Name: Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj zaawansowane techniki mikroskopii i immunocytochemii do badania dynamiki ściany komórkowej w Penium margaritaceum. Metoda ta pozwala wizualizować zmiany pektyn w odpowiedzi na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (NSF) (grant MCB numer 2129443 dla DD).

UWAGA: Penium margaritaceum jest uzyskiwane w Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae na Uniwersytecie w Getyndze, SAG; szczep #2640.
1. Utrzymanie kultur
<ol>
	<li>Utrzymuj glony w płynnym podłożu Woods Hole (WH12), które można również uzupełnić ekstraktem wodnym z gleby (tj. 40 ml na litr podłoża). Utrzymuj kultury w temperaturze 20-25 °C w cyklu 16 h: 8 h światło: ciemność z 3,5 klux (74 μmol fotonów/m2/s) chłodnego białego światła fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przygotowuj subkultury co tydzień i używaj kultur komórkowych, gdy mają 10-14 dni. Kultury penisa będą żywotne przez 6 miesięcy i mogą być używane do zakładania subkultur w tym czasie. Glony będą również rosły na 1%-2% zestalonym agarze WHM.</li>
	<li>W celu rutynowej synchronizacji cyklu komórkowego umieść komórki z 10-14-dniowych kultur w ciemności na 2-6 tygodni w temperaturze 20-25 °C. Po tym czasie przemyć komórki świeżym WHM (patrz poniżej) i kulturą, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
2. Znakowanie ściany komórkowej przeciwciałami monoklonalnymi
UWAGA: P. margaritaceum jest pokryty pierwotną ścianą komórkową, która ma wiele takich samych składników, jakie można znaleźć w pierwotnych ścianach komórkowych roślin lądowych11. Wiele przeciwciał monoklonalnych (mAb) podniesionych przeciwko epitopom ściany komórkowej roślin lądowych rozpoznaje składniki ściany komórkowej P. margaritaceum. Źródłem tych przeciwciał jest Centrum Badań nad Złożonymi Węglowodanami Uniwersytetu Georgia (ccrc@uga.edu) lub Kerafast (kerafast.com). Po znakowaniu ściany komórkowej żywych komórek pierwszorzędowymi mAb specyficznymi dla epitopów ściany komórkowej i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (np. FITC, TRITC), komórki można umieścić z powrotem w hodowli bez wpływu na zdrowie komórki lub odkładanie się ściany komórkowej. Fluorescencyjne znakowanie ściany komórkowej pozostaje w nieskończoność, a nowo wydzielana ściana komórkowa przedstawia się jako ciemne (tj. nieznakowane) strefy, które można zmierzyć w celu określenia szybkości ekspansji komórki i / lub ponownie znakować za pomocą mAb lub innych sond.
<ol>
	<li>Usuń 5 ml aktywnie rosnącej płynnej kultury komórkowej (w wieku 10-14 dni) i umieść ją w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować na wirówce stołowej przy 1 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odlewać i wyrzucać supernatant. Zawiesić osad w 5 ml świeżego WHM. Umieść szczelnie nakrętkę i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe lub EPS z powierzchni ściany komórkowej.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 1 min. Powtórzyć krok 2.2 i odwirować. Zawiesić osad w 1 ml świeżego WHM i przenieść 200 μl porcji zawiesiny komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zakryć probówki i odwirować w mikrowirówce o sile 1 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl świeżego WHM.</li>
	<li>Do zawiesiny dodać 20 μl mAb (np. JIM5, mAb szczura o swoistości dla homogalakturonanu estryfikowanego metylem; końcowe rozcieńczenie wynosi 1:20 z WHM). Zwirować probówkę, zawinąć ją w folię aluminiową i umieścić na rotatorze laboratoryjnym na 90 minut. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wymieszać probówkę 2 razy podczas 90-minutowego etapu inkubacji.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 1 000 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżego WHM. Zakryj rurkę i wiruj zawiesinę komórek przez 10 sekund.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 2x. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 μl WHM i 8 μl koziego środka przeciw szczurom TRITC lub FITC (rozcieńczonego w stosunku 1/75 z WHM). Zawiń probówkę w folię aluminiową i umieść ją na rotatorze laboratoryjnym na 90 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.6 i 2.7. Ponownie zawiesić granulkę w 100 μl pożywki wzrostowej, zakryć probówkę i zawinąć ją w folię aluminiową, aż będzie gotowa do obrazu. 
