Name: Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj sekwencjonowanie długiego odczytu do diagnostyki gruźlicy odpornej na leki w warunkach ograniczonych zasobów. Ta metoda zapewnia szybkie i dokładne wyniki bez zaawansowanej bioinformatyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy wyrazić szczere podziękowania Centrum SAMRC ds. Gruźlicy na Uniwersytecie w Stellenbosch za zapewnienie niezbędnych zasobów i udogodnień. Jesteśmy również głęboko wdzięczni badaniu TS ELiOT za dostarczenie próbek, które były integralną częścią tego badania.

Badania te zostały przeprowadzone w ramach projektu TS ELiOT, który uzyskał etyczną aprobatę od Komitetu ds. Etyki Badań Ludzkich (HREC) na Uniwersytecie w Stellenbosch (N21/09/093) 20 października 2021 roku. Dodatkowo uzyskała zgodę od Western Cape Health Research na korzystanie z obiektów rządowych. Próbki zostały zebrane we współpracy z NHLS Green Point i Uniwersytetem Stellenbosch, na podstawie numeru zatwierdzenia SU HREC N09/11/296. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Inaktywacja ciepła<ol>
		<li>Inkubować hodowle MGIT w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, aby osiągnąć całkowitą inaktywację cieplną w warunkach BSL-3.</li>
		<li>Przejdź do ekstrakcji DNA metodąInstaGene 29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA<ol>
		<li>Włóż 5 mL hodowli MGIT inaktywowanej termicznie do probówki 15 mL.</li>
		<li>Wirówka w dawce 4000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Ostrożnie usuń supernatant pipetowaniem, pozostawiając osad.</li>
		<li>Dodaj 200 μL odczynnika DNA do ekstrakcji chelatacyjnej do osadu i inkubuj w temperaturze 56 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Przelej roztwór do rurki z nakrętką o pojemności 2 mL i dodaj do każdej trzy szklane kulki o średnicy 2 mm.</li>
		<li>Przez 10 sekund rozproszyć komórki i umieścić rurki w inkubatorze w suchej kąpieli w temperaturze 100 °C na 8 minut.</li>
		<li>Homogenizuj próbki za pomocą homogenizatora do ubijania koralików w następujących ustawieniach: 3 cykle po 20 sekund przy 4,0 m/s.</li>
		<li>Wiruj w 12 000 x g przez 15 minut w RT i ostrożnie przelej 130 μL supernatantu (cieczy zawierającej DNA) do probówki o pojemności 1,5 mL, unikając osadów i zanieczyszczeń.</li>
		<li>Ponownie zawiesij koraliki przez przepychanie lub wirowanie i dodaj 156 μL koralików do probówki 1,5 mL zawierającej wyodrębnione DNA.</li>
		<li>Powoli pipetuj w górę i w dół 10 razy, żeby wymieszać i inkubować w RT przez 5 minut.</li>
		<li>Umieść rurki na magnetycznym stojaku na 5 minut, aby oddzielić kulki związane z DNA. UWAGA: Przezroczysty supernatant powinien pojawić się nad zwartym osadem ciemnych kulek magnetycznych po boku rurki skierowanej do magnesu, co wskazuje na gotowość do usunięcia supernatantu.</li>
		<li>Zdejmij nadmiar pipetą bez naruszania koralików.</li>
		<li>Dodaj 100 μL świeżo przygotowanego etanolu 80% do kulki na stojaku i odstaw na 30 sekund, a następnie usuń etanol. Powtórz proces mycia.</li>
		<li>Susz granulki na powietrzu w RT przez 5 minut. Upewnij się, że kulka jest matowa i nie pozostanie widoczna ciecz, zanim przejdziesz do kolejnego kroku.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z magnetycznej szafki.</li>
		<li>Dodaj 25 μL Nukleazy Wolnej Wody (NFW) bezpośrednio do suszonych kulek i zawiesisz je, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.</li>
		<li>Inkubuj w RT przez 5 minut.</li>
		<li>Wróć lampę do magnetycznego racku na kolejne 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś wyeludowane DNA (supernatant) do nowej probówki 1,5 mL.</li>
		<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą wysokoczułego fluorescencyjnego odczynnika ilościowego dsDNA. UWAGA: DNA można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub stosować PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzmacnianie (PCR)<ol>
		<li>Multipleks PCR i czyszczenie po PCR, zgodnie z instrukcjami producenta25.</li>
		<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą wysokoczułego fluorescencyjnego odczynnika ilościowego dsDNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza żelowa<ol>
		<li>Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 2%, rozpuszczając proszek agarozowy w buforze 1x TAE przez podgrzewanie w mikrofalówce, aż do całkowitego stopienia.</li>
		<li>Dodaj 5 μL nietoksycznego fluorescencyjnego żelu DNA do roztopionej agarozy i dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Wlej mieszankę żelową do tacy do odlewania żelu wyposażonej w grzebień, aby uformować wgłębienia.</li>
