>Tiong, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuickCount%3A+a+novel+automated+software+for+rapid+cell+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">QuickCount: a novel automated software for rapid cell detection and quantification.</a> BioTechniques. 65 (6), 322-330 (2018).</li>
<li>Koo, T. K., Li, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guideline+of+selecting+and+reporting+intraclass+correlation+coefficients+for+reliability+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chiropractic+Med%22%5BJournal%5D)">A guideline of selecting and reporting intraclass correlation coefficients for reliability research.</a> J Chiropractic Med. 15 (2), 155-163 (2016).</li>
<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. P. Normalization of Agilent Seahorse XF Data by in situ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22cell+counting+using+a+BioTek+Cytation+5%22">cell counting using a BioTek Cytation 5</a>. , https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-7908EN.pdf 5991-7908 (2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+imageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH image to imageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> J Vis Exp. (117), e54719(2016).</li>
<li>Grishagin, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+cell+counting+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Automatic cell counting with ImageJ.</a> Anal Biochem. 473, 63-65 (2015).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Tollemar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chromogenic+immunohistochemical+image+analysis+in+cellprofiler+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative chromogenic immunohistochemical image analysis in cellprofiler software.</a> Cytometry A. 93 (10), 1051-1059 (2018).</li>
<li>Chazotte, B. Labeling nuclear DNA using DAPI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChazotte%2C+B+%22Cold+Spring+Harbor%22">Cold Spring Harbor</a>. 2011 (1), (2011).</li>
<li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+Migrat%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging.</a> Cell Adhesion Migrat. 8 (5), 452-459 (2014).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Annexin+V%2FPropidium+Iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modified Annexin V/Propidium Iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> J Vis Exp. (50), e2597(2011).</li>
<li>Hernandez, J. J., Beaty, D. E., Fruhwirth, L. L., Lopes Chaves, A. P., Riordan, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dodging+COVID-19+infection%3A+low+expression+and+localization+of+ACE2+and+TMPRSS2+in+multiple+donor-derived+lines+of+human+umbilical+cord-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Dodging COVID-19 infection: low expression and localization of ACE2 and TMPRSS2 in multiple donor-derived lines of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.</a> J Transl Med. 19 (1), 149(2021).</li>
<li>Bourgeois, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+miR-206+improves+chronic+binge+alcohol-mediated+decreased+myoblast+differentiation+in+SIV-infected+female+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle miR-206 improves chronic binge alcohol-mediated decreased myoblast differentiation in SIV-infected female macaques.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 327 (6), C1626-C1637 (2024).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the lactate dehydrogenase assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+P+%22Cold+Spring+Harbor%22">Cold Spring Harbor</a>. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+everolimus+on+macrophage-derived+foam+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Revasc+Med+Including+Mol+Intervent%22%5BJournal%5D)">Effects of everolimus on macrophage-derived foam cell behavior.</a> Cardiovasc Revasc Med Including Mol Intervent. 15 (5), 269-277 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Nasz program do kwantyfikacji jąder ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi opcjami: wymaga jedynie minimalnych umiejętności technologicznych, jest walidowany pod kątem konkretnego zadania kwantyfikacji jąder i jest open-source; W ten ostatni sposób pokonuje się bariery związane z kosztami. Ostatecznie, program ten zapewnia biologom komórkowym i molekularnym dodatkową opcję szybkiego i dokładnego oznaczania ilościowego jąder na obrazach zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obecnie dostępne programy...