	UWAGA: Można również zastosować inkubację komórek w WHM zawierających czynnik blokujący, taki jak mleko instant bez tłuszczu z goździków (1%) lub albumina surowicy bydlęcej (1%) przed inkubacją w mAb, ale z naszego doświadczenia wynika, że nie wpływa to na jakość lub intensywność. Penium nie rozszerza swojej ściany komórkowej ani nie wytwarza dużych ilości EPS w ciemności. Wyznakowane przeciwciało pozostaje nienaruszone przez co najmniej 3-4 dni. Dzięki temu obrazowanie nie musi być wykonywane od razu. Można tu zastosować inne przeciwciała monoklonalne, ale konieczne będzie zbadanie stężeń. W przypadku chemicznych i fizycznych badań przesiewowych można oznaczyć kilka ml zawiesiny komórkowej, przechowywać w ciemności przez kilka dni i stosować w badaniach na mikropłytkach. Komórki mogą być również znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym tylko przed leczeniem, a następnie przeciwciałem drugorzędowym.</li>
</ol>
3. Pomiar ściany komórkowej i szybkości ekspansji komórki w czasie
<ol>
	<li>Weź 1 ml komórek znakowanych JIM5-TRITC i umieść 1 ml WHM w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 250 μl WHM i odwirować, aby wymieszać komórki.</li>
	<li>Do każdego dołka na 12-dołkowej szalce Petriego dodaj 1 ml WHM. W tym czasie do każdej studzienki można dodać określone inhibitory i regulatory wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiono efekty zwiększenia poziomu wapnia podczas inkubacji.</li>
	<li>Pobrać 30 μl znakowanej zawiesiny komórkowej (krok 1) i dodać do każdej studzienki mikropłytki. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać. Uszczelnij przezroczystą folią.</li>
	<li>Hodowla jak wyżej (krok 1.1) przez 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny. W określonych momentach usuń 250 ml zawiesiny komórek z każdej studzienki i umieść ją w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 μl.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 1 min. Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 50 μl pożywki wzrostowej i odwirować.</li>
	<li>Umieścić 15 μl kropli zawiesiny komórek na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 (grubość 1,5). Obserwuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu filtra TRITC przy 10x -20x.</li>
	<li>Uchwyć obrazy co najmniej 50-100 komórek. Dla każdej komórki zmierz i zapisz całkowitą długość komórki oraz długość ciemnej strefy (tj. nowej ściany wytworzonej podczas inkubacji po znakowaniu).</li>
	<li>Określić średni % nowych ścian komórkowych w hodowli. Powtórz dla komórek pobranych po 48 godzinach i 72 godzinach, aby uzyskać informacje na temat rozszerzania się ściany komórkowej w czasie. 
	UWAGA: Kroki 3.5-3.8 dają gęstą zawiesinę komórek, która pozwala na obrazowanie wielu komórek w jednym polu widzenia. To sprawia, że pomiar ręczny jest znacznie wygodniejszy. Wiele programów do kamer zapewnia wygodny i/lub automatyczny pomiar wymiarów komórek, które mogą być używane z tą algą. Można również zebrać komórki i oznaczyć je jak powyżej za pomocą JIM5, ale zastąpić antyszczurzy FITC jako przeciwciało drugorzędowe. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) można obrazować komórki zarówno z filtrami FITC, jak i TRITC. Sygnały fluorescencyjne można następnie przypisać do różnych pseudokolorów. Pozwala to również na rozróżnienie struktury nowej ściany komórkowej wytwarzanej podczas różnych zabiegów (znakowanej JIM5-FITC) w porównaniu ze ścianami komórkowymi znakowanymi wstępnie (znakowanymi JIM5-TRITC).</li>
</ol>
4. Obrazowanie poklatkowe ekspansji ściany komórkowej
<ol>
	<li>Oznacz ścianę komórkową za pomocą JIM5-TRITC, jak opisano powyżej (kroki 2.1-2.8). Rozcieńczyć komórki 10x w WHM i dodać kroplę 50 μl komórek na szkiełko nakrywkowe lub szalkę Petriego ze szklanym dnem.</li>
	<li>Pozwól komórkom przylegać do szkła przez 2 minuty w ciemności. Delikatnie spłucz komórki, które nie przykleiły się do szkła, za pomocą 1 ml WHM. Użyj mikropipety i ostrożnie dodaj kroplami WHM do szklanki.</li>
	<li>Dodaj 30 μl WHM na wierzch komórek przymocowanych do szkła. Dodaj 30 μl ciepłej 4% agarozy/WHM na kropelkę WHM/komórek. Pozwól agarozie ostygnąć do temperatury pokojowej i zestalić się.</li>
	<li>W przypadku próbek na szalce Petriego dodaj tyle WHM, aby całkowicie pokryć komórki zanurzone w agarozie. W przypadku komórek na szkiełku nakrywkowym odwróć szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść je na szkiełku wgłębieniowym wypełnionym WHM.</li>
	<li>Zamontuj komórki w mikroskopie fluorescencyjnym. Można ustawić oświetlenie zewnętrzne (lampę) lub światło z samego mikroskopu można wykorzystać do dostarczenia energii do wzrostu i ruchu komórek. W mikroskopie Olympus Ix83 lub Ix63 dobrze sprawdza się moc 5-6 V dla lampy trans. Może to wymagać prób i błędów w twoim systemie.</li>
	<li>Obraz co 10-30 minut przy użyciu zestawu filtrów TRITC do śledzenia rozszerzania się ściany komórkowej. Dodaj substancje chemiczne/enzymy do WHM użyte w kroku 3.8, jeśli takie istnieją.</li>
</ol>
5. Obserwacja produkcji zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS)
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek: Pobrać 5 ml komórek z 10-14-dniowych kultur i umyć je jak w krokach 1-4 powyżej.</li>