		<li>Pozwól żelowi zastygnąć w RT.</li>
		<li>Po zastygnięciu usuń grzebień i umieść pojemnik żelowy w zbiorniku elektroforezy wypełnionym buforem 1x TAE.</li>
		<li>Załaduj 5 μL drabiny DNA kb zmieszanej z 5 μL bufora obciążającego do pierwszego dołu.</li>
		<li>Dla każdego produktu PCR wymieszaj 5 μL produktu z 5 μL bufora obciążeniowego i załaduj do poszczególnych otworów.</li>
		<li>Uruchom żel na 100 V przez godzinę.</li>
		<li>Wizualizuj pasma DNA za pomocą systemu dokumentacji żelowej z transiluminacją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie biblioteki ONT
<ol>
	<li>Przygotowanie do końca<ol>
		<li>Oblicz 100 ng z każdej próbki amplikonu na podstawie stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej rurki PCR.</li>
		<li>Aby obliczyć całkowitą masę (w ng) amplikonów w danej próbce, pomnoży stężenie próbki (ng/μL) przez jej pozostałą objętość (μL) po kontroli jakości (QC). UWAGA: Na przykład, jeśli próbka ma stężenie 2 ng/μL i pozostałą objętość 1 μL po QC, całkowita masa ampliconu wynosi: Masa całkowita = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng Aby przygotować 10 ng amplikonów do sekwencjonowania, użyj wzoru rozcieńczenia: C1V1 = C2V2 Gdzie: C1 = 45 ng, V1 = nieznane, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 ×V 2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL Dlatego μL początkowej próbki ampliconu powinno posłużyć do uzyskania 10 ng DNA do sekwencjonowania.</li>
		<li>Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 μL za pomocą NFW.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj próbki, pipetując w górę i w dół 10 razy i krótko obracaj.</li>
		<li>Do każdej próbki dodaj 1,75 μL buforu reakcyjnego do naprawy końca i A-tailing oraz 0,75 μL mieszanki enzymów endrepair i A-tailing.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj, pipetując pipetami w górę i w dół 10 razy, a następnie krótko skręcaj.</li>
		<li>Inkubuj rurki w termocyklerze w temperaturze 25 °C przez 30 minut, a następnie w 65 °C przez 30 minut. UWAGA: Na tym etapie, jeśli użytkownik zdecyduje się przerwać proces, zaleca się użycie koralików do oczyszczania przygotowanego DNA. Oczyszczone DNA można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie siedem dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja kodów kreskowych natywnych<ol>
		<li>Rozmroz i przygotuj kulki magnetyczne do oczyszczania DNA i wyboru rozmiaru, koralików do czyszczenia paramagnetycznego DNA, EDTA oraz natywnych kodów kreskowych (NB01-96) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść je w lodzie.</li>
		<li>W nowych probówkach PCR dodaj kolejno: 2,75 μL wody wolnej od nukleazy, 1 μL DNA przygotowanego na zakończenie, 1,25 μL natywnych kodów kreskowych (NB01-96) oraz 5 μL mieszanki enzymów ligacyjnych DNA.</li>
		<li>Każdą reakcję wymieszaj przez delikatne pipetowanie 10 razy, krótko zakręć w mikrowirówce i inkubuj przez 20 minut w RT.</li>
		<li>Dodaj 1 μL EDTA do każdego dołka, dokładnie wymieszaj pipetowaniem i krótko zakręcaj.</li>
		<li>Próbki z kodem kreskowym w basenie umieszczone w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Ponownie zawiesij kulki oczyszczające DNA przez wirowanie i dodaj 0,7x całkowitą objętość zebranej próbki (np. dla 23 próbek o objętości 253 μL dodaj 177,1 μL koralików).</li>
		<li>Wymieszaj roztwór przez pipetowanie i inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w stanie RT.</li>
		<li>Przygotuj 2 mL etanolu 80%, mieszając 1600 μL czystego etanolu z 400 μL NFW.</li>
		<li>Umieść lampę na magnetycznym stojaku na 5 minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.</li>
		<li>Usuń i wyrzuć supernatant bez naruszania granulki.</li>
		<li>Umyj kulki świeżo przygotowanym 80% etanolem 700 μL, nie naruszając granulki, a następnie usuń i wyrzuć etanol.</li>
		<li>Powtórz krok mycia etanolem.</li>
		<li>Krótko wiruj rurkę, wracaj do magnetycznego stojaka i usuń resztki etanolu.</li>
		<li>Pozwól koralikom wyschnąć na powietrzu przez 30 sekund.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka, ponownie zawiesz kulki w 35 μL wodzie wolnej od nukleazy delikatnym przemieszczeniem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.</li>
		<li>Przelej 35 μL eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL na kolejne kroki. UWAGA: Na tym etapie biblioteka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja i czyszczenie adaptera<ol>
		<li>Przygotuj zestaw szybkiego odczynnika ligacji DNA zgodnie z instrukcjami producenta i umieść go w lodzie.</li>