Eksperymenty funkcjonalne i oparte na obrazach są kluczowe dla zrozumienia wpływu eksperymentalnych terapii na biochemię i fizjologię całych komórek. Prawidłowa interpretacja danych z eksperymentów biologii komórki zależy od dokładności i odtwarzalności protokołu eksperymentalnego, w tym normalizacji danych. Na przykład analizy zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w żywych komórkach na początku badania i po leczeniu określonymi lekami pozwalają na ocenę różnych aspektów metabolizmu energetycznego1,2. Pomiar aktywności enzymów, takich jak dehydrogenaza mleczanowa w supernatancie kultur komórkowych, może pomóc w ilościowym określeniu integralności błony komórkowej3. Barwienie hodowanych komórek anektyną V i jodkiem propidyny przed utrwaleniem pozwala na ocenę komórek apoptotycznych i martwiczych4. Jednak różnice w gęstości komórek w studzienkach wpływają na wyniki każdego z tych testów. Poleganie wyłącznie na gęstości wysiewu może dostarczyć mylących wyników z powodu błędów w liczeniu komórek do wysiewu, różnic w gęstości komórek w pożywce podczas posiewu lub różnych temp wzrostu komórek między próbkami lub traktowaniem w trakcie eksperymentów. Dlatego wymagana jest normalizacja wyników eksperymentalnych.
Obecne metody normalizacji danych funkcjonalnych i opartych na obrazach komórek obejmują stężenie białka5 lub liczbę jąder lub komórek6. Aby znormalizować dane dotyczące stężenia białka, komórki muszą być wyekstrahowane w równych objętościach buforu do lizy z inhibitorem proteazy po przeprowadzeniu testu, a następnie należy przeprowadzić dodatkowy test (np. test kwasu bicinchoninowego, test Bradforda itp.) w celu ilościowego określenia białka. Dokładność tej metody opiera się na całkowitej ekstrakcji komórek; Pozostawienie jakiegokolwiek białka przyczynia się do błędów w kwantyfikacji. Liczenie jąder lub komórek stanowi alternatywę, w której żadne komórki nie muszą być usuwane z powierzchni, na której są hodowane. Zamiast tego żywe lub utrwalone komórki są barwione lub barwione przeciw za pomocą barwienia kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego, a liczenie można przeprowadzić na podstawie obrazów całych komórek lub tylko jąder. Kwantyfikacja jąder jest preferowana w stosunku do całych komórek w zastosowaniach mikroskopii fluorescencyjnej i do normalizacji danych w połączonych komórkach (np. Rurkach mięśniowych) lub tkankach. W celu ilościowego oznaczania jąder przy użyciu podejścia fluorescencyjnego fluorescencyjne barwniki DNA (np. dichlorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5 itp.) nakłada się na żywe lub utrwalone komórki i obrazuje za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. DAPI, Hoechst i DRAQ5 preferencyjnie wiążą się z bogatymi w adeninę i tyminą regionami DNA7,8,9, zapewniając środki do wykrywania jąder. Optymalizacja stężenia barwnika zapobiega wiązaniu poza celem (tj. z mitochondrialnym DNA, powodując punktową fluorescencję cytozolową)10. Proces optymalizacji można usprawnić poprzez zastosowanie dostępnych na rynku nośników montażowych zawierających DAPI dla komórek stałych (np. VECTASHIELD Antifade Mounting Medium z DAPI) oraz opublikowanych stężeń barwników dla żywych komórek (np. Hoechst)6,11,12. Po wybarwieniu jądra w żywych lub nieruchomych komórkach są wizualizowane za pomocą odpowiedniego filtra wzbudzenia (np. ultrafioletowego [DAPI i Hoechst] lub dalekiej czerwonej [DRAQ5]). Maksima wzbudzenia dla DAPI, Hoechst i DRAQ5 znajdują się na obu końcach spektrum dla mikroskopii fluorescencyjnej. Ta cecha, plus specyficzność DNA tych barwników i ich stosowanie w optymalnych stężeniach, minimalizuje fluorescencję poza celem. Uzyskane obrazy pokazują jasne jądra na czarnym tle, a jądra te są określane ilościowo jako miara liczby komórek dla komórek jednojądrowych. Podczas gdy istnieją inne dokładne metody kwantyfikacji jąder oparte na barwieniu, wykorzystujące barwienia histologiczne i mikroskopię jasnego pola13, automatyzacja jest trudniejsza, choć możliwa, przy użyciu tych podejść.
Chociaż pozostaje to złotym standardem, ręczna kwantyfikacja jąder jest pracochłonna, czasochłonna i podatna na potencjalne błędy ludzkie przy długotrwałym liczeniu. Chociaż istnieją programy do automatycznego zliczania komórek, nie są one preferowane przez wszystkich użytkowników, mogą być zbyt kosztowne, a walidacja dla określonych aplikacji może być minimalna. W ostatnich latach Python stał się cennym i dostępnym zasobem dla biologów. Biblioteki przetwarzania obrazów w języku Python są szczególnie przydatne do analizy obrazów14. Tutaj podajemy instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z naszego programu wykonywalnego opracowanego przy użyciu kodu Python do ilościowego oznaczania jąder barwionych barwnikami fluorescencyjnymi i obrazowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Umiejętność kodowania nie jest konieczna do korzystania z opisanego tutaj programu. Ten przepływ pracy jest specyficzny dla komórek lub tkanek z zastosowanymi fluorescencyjnymi barwnikami DNA. Nie jest przeznaczony do użytku z obrazami w jasnym polu. W rozdziale 1 opisano, w jaki sposób rejestrować i zapisywać obrazy zebrane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w sposób zgodny z tym przepływem pracy. Sekcja 2 zawiera instrukcje dotyczące uruchamiania programu kwantyfikacji jąder jako pliku wykonywalnego i pobierania danych wyjściowych. Program wykonywalny może być uruchomiony bezpośrednio z dostarczonego pliku .exe i nie wymaga żadnych modyfikacji w celu ilościowego określenia jąder na obrazach o wysokiej jakości. Ten plik wykonywalny wymaga komputera z systemem Windows. Sekcja 3 zawiera instrukcje dotyczące uruchamiania programu jako skryptu Pythona, a nie pliku wykonywalnego (wymagane w systemach opartych na Macu lub Linux, opcjonalne dla systemów opartych na systemie Windows) i pozwala na dostrojenie kodu w razie potrzeby. W sekcji 4 opisano, jak wykorzystać wyniki do normalizacji. Po tych protokołach pojawiają się reprezentatywne wyniki, w tym dane walidacyjne z naszego laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Komputer z dostępem do pliku wyników z metody 2 lub 3</td> <td>-</td><td></td> <td>patrz krok 2.6 (dla metody 2) lub krok 3.3.9 lub 3.4.9 (dla metody 3)</td></tr> <tr><td>Komputer z dostępem do Internetu, nowoczesna przeglądarka</td> <td>-</td><td></td> <td>np. Google Chrome</td></tr><tr><td>Komputer z dostępem do Internetu, nowoczesną przeglądarką i systemem operacyjnym Windows</td><td>Różni</td><td></td> się <td>W przypadku komputerów Mac, Linux lub innych systemów operacyjnych użyj metody 3</td></tr><tr><td>Komputer z oprogramowaniem do przechwytywania obrazów</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td>Dopuszczalne jest inne oprogramowanie; musi być kompatybilny z mikroskopem fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Lokalizacja pliku wyjściowego (arkusz kalkulacyjny wyników i kontury obrazu)</td> <td>-</td><td></td> <td>Może to być nowy, pusty folder</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Inne mikroskopy fluorescencyjne są dopuszczalne; muszą być wyposażone w odpowiednie kostki filtrujące, pożądany obiektyw i kamerę&nbsp;</td></tr><tr><td>Folder zawierający wszystkie obrazy do ilościowego określenia</td> <td>-</td><td></td> <td>patrz krok 1.12</td></tr><tr><td>Python w wersji 3.10 lub nowszej</td><td>Python</td> <td>-</td> <td>dostępny do bezpłatnego pobrania i instalacji pod adresem https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td></tr><tr><td>Próbki do obrazowania</td> <td>-</td><td></td> <td>utrwalone lub żywe, barwione lub barwione fluorescencyjnymi barwnikami DNA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>Dopuszczalne jest również podobne oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Using Computer Vision Libraries to Streamline Nuclei Quantification