	<li>Przygotowanie kulek fluorescencyjnych: Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 1 kroplę (około 100 μl) kulek fluorescencyjnych o wielkości 0,75 μm (Polysphere). Dodaj 1 ml WHM do probówki i energicznie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić kulki. Wirować przy 10 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant. Dodaj 1 ml WHM do granulki i wstrząśnij. Wirować przy 10 000 x g przez 3 min. Zawiesić osad w 500 μl WHM.</li>
	<li>Przygotowanie dołków: Dodać 1 ml pożywki WHM do dołków płytki 12-dołkowej. Dodaj inhibitory lub regulatory wzrostu do pożądanego stężenia i delikatnie zamieszaj. Dodaj 10 μl roztworu kulek i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać kulki. Dodaj 10 μl umytych komórek do każdego dołka i delikatnie zamieszaj płytkę.</li>
	<li>Hodować płytkę komórkową jak powyżej (1.1). Po 24 godzinach delikatnie umieścić płytkę (należy uważać, aby nie wymieszać) na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC. Koraliki przylegają do EPS i odsłaniają wzory uwalniania EPS. Sfotografuj komórki z powiększeniem 4x, 10x lub 20x.</li>
</ol>
6. Obrazowanie poklatkowe formacji szlaku EPS
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe na płytce 12-dołkowej (krok 3.2), jak przygotowano powyżej, lub na pojedynczej szalce Petriego. Wykonaj kroki 1-4. Zamiast hodować komórki w świetle fluorescencyjnym, komórki mogą być hodowane podczas montażu na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
	<li>Obrazuj komórki co 5-10 minut, aby jak najlepiej uchwycić ruch komórek. Koraliki fluorescencyjne są widoczne przy użyciu zestawu filtrów FITC, ale w przypadku skoncentrowanych kulek należy użyć kanału jasnego pola. Można ustawić oświetlenie zewnętrzne (lampę) lub światło z samego mikroskopu można wykorzystać do dostarczenia energii do wzrostu i ruchu komórek. W mikroskopie Olympus Ix83 dobrze sprawdza się moc 5-6 V dla lampy trans. Może to wymagać prób i błędów w twoim systemie.</li>
</ol>
7. Korelacyjna analiza strukturalna ściany komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
UWAGA: Zmienione cechy ściany komórkowej obserwowane w żywych komórkach oznaczonych przeciwciałami specyficznymi dla komórki mogą być obrazowane w celu uzyskania szczegółowych cech za pomocą SEM. To podejście korelacyjne pozwala na uzyskanie danych ultrastrukturalnych, które można porównać z danymi fluorescencyjnymi.
<ol>
	<li>Otrzymać 1 ml zawiesiny komórkowej (kontrolnej lub poddanej obróbce doświadczalnej) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 4 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zanurz probówkę zawierającą osad w ciekłym azocie lub, jeśli nie jest dostępna, umieść ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Zamrożone komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>W czasie przetwarzania ściany komórkowej wyjmij probówkę z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia przez 15 minut. Ponownie zawiesić osad w 20 μl WHM i umieścić kroplę gęstej zawiesiny komórkowej na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 45 mm x 50 mm.</li>
	<li>Umieść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli, aby stworzyć kanapkę. Umieść na stole laboratoryjnym i ciągle dociskaj kanapkę, aby rozerwać komórki (np. 30 s).</li>
	<li>Ostrożnie oddzielić szklane szkiełka nakrywkowe i umyć pęknięte komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 500 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odlej sklarowany osad. Pellet powinien być biały lub lekko zielony. Jeśli kolejne obrazowanie wykaże, że wystarczająca liczba komórek nie została rozerwana, powtórz krok 3 z osadem w tym miejscu.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający ściany komórkowe w D-H2O i powtórzyć kroki 7.4 i 7.5. Zawiesić osad w 100 μlDH2O i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zaopatrz się w króciec Cambridge (promień 6 mm lub 8 mm) i przyklej taśmę węglową (EMS) do jego powierzchni. Następnie umieść 5 μl kropli zawieszonego zawiesiny ściany komórkowej (krok 7) na taśmie węglowej. Obserwuj liczbę ścian komórkowych za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Jeśli zawiesina jest zbyt gęsta, rozcieńczyć ją D-H2O.</li>
	<li>Umieść kikut w przykrytym pojemniku i pozostaw do wyschnięcia (2 godziny do nocy). Napylaj króciec przez 50 s za pomocą tarczy palladowej (można również zastosować inne cele). Obserwuj ogniwa pod napięciem 5 kV, wielkości plamki, w odległości 10 cm od wtórnego detektora elektronów. 
	UWAGA: Rozcieńczenie zawiesiny ściany komórkowej przed osadzeniem kropli na taśmie węglowej ograniczy osadzanie się ścian komórkowych na sobie.</li>
</ol>