		<li>Wymieszaj Native Adapter (NA) i Quick Ligase przez pipetowanie, a następnie umieść na lodzie.</li>
		<li>Rozmroź bufor elucijny (EB) w stanie RT, wiru, wiruj i umieść go na lodzie.</li>
		<li>Rozmraź Short Fragment Buffer (SFB) w stanie RT, rozkręć wir, wirować i umieścić na lodzie.</li>
		<li>W probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL o niskim wiązaniu wymieszaj następujące składniki: 30 μL zebranej próbki z kodem kreskowym, 5 μL Native Adapter (NA), 10 μL buforu reakcji szybkiego wiązania oraz 5 μL szybko działającej ligazy DNA T4.</li>
		<li>Delikatnie pipetuj do wymieszania, krótko wiruj i inkubuj przez 20 minut w RT.</li>
		<li>Ponownie zawiesijcie kulki oczyszczające DNA przez wirowanie i dodajcie 20 μL (0,4x) kulek do reakcji.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w RT.</li>
		<li>Osadz kulki na magnetycznym stojaku i zasysaj supernatant, nie naruszając granulki.</li>
		<li>Przemyj kulki, dodając 125 μL Short Fragment Buffer (SFB), ponownie zawiesij przez przepchnięcie, krótko wiruj i wróć do magnetycznej stojaki.</li>
		<li>Rozpuszczaj koraliki i aspiruj nadmiar; Powtórz ten krok mycia raz.</li>
		<li>Krótko wiruj, oddaj rurkę do magnetycznego stojaka i zasysaj resztki supernatantu.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 μL Buforu Elution (EB).</li>
		<li>Krótko wiruj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby wyluczyć DNA.</li>
		<li>Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, rozpuszczaj kulki do momentu, aż eluat stanie się przezroczysty i bezbarwny, a następnie wssaj 15 μL eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Określ 1 μL eluzji.</li>
		<li>Rozcieńcz bibliotekę do 20 fmol (oblicz za pomocą kalkulatora NEB) i użyj 12 μL z przygotowanej biblioteki 20 fmol do sekwencjonowania na komórce przepływowej R10.4.1. UWAGA: Biblioteka może być teraz przechowywana w temperaturze -20 °C, co pozwala na wielokrotne użytkowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podstawkowanie i załadowanie komórki przepływowej sekwencjonowania nanoporów<ol>
		<li>Rozmrażaj Bufor Sekwencjonujący (SB), Kulki Biblioteczne (LIB), Flow Cell Tether (FCT) i Flow Cell Flush (FCF) w RT, mieszaj je przez wirowanie i skręcaj.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę do płynu komórek, łącząc 5 μL albuminy surowicy bydłej (BSA, 50 mg/mL), 30 μL Flow Cell Tether (FCT) oraz 1170 μL Flow Cell Flush (FCF), mieszając roztwór przez inwersję i pipetowanie.</li>
		<li>Otwórz port gazujący komórki przepływowej, zasysaj ~20 μL bufora, aby usunąć pęcherzyki powietrza, załaduj 800 μL mieszanki do portu gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i odczekaj 5 minut.</li>
		<li>Przygotuj bibliotekę, mieszając 37,5 μL Buforu Sekwencjonującego (SB), 25,5 μL Bibliotecznych Kulek (LIB) lub Roztwóru Bibliotecznego (LIS) oraz 12 μL biblioteki DNA o masie 20 fmol w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, dokładnie mieszając przez pipetowanie.</li>
		<li>Ponownie załóż komorę przepływową, delikatnie podnosząc pokrywę portu próbki komórki przepływowej, ładując 200 μL mieszanki do portu gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i przygotowując bibliotekę do załadunku.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj przygotowaną bibliotekę przez pipetowanie i ładuj 75 μL biblioteki do portu próbek komórek sekwencjonujących krople, upewniając się, że każda kropla trafia do portu przed dodaniem kolejnej.</li>
		<li>Zamknij pokrywę portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek wchodzi do portu próbki komórki przepływowej, a następnie zamknij port do próbki komory.</li>
		<li>Podłącz przenośne urządzenie sekwencjonujące do komputera (z nieprzerwanym zasilaniem) i rozpocznij sekwencjonowanie za pomocą oprogramowania do sterowania i analizy sekwencjonującej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry oprogramowania UWAGA: Ta aplikacja programowa, opracowana przez ONT, jest wykorzystywana do kompleksowego zarządzania kolejnościami oraz generowania szczegółowych raportów.<ol>
		<li>Aby rozpocząć proces sekwencjonowania, wybierz opcję Start , a następnie Rozpocznij sekwencjonowanie. UWAGA: Następnie zostanie poproszony o wyznaczenie folderu do przechowywania plików i podanie nazwy dla swojego sekwencjonowania, na przykład "sequencing_run_1". Następnie kliknij Continue do ustawień , aby wybrać odpowiednią nazwę zestawu, np. library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, i dostosować pożądany czas działania, na przykład 20 h (maksymalny czas działania to 72 h).</li>