Testy żywych komórek i analizy komórek oparte na obrazie wymagają normalizacji danych dla dokładnej interpretacji. Powszechnie stosowaną metodą jest barwienie i ilościowe oznaczanie jąder, a następnie normalizacja danych do liczby jąder. Ta liczba jąder jest często wyrażana jako liczba komórek w komórkach jednojądrowych. Chociaż ręczna kwantyfikacja może być pracochłonna i czasochłonna, dostępne zautomatyzowane metody mogą nie być preferowane przez wszystkich użytkowników, mogą nie mieć walidacji dla tego konkretnego zastosowania lub mogą być zbyt kosztowne. W tym miejscu przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące przechwytywania wymiernych obrazów jąder barwionych fluorescencyjnymi barwnikami DNA, a następnie ilościowego określania jąder za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do liczenia obiektów opracowanego przy użyciu bibliotek widzenia komputerowego Python. Weryfikujemy również ten program w szerokim zakresie gęstości komórek. Chociaż dokładny czas wykonania programu różni się w zależności od liczby obrazów i sprzętu komputerowego, ten program konsoliduje godziny pracy, licząc jądra w sekundach, aby program mógł działać. Chociaż protokół ten został opracowany przy użyciu obrazów utrwalonych, barwionych komórek, obrazy barwionych jąder w żywych komórkach i zastosowania immunofluorescencji można również określić ilościowo za pomocą tego programu. Ostatecznie program ten zapewnia opcję, która nie wymaga wysokiego stopnia umiejętności technologicznych i jest zweryfikowaną alternatywą typu open source, która pomaga biologom komórkowym i molekularnym w usprawnianiu ich przepływów pracy, automatyzując żmudne i czasochłonne zadanie kwantyfikacji jąder.