<ol><li>Delmer, D., Dixon, R. A., Keegstra, K., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall-dynamic%2C+strong%2C+and+adaptable-is+a+natural+shapeshifter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall-dynamic, strong, and adaptable-is a natural shapeshifter.</a> Plant Cell. 36 (5), 1257-1311 (2024).</li>
<li>Bierenbroodspot, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+evolution+of+streptophyte+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and evolution of streptophyte algae.</a> Ann Bot. 134 (3), 385-400 (2024).</li>
<li>Domozych, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane+architecture+and+dynamics+during+secretion+of+the+extracellular+matrix+of+the+unicellular+charophyte%2C+Penium+margaritaceum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Endomembrane architecture and dynamics during secretion of the extracellular matrix of the unicellular charophyte, Penium margaritaceum.</a> J Exp Bot. 71 (11), 3323-3339 (2020).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+multicellular+algal+sisters+to+land+plants+illuminate+signaling+network+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomes of multicellular algal sisters to land plants illuminate signaling network evolution.</a> Nat Genet. 56 (5), 1018-1031 (2024).</li>
<li>Jiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Penium+margaritaceum+genome%3A+Hallmarks+of+the+origins+of+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Penium margaritaceum genome: Hallmarks of the origins of land plants.</a> Cell. 181, 1097-1111 (2020).</li>
<li>LoRicco, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+roles+of+the+extracellular+matrix+in+the+sessile+life+of+the+zygnematophyte+Penium+margaritaceum%3A+stick%2C+glide+and+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologie+Plantarum%22%5BJournal%5D)">The multifunctional roles of the extracellular matrix in the sessile life of the zygnematophyte Penium margaritaceum: stick, glide and cluster.</a> Physiologie Plantarum. 176 (5), e14520(2024).</li>
<li>LoRicco, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+growth+and+expansion+in+Penium+margaritaceum+triggered+by+disruption+of+microtubules+and+the+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Aberrant growth and expansion in Penium margaritaceum triggered by disruption of microtubules and the cell wall.</a> J Exp Bot. erae387, (2024).</li>
<li>LoRicco, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+phenotype+plasticity+in+the+unicellular+zygnematophyte%2C+Penium+margaritaceum%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Chemically induced phenotype plasticity in the unicellular zygnematophyte, Penium margaritaceum.</a> Protoplasma. 261 (6), 1233-1249 (2024).</li>
<li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callose+deposition+is+essential+for+the+completion+of+cytokinesis+in+the+unicellular+alga%2C+Penium+margaritaceum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Callose deposition is essential for the completion of cytokinesis in the unicellular alga, Penium margaritaceum.</a> J Cell Sci. 133 (19), jcs.249599(2020).</li>
<li>Rydahl, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penium+margaritaceum+as+a+model+organism+for+cell+wall+analysis+of+expanding+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Penium margaritaceum as a model organism for cell wall analysis of expanding plant cells.</a> Methods Mol Biol. 1242, 1-22 (2015).</li>
<li>Carrillo-Carrasco, V. P., Hernández-García, J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+proteins+in+Penium+margaritaceum+and+other+zygnematophycean+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of proteins in Penium margaritaceum and other zygnematophycean algae.</a> Physiol Plant. 175 (6), e14121(2023).</li>
<li>Nichols, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+media-freshwater%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+Phycol+Methods%22%5BJournal%5D)">Growth media-freshwater.</a> Handbook Phycol Methods. , 16-17 (1973).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

