Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu
August 29th, 2025
Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.
Badam, czy przenośne sekwencjonowanie długotrwałe może dostarczać wyników odporności na leki na gruźlicę w warunkach ograniczonych zasobów z dokładnością porównywalną z metodą złotych standardów, co przyspiesza dostępną, wysokiej jakości diagnostykę gruźlicy. Wykorzystanie celowanego sekwencjonowania nowej generacji jako narzędzia diagnostycznego gruźlicy opornej na leki, oferując kompleksowy profil oporności bezpośrednio z próbki klinicznej, bez wiedzy bioinformatycznej. Nasz protokół wykorzystujący sekwencjonowanie długiego odczytu ma potencjał, by zapewnić szybszy czas realizacji, prostszy przepływ pracy niż w przypadku wykrywania oporu w czasie rzeczywistym, ułatwić kompleksową diagnostykę gruźlicy oraz usprawnić śledzenie epidemii w środowisku o ograniczonych zasobach i minimalnej infrastrukturze.
Na początek oblicz 100 nanogramów każdej próbki amplikonu w zależności od stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej probówki PCR. Aby określić całkowitą masę amplikonów w próbce, użyj podane formuły. Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 mikrolitra przy użyciu wody wolnej od nukleazy.
Delikatnie mieszaj próbki, pipetując 10 razy w górę i w dół, a następnie krótko obracaj je w mikrowirówce. Następnie do każdej próbki należy dodać 1,75 mikrolitra buforu remontującego i reakcji adenylacyjnej do końca, a następnie 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów naprawiających i adenylacji. Po wymieszaniu i obracaniu próbek umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w 65 stopniach Celsjusza przez 30 minut.
Aby natywne ligowanie kodów kreskowych, dodaj komponenty widoczne na ekranie w nowych probówkach PCR. Delikatnie mieszaj reakcje, pipetując i krótko wirując w mikrowirówce. Następnie dodaj po jednym mikrolitrze EDTA do każdej probówki.
Następnie dokładnie wymieszaj i krótko zakręć, jak pokazano wcześniej. Włóż próbki z kodem kreskowym do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Vortex oczyszczający DNA zabiera kulki, aby całkowicie je zawiesować i dodać objętość równą 0,7 razy objętości zebranej próbki.
Wymieszaj roztwór z próbki kulki i inkubuj go na HulaMixerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, aby przygotować dwa mililitry etanolu 80%, wymieszaj 1 600 mikrolitrów czystego etanolu z 400 mikrolitrami wody wolnej od nukleazy. Umieść tubkę na magnetycznym stojaku na pięć minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
Następnie usuń i wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki. Umyj kulki 700 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu i krótko wiruj rurkę. Po umieszczeniu rurki na magnetycznym stojaku usuń resztki etanolu.
Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaku. Ponownie zawiesij kulki w 35 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy poprzez delikatne przetrząsanie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
Następnie przelej 35 mikrolitrów eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do dalszego użycia. Do ligacji adapterowej wymieszaj podane składniki w rurce mikrowirówki o niskim wiążeniu o pojemności 1,5 mililitra. Krótko wiruj probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Zrób vortex z koralikami oczyszczającymi DNA, aby całkowicie je zawiesić. Dodaj 20 mikrolitrów kulek do tubki i delikatnie wymieszaj. Inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aby osadzić kulki i zasysać supernatant bez zakłócania granulki. Dodaj 125 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów i delikatnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić kulki. Krótko wiruj i oddaj rurkę do magnetycznej stojaki.
Ponownie aspiruj supernatant po tym, jak kulki się rozbiją. Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 mikrolitrach buforu elucijnego, delikatnie pipetując lub stukając palcami. Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać zawartość, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyludzić DNA.
Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna. Następnie zasysaj 15 mikrolitrów eluatu i przelej go do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby przygotować roztwór do naprowadzania ogniwa przepływowego, dokładnie wymieszaj podane składniki.