Każde uruchomienie przetwarzania wsadowego obrazów generuje: 1) zestaw plików obrazów z naniesionymi konturami pokazującymi obrysy zidentyfikowanych jąder komórkowych (Rysunek 5) oraz 2) plik .csv (arkusz kalkulacyjny) wiążący nazwy plików obrazów z powiązanymi liczbami zliczeń. Przeglądanie konturów pozwoli użytkownikowi na wizualną ocenę jakości zliczeń. W szczególności obrazy uzyskane zgodnie z sekcją 1&#160;powinny zawierać wszystkie (lub prawie wszystkie...

Ten artykuł opisuje krok po kroku metody automatyzacji kwantyfikacji jąder na podstawie obrazów za pomocą programu wykonywalnego o otwartym kodzie źródłowym, sprawdzanego w różnych gęstościach komórek. Ten program stanowi alternatywę, która usuwa bariery związane z kosztami, dostępnością dla użytkowników o ograniczonych umiejętnościach technologicznych oraz walidacją specyficzną dla aplikacji, która może ograniczać użyteczność istniejących technologii.

Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Live cell assays and image-based cell analyses require data normalization for accurate interpretation. A commonly used method is to stain and quantify ...

Opracowaliśmy tę metodę, aby znormalizować dane metaboliczne z modeli komórkowych, aby pomóc zidentyfikować mechanizmy, podkreślić adaptacje mięśni szkieletowych wywołane terapią cieplną i ostatecznie poprawić zdrowie metaboliczne u osób ze stanem przedcukrzycowym.Musimy policzyć jądra do normalizacji eksperymentalnej. Ręczna kwantyfikacja jąder wiąże się z wyzwaniami, takimi jak stronniczość obserwatora, czas i zmienność w natrafianiu na różne próbki lub warunki.Nasz program jest open source, co zapewnia użyteczność dla naukowców o różnym poziomie umiejętności technologicznych związanych z kodowaniem i jest zatwierdzony do konkretnego zadania, jakim jest szybkie i dokładne ilościowe określanie jąder.Technika ta pozwala nam obiektywnie zweryfikować mechanizmy leżące u podstaw potencjalnego wpływu terapii cieplnej na korzyści zdrowotne mięśni i mitochondriów z naszego ostatniego badania klinicznego finansowanego przez NIA.[Narrator] Aby rozpocząć, uruchom przeglądarkę internetową w systemie komputerowym, przejdź do wydań licznika github.com i jąder. Pobierz najnowszą wersję pliku o nazwie Count nuclei.zip. W folderze Pobrane kliknij prawym przyciskiem myszy plik zip i wybierz Wyodrębnij wszystko, aby wyodrębnić pliki do żądanej lokalizacji na komputerze lokalnym. Następnie wyszukaj CMD lub wiersz polecenia w pasku wyszukiwania, aby otworzyć wiersz polecenia. Użyj polecenia CD, aby zmienić katalog na ścieżkę pliku wykonywalnego, który jest plikiem aplikacji, który został właśnie wyodrębniony z folderu pobierania. Następnie naciśnij Enter, aby potwierdzić zmianę katalogu. W następnym wierszu polecenia zastąp ścieżkę do obrazów ścieżką pliku do folderu zawierającego obrazy, które mają zostać przeanalizowane. Ścieżka do wyjścia ze ścieżką pliku do folderu, w którym ma zostać zapisany plik .csv, a results.csv z żądaną nazwą pliku wyjściowego. Na ekranie wyświetlany jest przykładowy kod, a ścieżki plików do obrazów i danych wyjściowych można wstawić, jak pokazano w cudzysłowie. Użyj results.csv jako nazwy pliku wyników lub określ inną. Następnie naciśnij Enter. Gdy pojawi się następny wiersz polecenia, upewnij się, że przetwarzanie zostało zakończone. Sprawdź, czy kontury i arkusz kalkulacyjny wyników są dostępne w określonym katalogu wyjściowym. Wizualnie sprawdź kontury i porównaj je ze zliczeniami, aby zweryfikować jakość zliczania przed normalizacją danych. Otwórz przeglądarkę i przejdź do licznika jąder na github.com. Kliknij zielony przycisk Kod, a następnie wybierz Pobierz ZIP, aby pobrać repozytorium kodu. W systemie Mac OS kliknij menu plików w folderze Pobrane i wybierz Otwórz, aby wyodrębnić pliki na komputer lokalny. Przejdź do wyodrębnionego folderu o nazwie nuclei_counter main, który zawiera repozytorium kodu. Zapisz folder w dostępnym miejscu i zanotuj ścieżkę do pliku w dokumencie tekstowym. Następnie naciśnij Command + spacja, aby otworzyć Spotlight. Następnie wpisz terminal w Spotlight i wybierz aplikację terminala. Użyj polecenia CD, aby zmienić katalog na ścieżkę repozytorium kodu, kopiując i wklejając ścieżkę pliku z dokumentu tekstowego, a następnie naciśnij Enter. W następnym wierszu polecenia upewnij się, że po znaku dolara znajduje się spacja. Następnie wpisz podane polecenie i naciśnij Enter, aby zainstalować wymagane biblioteki i włączyć tryb edytowalny. Dołącz odpowiednią wersję języka Python natychmiast po, jak pokazano, bez spacji. Wpisz polecenie ekranowe w następnym wierszu poleceń, aby zmienić katalog na główny katalog kodu źródłowego, którym jest licznik jąder CD, jak pokazano na ekranie. Następnie wpisz polecenie ekranowe, zastępując odpowiednio ścieżki plików, i naciśnij Enter. Gdy pojawi się następny wiersz polecenia, upewnij się, że przetwarzanie zostało zakończone. Sprawdź, czy kontury i arkusz kalkulacyjny wyników są dostępne w określonym katalogu wyjściowym. Wizualnie sprawdź kontury i porównaj je ze zliczeniami, aby zweryfikować jakość zliczania przed normalizacją danych. Wszystkie jądra na obrazach wygenerowanych przez zautomatyzowany program zostały obrysowane jednolitymi zielonymi konturami, co oznacza, że jądra zostały pomyślnie policzone. Niezawodność między oceniającymi między dwoma ręcznymi liczeniami była doskonała, ze współczynnikiem korelacji wewnątrzklasowej większym niż 0,999 i wartością P mniejszą niż 0,0001. Zautomatyzowany program wykazał się doskonałą niezawodnością w porównaniu ze średnim zliczaniem ręcznym ze współczynnikiem korelacji wewnątrzklasowej wynoszącym 0,993 i wartością P mniejszą niż 0,0001. Doskonałą niezawodność zaobserwowano we wszystkich kwartylach gęstości komórek ze współczynnikami korelacji wewnątrzklasowej w zakresie od 0,986 do 0,998, przy czym wszystkie miały wartości P mniejsze niż 0,0001. Obszary z wieloma jądrami zgrupowanymi razem lub obszary z artefaktem, takim jak halo, nie były dokładnie liczone przez zautomatyzowany program. Te potencjalne problemy wraz z możliwymi przyczynami i krokami rozwiązywania problemów w celu poprawy zarówno jakości obrazu, jak i dokładności przepływu pracy automatycznej kwantyfikacji jąder są wymienione w tabeli na ekranie.