P. margaritaceum jest organizmem skutecznym w wyjaśnianiu dynamiki rozwoju ściany komórkowej i wydzielania ECM u roślin i glonów paciorkowcowych. Główne atrybuty obejmują jednokomórkowy pokrój i łatwość w utrzymaniu hodowli i eksperymentalnej manipulacji, pierwotną ścianę komórkową z wyraźną zewnętrzną siatką pektynową i innymi polimerami, łatwość znakowania żywych komórek za pomocą mAb skierowanych na ścianę komórkową, które można śledzić na czas dla kolejnych badań rozwojowych i / lub eksperymentalnych oraz pr...

Ściana komórkowa rośliny to złożona sieć polimerowa, która pełni wiele ról w życiu komórki roślinnej1. Integralność ściany komórkowej jest stale monitorowana przez komórkę podczas rozwoju i w odpowiedzi na stres środowiskowy i odpowiednio moduluje się pod względem chemicznym i strukturalnym. Penium margaritaceum to jednokomórkowa zielona alga, która została ostatnio wykorzystana w badaniach glonów Streptophyte (Streptophyta, grupa zielonych alg najbliżej spokrewnionych i przodków roślin lądowych2).
W ciągu ostatnich dwóch dekad P. margaritaceum był ważnym organizmem w badaniach dynamiki ściany komórkowej i macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywności systemu endomembranowego, manifestacji kształtu komórki i ewolucji roślin3,4,5,6,7,8,9,10,11. Celem tej pracy jest dostarczenie badaczom zajmującym się ścianą komórkową roślin podstawowych metod hodowli P. margaritaceum, eksperymentalnego manipulowania nią za pomocą technik opartych na mikropłytkach oraz monitorowania struktury jej ściany komórkowej za pomocą znakowania immunocytochemicznego żywych komórek i obrazowania za pomocą technik mikroskopii świetlnej i elektronowej. P. margaritaceum ma wiele podobieństw w biochemii ściany komórkowej do pierwotnych ścian komórkowych roślin lądowych. Opracowaliśmy wiele protokołów, które wykorzystują unikalny jednokomórkowy fenotyp tej algi i zapewniają szybki sposób badania dynamiki ściany komórkowej, która często jest trudna do monitorowania w roślinach wielokomórkowych. Techniki te będą pomocne dla biologów ścian komórkowych roślin, którzy chcą wyjaśnić szczegółową dynamikę ściany komórkowej, zwłaszcza tych zajmujących się pektynami, i posłużą jako punkt wyjścia do badań zajmujących się biologią komórek glonów roślinnych i paciorkowców.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml mikrocenta. Rurki</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-740</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa mikropłytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-233-6077</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 45x50 cm</td><td>Brain Research</td><td>4550-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>przeciw szczurom FITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6258</td><td></td></tr><tr><td>przeciw szczurom TRITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4280</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4981</td><td></td></tr><tr><td>Klocki Cambbridge</td><td>EMS</td><td>75183-65</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview CLSM</td><td>Ewident</td><td>Fluoview 1200</td><td></td></tr><tr><td>JIM5</td><td>Kerafast</td><td>ELD004</td><td></td></tr><tr><td>JIM7</td><td>Kerafast</td><td>ELD005</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>BioRad</td><td>1660499EDU</td><td></td></tr><tr><td>Penium margaritaceum&nbsp; </td><td>Sammlung von Algenkulturen der Universit&auml; t G&ouml; ttingen&nbsp;- Kolekcja Kultur Glonów w G&ouml; ttingen University</td><td>2640</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw polisferyczny</td><td>Polysciences</td><td>18336</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>ThermoFisher</td><td>Quattro SEM</td><td></td></tr><tr><td>napylarka napylająca</td><td>EMS</td><td>Q150V</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla penium margaritaceum