Otwórz port zagładzający komórki przepływowej, zasysaj około 20 mikrolitrów buforu, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj 800 mikrolitrów mieszanki do środka bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby przygotować bibliotekę DNA, dokładnie wymieszaj komponenty wyświetlane na ekranie. Delikatnie podnieś korek kanału próbki komórki przepływowej, załaduj 200 mikrolitrów mieszanki do środka gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Po wymieszaniu przygotowanej biblioteki DNA należy załadować 75 mikrolitrów biblioteki kroplami do portu próbek komórek sekwencjonujących. Zamknij zakręt portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek bezpiecznie wchodzi do portu próbki, a następnie szczelnie zamknij port do próbki. Elektroforeza żelowa potwierdziła integralność amplikonu w niemal wszystkich próbkach, jednak ścieżki odpowiadające próbkom 89 i 136 wykazywały słabe lub brakujące pasma.
Próbki 89 i 136 miały niewystarczające stężenia amplikonów, co doprowadziło do ich wykluczenia z długiego odczytu sekwencjonowania. We wszystkich docelowych genach platformy długiego i krótkiego odczytu osiągnęły wysokie głębokości pokrycia, przy czym gen EIS wykazywał najwyższe wartości średnie, a gen RRS najniższą głębokość pokrycia. Pomimo szerokiego zakresu zasięgu, obie platformy utrzymały wysoki zakres pokrycia na poziomie 99,9% we wszystkich genach związanych z opornością.
Warianty oporności na leki dla ethambutolu, fluorochinolonów, kanamycyny, amikacyny i kapreomycyny wykryto z 100% zgodnością na platformach sekwencjonowania krótkich i długich odczytów. Nie stwierdzono mutacji związanych z opornością dla linezolidu, bedaquiliny i klofaziminy przy użyciu żadnego z metod sekwencjonowania. Wykrywanie oporności na streptomycynę wykazało niższą zgodność między platformami, z jedynie 71,43% zgody.
Czułość wykrywania kluczowych genów rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA i pncA wahała się od 89,47% do 96,77% na różnych platformach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada zastosowanie przenośnego sekwencjonowania długich odczytów do określania odporności na leki przeciwgruźlicze (TB) w warunkach ograniczonych zasobów. Protokół ma na celu zapewnienie dokładnych wyników porównywalnych ze standardami złotymi, poprawiając diagnostyczne metody dostępne w zakresie TB.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Genomika
- Choroby zakaźne
Tło
- Oporna na leki gruźlica jest znaczącym globalnym wyzwaniem zdrowotnym.
- Tradycyjne metody diagnostyczne mogą być ograniczone w warunkach ubogich w zasoby.
- Sekwencjonowanie długich odczytów oferuje potencjalne zalety w zakresie dokładności i czasu realizacji.
- Doświadczenie w bioinformatyce jest często barierą dla skutecznej diagnostyki.
Cel badania
- Ocenić skuteczność sekwencjonowania długich odczytów w diagnostyce TB.
- Zapewnić kompleksowy profil odporności z próbek klinicznych.
- Uprościć proces wykrywania oporności na leki.
Zastosowane metody
- Celowe sekwencjonowanie nowej generacji 18 regionów odporności na leki.
- Wykorzystanie specyficznego dla gruźlicy potoku bioinformatycznego.
- Przygotowanie próbek z dokładnym pomiarem amplikonów.
- Dostosowanie objętości próbek dla optymalnych wyników sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Sekwencjonowanie długich odczytów wykazało dokładność porównywalną ze standardami złotymi.
- Osiągnięto krótsze czasy realizacji w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Protokół umożliwił kompleksową diagnostykę gruźlicy.
- Możliwe było ulepszenie śledzenia epidemii w warunkach ograniczonych zasobów.
Wnioski
- Przenośne sekwencjonowanie długich odczytów może poprawić diagnostykę gruźlicy w warunkach ograniczonych zasobów.
- Metoda zmniejsza potrzebę rozległych umiejętności bioinformatycznych.
- To podejście ma potencjał do zmiany strategii zarządzania i kontroli gruźlicą.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