using-computer-vision-libraries-to-streamline-nuclei-quantification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Presented to elastyczny przepływ pracy w informatyce, umożliwiający multipleksowaną analizę obrazów fluorescencyjnie znakowanych komórek. Przepływ pracy określa ilościowo markery jądrowe i cytoplazmatyczne oraz oblicza translokację markerów między tymi przedziałami. Przedstawiono procedury perturbacji komórek z wykorzystaniem siRNA oraz wiarygodną metodologię wykrywania markerów za pomocą immunofluorescencji pośredniej w formatach 96-dołkowych.

Przepływ pracy dla wysokiej zawartości, indywidualnej kwantyfikacji komórek markerów fluorescencyjnych na podstawie danych z mikroskopu uniwersalnego, wspierany przez oprogramowanie Open Source

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Prezentujemy swobodnie dostępny przepływ pracy stworzony do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych w określonych przedziałach komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Ten przyjazny dla użytkownika przepływ pracy został zaprojektowany na oprogramowaniu open source Icy i wykorzystuje również funkcje ImageJ. Potok jest przystępny cenowo bez wiedzy z zakresu analizy obrazu.

Substructure Analyzer: Przyjazny dla użytkownika przepływ pracy do szybkiej eksploracji i dokładnej analizy ciał komórkowych na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.

Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji jąder w badaniach mięśni szkieletowych przy użyciu otwartego oprogramowania. To podejście eliminuje błąd obserwatora i poprawia normalizację danych metabolicznych.

Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Przeglądaj więcej filmów