Experimental Screening Protocols, Immunocytochemistry and Microscopy-based Imaging Techniques for Penium margaritaceum

Ściana komórkowa jest pierwszym składnikiem odbioru/transdukcji sygnału dla komórki roślinnej podczas rozwoju i podczas reagowania na środowiskowe stresory abiotyczne i biotyczne. Komórka stale monitoruje integralność swojej ściany komórkowej i moduluje ją w odpowiedzi na stres. Wyjaśnienie specyficznych modulacji strukturalnych i biochemicznych zachodzących w ścianie komórkowej jest trudnym zadaniem, zwłaszcza w przypadku stosowania roślin wielokomórkowych i ich narządów/tkanek. Wynika to z ograniczeń co do tego, co można rozwiązać w pojedynczej komórce, która jest częścią złożonej sieci wielokomórkowej. Jednokomórkowa alga paciorkowa, Penium margaritaceum, została ostatnio wykorzystana w badaniach dynamiki pektyn, plastyczności fenotypowej opartej na ścianie komórkowej i wielu aspektach biologii komórek glonów. Jego prosty fenotyp, wyraźna ściana komórkowa, która ma wiele elementów szczególnie podobnych do ścian komórkowych roślin lądowych, oraz łatwość w badaniach immunocytochemicznych i eksperymentalnych sprawiają, że jest to potężny organizm modelowy w biologii ściany komórkowej roślin. Celem tego badania jest dostarczenie podstawowych technik hodowli, manipulacji eksperymentalnej i badań przesiewowych stosowanych stresorów. Protokoły badań przesiewowych w zakresie immunocytochemii, obrazowania w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej i obrazowania struktury ściany komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Podobnie, wiele z opisanych technik może być modyfikowanych dla szerokiego wachlarza innych badań komórkowych i molekularnych.

Znakowanie ściany komórkowej P. margaritaceum przeciwciałami monoklonalnymi anty-pektynowymi (np. JIM5) ujawnia sieć włókien i wypustek kompleksowanych wapniem, które tworzą regularny wzór lub kratownicę (Rycina 1). Pektyna jest odkładana w centrum komórki lub w przesmyku, gdzie wypycha starszą pektynę w stronę biegunów (Rycina 2). Znakowanie innym przeciwciałem pektynowym, takim jak JIM7, uwydatnia początkową sekrecję wysoko zmetylowanej pektyny w wąsk...