		<li>Następnie wybierz typ pliku wyjściowego, wybierając spośród opcji takich jak POD5 dla odczytów surowych wyjść oraz FASTQ dla wyjść bazowych. Następnie wybierz model FAST-Basecalling.</li>
		<li>Proszę zauważyć, że niektóre z domyślnych ustawień to częste skanowanie porów co 1,5 godziny, minimalny czas odczytu 200 bp oraz minimalny wynik jakości 8. Na koniec przejrzyj ustawienia i rozpocznij proces czytania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza po sekwencjonowaniu
<ol>
	<li>Wymagania systemowe UWAGA: Przewodnik po tworzeniu środowiska i analizie danych sekwencjonowania ampliconów Mycobacterium tuberculosis z wykorzystaniem pipeline'u ONT-TB-NF. Instrukcje są dostosowane zarówno do użytkowników Windows (przez WSL), jak i macOS.<ol>
		<li>Użyj następujących - System operacyjny: Windows 10/11 (z WSL2) lub macOS; Pamięć: Minimum 8 GB RAM (zalecane 16 GB); Pojemność: co najmniej 50 GB wolnej przestrzeni na dysku; Internet: Wymagany do pobierania pakietów i danych; Uprawnienia: Możliwość instalowania oprogramowania i zarządzania środowiskiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że masz następujące ustawienia środowiska: Użytkownicy Windows (używając WSL2). Włącz WSL2.<ol>
		<li>Otwórz PowerShell jako administrator i uruchom: wsl - install.</li>
		<li>Zrestartuj komputer po poleceniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj Ubuntu<ol>
		<li>Po ponownym uruchomieniu uruchom Microsoft Store, wyszukaj Ubuntu i zainstaluj preferowaną wersję (np. Ubuntu 22.04 LTS).</li>
		<li>Uruchom Ubuntu z menu Start .</li>
		<li>Utworz nową nazwę użytkownika i hasło UNIX, gdy pojawi się poproszona o to.</li>
		<li>Lista pakietów aktualizacji: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użytkownicy macOS<ol>
		<li>Zainstaluj Homebrew (jeśli nie jest jeszcze zainstalowany): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".</li>
		<li>Instalacja wymaganych pakietów: brew install git wget</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalacja Condy lub Mamby<ol>
		<li>Odwiedź stronę Miniconda do pobrania, aby pobrać odpowiedni instalator dla systemu operacyjnego.</li>
		<li>Aby zainstalować Minicondę, uruchom instalator i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie. Po zakończeniu instalacji proszę o ponowne uruchomienie terminala.</li>
		<li>Konfiguruj kanały Conda: Conda config --add channels defaults Conda config --add channels bioconda Conda config --Add channels conda-forge</li>
		<li>Instalacja Mambaforge (Mamba) Dla Linuksa: wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh Dla macOS: Wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh</li>
		<li>Zainstaluj Mambaforge: uderz Mambaforge-*.sh</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zakończyć instalację i zrestartuj terminal, aby aktywować Mamba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakładanie potoku ONT-TB-NF<ol>
		<li>Stwórz nowe środowisko Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda</li>
		<li>Alternatywnie, użyj Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda</li>
		<li>Aktywuj środowisko: aktywuj ont_tb_env</li>
		<li>Zainstaluj Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | Bash, Sudo MV Nextflow /usr/local/bin/</li>
		<li>Sklonuj repozytorium ONT-TB-NF: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git cd ONT-TB-NF</li>
		<li>Pobierz wymagane obrazy Docker (jeśli używasz Dockera) docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12 Docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie potoku<ol>
		<li>Łącz pliki Basecalled FASTQ każdego z próbek niezależnie, używając następującego polecenia. Kot *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz NextFlow uruchom run_tb_amplicon.nf \ read_fq /ścieżka/do/concatenated.fastq.gz \ sample_name SAMPLE_ID \ amplicon_bed /ścieżka/do/amplicon_regions.łóżka \ Nici 16 \ output_dir /absolute/path/to/output_directory</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pliki wyjściowe i interpretacja<ol>
		<li>Po pomyślnym uruchomieniu upewnij się, że potok generuje następujące wyjścia w określonym katalogu wyjściowym:<ol>
			<li>Odczyty wyrównane: pliki *.bam.</li>
			<li>Wywołania wariantów: *.vcf plików zawierających SNP i indele.</li>
			<li>Raporty podsumowujące: pliki *.csv lub *.tsv podsumowujące mutacje oporności na leki oraz inne istotne wskaźniki.</li>
			<li>Raporty kontroli jakości: pliki *.htmL generowane przez narzędzia takie jak MultiQC.</li>
			<li>Logi: Szczegółowe logi wykonania potoku.</li>
