Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

Badam, czy przenośne sekwencjonowanie długotrwałe może dostarczać wyników odporności na leki na gruźlicę w warunkach ograniczonych zasobów z dokładnością porównywalną z metodą złotych standardów, co przyspiesza dostępną, wysokiej jakości diagnostykę gruźlicy. Wykorzystanie celowanego sekwencjonowania nowej generacji jako narzędzia diagnostycznego gruźlicy opornej na leki, oferując kompleksowy profil oporności bezpośrednio z próbki klinicznej, bez wiedzy bioinformatycznej. Nasz protokół wykorzystujący sekwencjonowanie długiego odczytu ma potencjał, by zapewnić szybszy czas realizacji, prostszy przepływ pracy niż w przypadku wykrywania oporu w czasie rzeczywistym, ułatwić kompleksową diagnostykę gruźlicy oraz usprawnić śledzenie epidemii w środowisku o ograniczonych zasobach i minimalnej infrastrukturze.

Na początek oblicz 100 nanogramów każdej próbki amplikonu w zależności od stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej probówki PCR. Aby określić całkowitą masę amplikonów w próbce, użyj podane formuły. Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 mikrolitra przy użyciu wody wolnej od nukleazy.

Delikatnie mieszaj próbki, pipetując 10 razy w górę i w dół, a następnie krótko obracaj je w mikrowirówce. Następnie do każdej próbki należy dodać 1,75 mikrolitra buforu remontującego i reakcji adenylacyjnej do końca, a następnie 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów naprawiających i adenylacji. Po wymieszaniu i obracaniu próbek umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w 65 stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Aby natywne ligowanie kodów kreskowych, dodaj komponenty widoczne na ekranie w nowych probówkach PCR. Delikatnie mieszaj reakcje, pipetując i krótko wirując w mikrowirówce. Następnie dodaj po jednym mikrolitrze EDTA do każdej probówki.

Następnie dokładnie wymieszaj i krótko zakręć, jak pokazano wcześniej. Włóż próbki z kodem kreskowym do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Vortex oczyszczający DNA zabiera kulki, aby całkowicie je zawiesować i dodać objętość równą 0,7 razy objętości zebranej próbki.

Wymieszaj roztwór z próbki kulki i inkubuj go na HulaMixerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, aby przygotować dwa mililitry etanolu 80%, wymieszaj 1 600 mikrolitrów czystego etanolu z 400 mikrolitrami wody wolnej od nukleazy. Umieść tubkę na magnetycznym stojaku na pięć minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.

Następnie usuń i wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki. Umyj kulki 700 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu i krótko wiruj rurkę. Po umieszczeniu rurki na magnetycznym stojaku usuń resztki etanolu.

Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaku. Ponownie zawiesij kulki w 35 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy poprzez delikatne przetrząsanie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.

Następnie przelej 35 mikrolitrów eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do dalszego użycia. Do ligacji adapterowej wymieszaj podane składniki w rurce mikrowirówki o niskim wiążeniu o pojemności 1,5 mililitra. Krótko wiruj probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Zrób vortex z koralikami oczyszczającymi DNA, aby całkowicie je zawiesić. Dodaj 20 mikrolitrów kulek do tubki i delikatnie wymieszaj. Inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aby osadzić kulki i zasysać supernatant bez zakłócania granulki. Dodaj 125 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów i delikatnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić kulki. Krótko wiruj i oddaj rurkę do magnetycznej stojaki.

Ponownie aspiruj supernatant po tym, jak kulki się rozbiją. Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 mikrolitrach buforu elucijnego, delikatnie pipetując lub stukając palcami. Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać zawartość, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyludzić DNA.

Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna. Następnie zasysaj 15 mikrolitrów eluatu i przelej go do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby przygotować roztwór do naprowadzania ogniwa przepływowego, dokładnie wymieszaj podane składniki.

Otwórz port zagładzający komórki przepływowej, zasysaj około 20 mikrolitrów buforu, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj 800 mikrolitrów mieszanki do środka bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby przygotować bibliotekę DNA, dokładnie wymieszaj komponenty wyświetlane na ekranie. Delikatnie podnieś korek kanału próbki komórki przepływowej, załaduj 200 mikrolitrów mieszanki do środka gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Po wymieszaniu przygotowanej biblioteki DNA należy załadować 75 mikrolitrów biblioteki kroplami do portu próbek komórek sekwencjonujących. Zamknij zakręt portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek bezpiecznie wchodzi do portu próbki, a następnie szczelnie zamknij port do próbki. Elektroforeza żelowa potwierdziła integralność amplikonu w niemal wszystkich próbkach, jednak ścieżki odpowiadające próbkom 89 i 136 wykazywały słabe lub brakujące pasma.

Próbki 89 i 136 miały niewystarczające stężenia amplikonów, co doprowadziło do ich wykluczenia z długiego odczytu sekwencjonowania. We wszystkich docelowych genach platformy długiego i krótkiego odczytu osiągnęły wysokie głębokości pokrycia, przy czym gen EIS wykazywał najwyższe wartości średnie, a gen RRS najniższą głębokość pokrycia. Pomimo szerokiego zakresu zasięgu, obie platformy utrzymały wysoki zakres pokrycia na poziomie 99,9% we wszystkich genach związanych z opornością.

Warianty oporności na leki dla ethambutolu, fluorochinolonów, kanamycyny, amikacyny i kapreomycyny wykryto z 100% zgodnością na platformach sekwencjonowania krótkich i długich odczytów. Nie stwierdzono mutacji związanych z opornością dla linezolidu, bedaquiliny i klofaziminy przy użyciu żadnego z metod sekwencjonowania. Wykrywanie oporności na streptomycynę wykazało niższą zgodność między platformami, z jedynie 71,43% zgody.

Czułość wykrywania kluczowych genów rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA i pncA wahała się od 89,47% do 96,77% na różnych platformach.