Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

Nasze badania koncentrują się na roli ściany komórkowej w utrzymaniu kształtu komórki i reagowaniu na stres zewnętrzny. Używamy szeregu technik mikroskopii świetlnej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do obrazowania struktury ściany komórkowej w żywych komórkach oraz mikroskopii elektronowej do obrazowania ścian komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Brakuje obecnych transformowanych linii komórkowych dla glonów streptofitowych eksprymujących specyficzne białka subkomórkowe w celu podkreślenia dynamiki ściany komórkowej. Wymaga to następnie użycia przeciwciał i innych sond fluorescencyjnych do badań. Ściana komórkowa penisa reaguje na różne formy stresu abiotycznego i biotycznego, a to prowadzi do plastyczności fenotypowej. Odkryliśmy, że pektyny ściany komórkowej są ważną częścią tego procesu. Jednokomórkowy fenotyp i zdolność do znakowania żywych komórek za pomocą Penium daje biologom roślin możliwość zagłębienia się w strukturę i rozwój ściany komórkowej.

[Instruktor] Aby rozpocząć, usuń pięć mililitrów aktywnie rosnących płynnych kultur komórkowych Penium margaritaceum. Przenieś do 15-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej, a następnie odwiruj. Po wylaniu supernatantu ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach świeżego WHM. Mocno dokręć nakrętkę probówki i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe z powierzchni ściany komórkowej. Po ostatnim myciu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego WHM, a następnie przenieść 200 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowych probówek wirówek do mikrowirówek. Odwirować probówki z nakrętkami w mikrowirówce o stężeniu 1000 G przez jedną minutę, następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego WHM. Następnie dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego do zawiesiny komórkowej i dobrze wiruj. Następnie zawiń probówkę w folię aluminiową i inkubuj ją na rotatorze laboratoryjnym przez 90 minut. Odwirować zawiesinę, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżego WHM przed wirowaniem przez 10 sekund. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach WHM i dodać osiem mikrolitrów koziego środka przeciw szczurom TRITC lub FITC. Na koniec ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach pożywki wzrostowej. Zakryj probówkę i zawiń ją w folię aluminiową, aż będzie gotowa do obrazowania. Rozcieńczyć komórki znakowane przeciwciałem JIM5 dziesięciokrotnie w WHM. Dodać 50 mikrolitrów kropli rozcieńczonej zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe. Inkubuj komórki przez dwie minuty w ciemności, aby umożliwić przyleganie komórek, a następnie ostrożnie odpipetuj jeden mililitr WHM kroplami, aby wypłukać wszelkie nieprzylegające komórki. Dodaj 30 mikrolitrów WHM na wierzch dołączonych komórek. Na kroplę nałożyć 30 mikrolitrów ciepłej 4% agarozy w WHM i pozostawić do zestalenia. W przypadku próbek na szalce Petriego dodaj tyle WHM, aby całkowicie pokryć komórki zanurzone w agarozie. W przypadku komórek na szkiełku nakrywkowym należy odwrócić szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieścić je na szkiełku wgłębieniowym wypełnionym WHM. Zamontuj przygotowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ustaw zewnętrzną lampę lub użyj wbudowanego oświetlenia mikroskopu, aby wspomóc wzrost i ruch komórek. Rób obrazy co 10 do 30 minut za pomocą zestawu filtrów TRITC do śledzenia rozbudowy ściany komórkowej. Przygotuj probówkę zawierającą pięć mililitrów umytych 10-14-dniowych kultur komórkowych. Następnie dodaj około 100 mikrolitrów fluorescencyjnych kulek o średnicy 0,75 mikrometra do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Odpipetuj jeden mililitr WHM do probówki i energicznie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić kulki. Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 G przez trzy minuty. Zawiesić końcowy granulat w 500 mikrolitrach WHM. Następnie odpipetować jeden mililitr pożywki WHM do każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Dodaj inhibitory lub regulatory wzrostu, aby osiągnąć pożądane stężenie i delikatnie zakręć płytką. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu kulek i delikatnie zamieszaj ponownie, aby wymieszać, a następnie dodaj 10 mikrolitrów umytych komórek do każdej studzienki przed wymieszaniem. Inkubować płytkę przez 24 godziny w świetle. Nie naruszając płytki, umieść ją na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC. Odpipetować jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirować probówkę o stężeniu 4 000 G przez jedną minutę. Po odrzuceniu supernatantu zanurzyć probówkę zawierającą osad w ciekłym azocie lub zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić rozmrożony pellet w 20 mikrolitrach WHM. Umieścić kroplę gęstej zawiesiny komórkowej na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 45 na 50 milimetrów. Umieść drugi szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli, aby stworzyć kanapkę. Naciskaj w sposób ciągły na kanapkę przez 30 sekund, aby rozerwać komórki. Ostrożnie oddziel szkiełka nakrywkowe. Dodaj WHM na szkiełka przykrywkowe, aby umyć pęknięte komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować. Zbadać biały lub lekko zielony osad po odrzuceniu supernatantu. Zawiesić osad zawierający ściany komórkowe w wodzie dejonizowanej. Po pęknięciu komórek i odwirowaniu ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach dejonizowanej wody przed przeniesieniem go do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie przymocuj taśmę węglową do powierzchni króćca Cambridge. Odpipetować pięć mikrolitrów zawiesiny zawieszonej ściany komórkowej na taśmę węglową. Użyj palladowego celu, aby rozpylić kikut przez 50 sekund po pozostawieniu go do wyschnięcia na noc. Obserwuj komórki o napięciu pięciu kilowoltów, z odpowiednią wielkością plamki umieszczoną 10 centymetrów od wtórnego detektora elektronów. Znakowanie ściany komórkowej P. margaritaceum przeciwciałami monoklonalnymi anty-pektynowymi ujawniło sieć włókien skompleksowanych z wapniem tworzących nieregularny wzór sieciowy. Pektyna została zdeponowana w środku komórki lub przesmyku, popychając starszą pektynę w kierunku biegunów. Znakowanie JIM7 wykazało, że pektyna o wysokiej estryfikacji metylowej była początkowo wydzielana w wąskim paśmie na przesmyku. Inne polimery w ścianie komórkowej, takie jak białko arabinogalaktanu, wykryto za pomocą przeciwciała monoklonalnego JIM13. Duże ilości zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych były wydzielane na zewnątrz ściany komórkowej, umożliwiając poślizg i agregację komórek. Techniki znakowania pozwoliły na ilościowe badania ściany komórkowej i ekspansji, integrując podejścia do obrazowania rozwojowego. Korelacyjne badania strukturalne wykazały, że typowa sieć pektynowa składała się z siatki włókien zakończonych na zewnątrz w różnych wypustkach. Leczenie wysokimi stężeniami wapnia przekształciło sieć pektynową w nieregularne złogi, co zaobserwowano w komórkach znakowanych JIM5. Kiedy ściany komórkowe traktowane wapniem badano pod skaningowym mikroskopem elektronowym, szczegółowo obserwowano zdezorganizowaną strukturę pektyn.