			<li>Pliki pośrednie: przechowywane w katalogu roboczym/(można je usunąć po pomyślnym uruchomieniu). UWAGA: W przypadku napotykania błędów uprawnień niezbędne jest zweryfikowanie, czy posiada się odpowiednie uprawnienia do odczytu i zapisu plików, a także do wykonywania skryptów. W kwestii środowiskowych prosimy o uruchomienie odpowiedniego środowiska Conda przed uruchomieniem rurociągu. Dla osób korzystających z profili Dockera konieczne jest potwierdzenie, że Docker jest zarówno zainstalowany, jak i działający. Dodatkowo należy skrupulatnie monitorować zasoby systemowe, aby uniknąć ograniczeń pamięci lub pamięci podczas działania. Przegląd tych metodologii przedstawiono na Rysunku 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tuberculosis report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Baltimore+Health+News%22">Baltimore Health News</a>. , WHO. (2022).</li>
<li>WHO Malaria Department report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+20-23%22">Report 20-23</a>. , WHO. (2023).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+End+Strategy+TB%22">The End Strategy TB</a>. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).</li>
<li>Cabibbe, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+targeted+nextgeneration+sequencing+assay+on+a+portable+sequencing+platform+for+culturefree+detection+of+drugresistant+tuberculosis+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).</li>
<li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culturefree+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+antituberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>NG, K. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+well+do+routine+molecular+diagnostics+detect+Rifampin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin.</a> J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).</li>
<li>MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+molecular+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in molecular diagnosis of tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).</li>
<li>Sibandze, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+diagnostics+of+tuberculosis+resistance+by+targeted+stool+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing.</a> Genome Med. 14 (1), 42(2022).</li>
<li>Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+laboratory+costs+of+rapid+molecular+tests+and+conventional+diagnostics+for+detection+of+tuberculosis+and+drugresistant+tuberculosis+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa.</a> BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).</li>
<li>Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nextgeneration+sequencing+technologies%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nextgeneration sequencing technologies: An overview.</a> Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).</li>
<li>Pervez, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+of+performance+of+nextgeneration+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms.</a> Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).</li>
<li>Tafess, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetedsequencing+workflows+for+comprehensive+drug+resistance+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+cultures+using+two+commercial+sequencing+platforms%3A+Comparison+of+analytical+and+diagnostic+performance%2C+turnaround+time%2C+and+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost.</a> Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).</li>
<li>Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+rapid+communication%22">WHO rapid communication</a>. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).</li>
<li>Hazra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+wholegenome+sequencing+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+treatment+outcomes+for+MDRTB%2FXDRTB%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review.</a> Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).</li>
<li>Shea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+wholegenome+sequencing+and+reporting+of+drug+resistance+profiles+on+clinical+cases+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+New+York+State%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State.</a> J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).</li>
<li>Meehan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+of+Mycobacterium+tuberculosis%3A+Current+standards+and+open+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).</li>