Ten raport opisuje podstawowe metody używane do hodowli i eksperymentalnego manipulowania jednokomórkową streptophyte alg, Penium margaritaceum. Zapewnia również podstawowe protokoły obrazowania opartego na mikroskopii, w tym znakowanie żywych komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych i innych sond fluorescencyjnych oraz skaningową mikroskopię elektronową.

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

The cell wall is the first component of signal reception/transduction for a plant cell during development and when responding to environmental abiotic and ...

Nasze badania koncentrują się na roli ściany komórkowej w utrzymaniu kształtu komórki i reagowaniu na stres zewnętrzny. Używamy szeregu technik mikroskopii świetlnej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do obrazowania struktury ściany komórkowej w żywych komórkach oraz mikroskopii elektronowej do obrazowania ścian komórkowych w wysokiej rozdzielczości.Brakuje obecnych transformowanych linii komórkowych dla glonów streptofitowych eksprymujących specyficzne białka subkomórkowe w celu podkreślenia dynamiki ściany komórkowej. Wymaga to następnie użycia przeciwciał i innych sond fluorescencyjnych do badań. Ściana komórkowa penisa reaguje na różne formy stresu abiotycznego i biotycznego, a to prowadzi do plastyczności fenotypowej. Odkryliśmy, że pektyny ściany komórkowej są ważną częścią tego procesu. Jednokomórkowy fenotyp i zdolność do znakowania żywych komórek za pomocą Penium daje biologom roślin możliwość zagłębienia się w strukturę i rozwój ściany komórkowej.[Instruktor] Aby rozpocząć, usuń pięć mililitrów aktywnie rosnących płynnych kultur komórkowych Penium margaritaceum. Przenieś do 15-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej, a następnie odwiruj. Po wylaniu supernatantu ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach świeżego WHM. Mocno dokręć nakrętkę probówki i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe z powierzchni ściany komórkowej. Po ostatnim myciu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego WHM, a następnie przenieść 200 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek. Odwirować probówki z nakrętkami w mikrowirówce o stężeniu 1000 G przez jedną minutę, następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego WHM. Następnie dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego do zawiesiny komórkowej i dobrze wiruj. Następnie zawiń probówkę w folię aluminiową i inkubuj ją na rotatorze laboratoryjnym przez 90 minut. Odwirować zawiesinę, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżego WHM przed wirowaniem przez 10 sekund. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach WHM i dodać osiem mikrolitrów koziego środka przeciw szczurom TRITC lub FITC. Na koniec ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej. Zakryj probówkę i zawiń ją w folię aluminiową, aż będzie gotowa do obrazowania. Rozcieńczyć komórki znakowane przeciwciałem JIM5 dziesięciokrotnie w WHM. Dodać 50 mikrolitrów kropli rozcieńczonej zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe. Inkubuj komórki przez dwie minuty w ciemności, aby umożliwić przyleganie komórek, a następnie ostrożnie odpipetuj jeden mililitr WHM kroplami, aby wypłukać wszelkie nieprzylegające komórki. Dodaj 30 mikrolitrów WHM na wierzch dołączonych komórek. Na kroplę nałożyć 30 mikrolitrów ciepłej 4% agarozy w WHM i pozostawić do zestalenia. W przypadku próbek na szalce Petriego dodaj tyle WHM, aby całkowicie pokryć komórki zanurzone w agarozie. W przypadku komórek na szkiełku nakrywkowym należy odwrócić szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieścić je na szkiełku wgłębieniowym wypełnionym WHM. Zamontuj przygotowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ustaw zewnętrzną lampę lub użyj wbudowanego oświetlenia mikroskopu, aby wspomóc wzrost i ruch komórek. Rób obrazy co 10 do 30 minut za pomocą zestawu filtrów TRITC do śledzenia rozbudowy ściany komórkowej. Przygotuj probówkę zawierającą pięć mililitrów umytych 10-14-dniowych kultur komórkowych. Następnie dodaj około 100 mikrolitrów fluorescencyjnych kulek o średnicy 0,75 mikrometra do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Odpipetuj jeden mililitr WHM do probówki i energicznie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić kulki. Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 G przez trzy minuty. Zawiesić końcowy granulat w 500 mikrolitrach WHM. Następnie odpipetować jeden mililitr pożywki WHM do każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Dodaj inhibitory lub regulatory wzrostu, aby osiągnąć pożądane stężenie i delikatnie zakręć płytką. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu kulek i delikatnie zamieszaj ponownie, aby wymieszać, a następnie dodaj 10 mikrolitrów umytych komórek do każdej studzienki przed wymieszaniem. Inkubować płytkę przez 24 godziny w świetle. Nie naruszając płytki, umieść ją na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC. Odpipetować jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirować probówkę o stężeniu 4 000 G przez jedną minutę. Po odrzuceniu supernatantu zanurzyć probówkę zawierającą osad w ciekłym azocie lub zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić rozmrożony pellet w 20 mikrolitrach WHM. Umieścić kroplę gęstej zawiesiny komórkowej na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 45 na 50 milimetrów. Umieść drugi szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli, aby stworzyć kanapkę. Naciskaj w sposób ciągły na kanapkę przez 30 sekund, aby rozerwać komórki. Ostrożnie oddziel szkiełka nakrywkowe. Dodaj WHM na szkiełka przykrywkowe, aby umyć pęknięte komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować. Zbadać biały lub lekko zielony osad po odrzuceniu supernatantu. Zawiesić osad zawierający ściany komórkowe w wodzie dejonizowanej. Po pęknięciu komórek i odwirowaniu ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach dejonizowanej wody przed przeniesieniem go do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie przymocuj taśmę węglową do powierzchni króćca Cambridge. Odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny zawieszonej ściany komórkowej na taśmę węglową. Użyj palladowego celu, aby rozpylić kikut przez 50 sekund po pozostawieniu go do wyschnięcia na noc. Obserwuj komórki o napięciu pięciu kilowoltów, z odpowiednią wielkością plamki umieszczoną 10 centymetrów od wtórnego detektora elektronów. Znakowanie ściany komórkowej P. margaritaceum przeciwciałami monoklonalnymi anty-pektynowymi ujawniło sieć włókien skompleksowanych z wapniem tworzących nieregularny wzór sieciowy. Pektyna została zdeponowana w środku komórki lub przesmyku, popychając starszą pektynę w kierunku biegunów. Znakowanie JIM7 wykazało, że pektyna o wysokiej estryfikacji metylowej była początkowo wydzielana w wąskim paśmie na przesmyku. Inne polimery w ścianie komórkowej, takie jak białko arabinogalaktanu, wykryto za pomocą przeciwciała monoklonalnego JIM13. Duże ilości zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych były wydzielane na zewnątrz ściany komórkowej, umożliwiając poślizg i agregację komórek. Techniki znakowania pozwoliły na ilościowe badania ściany komórkowej i ekspansji, integrując podejścia do obrazowania rozwojowego. Korelacyjne badania strukturalne wykazały, że typowa sieć pektynowa składała się z siatki włókien zakończonych na zewnątrz w różnych wypustkach. Leczenie wysokimi stężeniami wapnia przekształciło sieć pektynową w nieregularne złogi, co zaobserwowano w komórkach znakowanych JIM5. Kiedy ściany komórkowe traktowane wapniem badano pod skaningowym mikroskopem elektronowym, szczegółowo obserwowano zdezorganizowaną strukturę pektyn.

experimental-screening-protocols-immunocytochemistry-microscopy-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Analiza SEM jest skuteczną metodą pomagającą w identyfikacji gatunków lub dyskryminacji fenotypowej. Protokół ten opisuje metody badania określonych szczegółów morfologicznych trzech reprezentatywnych typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania cech wielu typów organizmów i tkanek.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Poznaj zaawansowane techniki mikroskopii i immunocytochemii do badania dynamiki ściany komórkowej w Penium margaritaceum. Metoda ta pozwala wizualizować zmiany pektyn w odpowiedzi na stres.

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum (Wideo) | JoVE Journal

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

Przeglądaj więcej filmów