<li>Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+and+accurate+genetic+variant+identification+from+contaminated+and+lowcoverage+Mycobacterium+tuberculosis+whole+genome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data.</a> Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+the+third+edition+of+WHO+consolidated+guidelines+on+tuberculosis%3A+Module+3%3A+Diagnosis%3A+Rapid+diagnostics+for+tuberculosis+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Antituberc%22%5BJournal%5D)">Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection.</a> Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).</li>
<li>Kambli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nextgeneration+sequencing+directly+from+sputum+for+comprehensive+genetic+information+on+drugresistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).</li>
<li>Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Rapid+Communication%22">Rapid Communication</a>. , WHO. 1-8 (2023).</li>
<li>Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+assays+for+the+diagnosis+of+drugresistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis.</a> Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).</li>
<li>Dippenaar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+for+Mycobacterium+tuberculosis%3A+A+critical+review+of+the+literature%2C+new+developments%2C+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities.</a> J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).</li>
<li>Chan, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+economical+drug+resistance+profiling+with+nanopore+MinION+for+clinical+specimens+with+low+bacillary+burden+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis.</a> BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).</li>
<li>Feuerriegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genomic+first+and+secondline+drug+resistance+prediction+from+clinical+Mycobacterium+tuberculosis+specimens+using+DeeplexMycTB%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB.</a> Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).</li>
<li>GenoScreen product brochure. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Deeplex+MycTB%22">Deeplex MycTB</a>. , GenoScreen. (2023).</li>
<li>Mtafya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+render+tuberculosis+samples+safe+for+application+of+tuberculosis+molecular+bacterial+load+assay+in+clinical+settings+without+a+biosafety+level+3+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory.</a> Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).</li>
<li>Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuganthi%2C+P+%22Research+Advances+in+Microbiology+and+Biotechnology%22">Research Advances in Microbiology and Biotechnology</a>. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).</li>
<li>consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+guideline%22">WHO guideline</a>. , WHO. (2022).</li>
<li>Williams, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrixbased+DNA+extraction+for+targeted+nextgeneration+sequencing+on+decontaminated+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples.</a> J Vis Exp. (181), e68147(2025).</li>
<li>Delahaye, C., Nicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+DNA+with+nanopores%3A+Troubles+and+biases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases.</a> PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+drugresistant+tuberculosis+genes+using+direct+PCR+amplification+and+Oxford+Nanopore+Technology+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing.</a> Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).</li>
<li>Tagliani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+nextgeneration+sequencingbased+drug+susceptibility+testing+unveil+high+levels+of+drugresistantTB+in+Djibouti%3A+Results+from+the+first+national+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey.</a> Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).</li>
<li>Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+nanopore+sequencing+for+clinical+diagnostics%3A+For+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).</li>
</ol>

Platforma sekwencjonowania długiego odczytu wykazała w tym badaniu znaczące zalety, zwłaszcza zdolność do szybkiego sekwencjonowania przy konsekwentnie dużej szerokości pokrycia. We wszystkich skutecznie zsekwencjonowanych izolatach osiągnięto szerokość pokrycia na poziomie 99,9%, co wskazuje na niemal pełną reprezentację regionów genomowych związanych z opornością. Średnia głębokość pokrycia wszystkich docelowych genów wynosiła 4462X, przy czym gen eis wykazywał najwyższą głębię 22 242,08X, a gen rrs n...

Gruźlica (TB) nadal jest główną przyczyną śmiertelności na całym świecie i stanowi stałe wyzwanie dla zdrowia publicznego, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach 1,2. Pomimo inicjatyw mających na celu wzmocnienie środków kontroli gruźlicy, postępy są powolne, częściowo z powodu trudności w osiągnięciu szybkich, precyzyjnych, kosztowo efektywnych i kompleksowych technik diagnostycznych 3,4,5. Chociaż molekularne metody diagnostyczne, takie jak testy liniowe (LPA) oraz zautomatyzowane testy amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), przyspieszyły identyfikację gruźlicy i lekoopornej gruźlicy (DR-TB), ich ograniczone wykrywanie mutacji ogranicza dokładne testy podatności na leki (DST). To ograniczenie jest szczególnie istotne w krajach o wysokim obciążeniu gruźlicą 6,7,8,9.
Aby rozwiązać te ograniczenia, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleciła zastosowanie technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), które stały się potężnymi narzędziami do monitorowania gruźlicy i wykrywania oporności10,11. Zarówno podejścia sekwencjonowania całego genomu (WGS), jak i celowanego NGS (tNGS) oferują szersze pokrycie mutacji, umożliwiając identyfikację wariantów związanych z opornością w wielu lekach 8,12,13,14,15. Chociaż sekwencjonowanie całego genomu (WGS) dostarcza kompleksowego raportu DST, jego uzależnienie od hodowli sprawia, że nie nadaje się do szybkiej diagnostyki, ponieważ hodowla może trwać do sześciu tygodni15, 16, 17. Ukierunkowane NGS oferuje lepszą alternatywę, ponieważ nie zależy od kultury; Sekwencjonowanie można wykonać bezpośrednio z próbek klinicznych18. W związku z tym WHO zaleciła stosowanie trzech testów tNGS dla DST: Deeplex Myc-TB test: Ten test wykrywa oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony, aminoglikozydy (amikacyna, kanamycynę, kapreomycynę), ethambutol, pirazynamid oraz etionamid 19,20,21. Test gruźlicy Sentinel: Celuje w oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony oraz leki drugiego wyboru wstrzykiwalne18,20. Test AQ-TB: Wskazuje oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony oraz leki drugiego wyboru do zastrzyków. Testy te zostały zoptymalizowane do pracy na platformie krótkich odczytów ze względu na wysoką dokładność20. Platformy długoodczytowe ONT MinION natomiast zapewniają dane w czasie rzeczywistym, przenośność oraz potencjał opłacalnej implementacji22,23. Jednak powszechne stosowanie NGS jest ograniczone przez wymagania infrastrukturalne i koszty, zwłaszcza w przypadku systemów krótkoodczytowych10.
Test Deeplex jest najbardziej kompleksowym z trzech zalecanych testów. Test został pierwotnie zaprojektowany do przeprowadzenia multipleksowego PCR na 18 obszarach związanych z opornością na 13 leków przeciwgruźlicy. Jednak WHO zaleciła go dla 10 leków przeciwgruźlicowych, co wskazuje na wystarczającą wrażliwość i swoistość. To badanie zoptymalizowało go do użycia z ONT MK1B MinION, platformą sekwencjonowania długiego odczytu. Przenośny i wielokrotnego użytku system komórek przepływowych tej platformy zmniejsza zarówno infrastrukturę, jak i potencjalne koszty sekwencjonowania na próbkę 4,22,23. Chociaż opracowano inne testy kompatybilne z długim odczytem, mają one zwykle ograniczony zakres DST, zwykle skierowane tylko do wąskiego zakresu genów oporności. Dla porównania, test oferuje szeroki zakres celów, co czyni go bardziej kompleksowym narzędziem diagnostycznym dla zdecentralizowanego DST24,25. Szczegółowa lista celów genomowych wzmocnionych przez test oraz ich powiązania leków znajduje się w Tabeli 1, podkreślającej możliwości diagnostyczne testu25.
Przed ekstrakcji DNA próbki muszą zostać zdekontaminowane i inaktywowane w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), zgodnie z niezbędnymi środkami bezpieczeństwa 25,26,27. W każdym przebiegu należy uwzględnić wewnętrzne wzmocnienie i zewnętrzne kontrole, a zanieczyszczenia śledzić poprzez negatywne kontrole i rutynowe oceny laboratoryjne25. Ważne metryki jakości, takie jak głębokość odczytu, szerokość zasięgu i skuteczność wzmacniania, powinny być oceniane po sekwencjoningu. Dla sekwencjonowania celowanego WHO zaleca minimalną głębokość odczytu 100x dla każdego ampliconu oraz odpowiednie pokrycie wszystkich obszarów docelowej oporności na leki, aby umożliwić wykrywanie drobnych wariantów obecnych na poziomie ≥5%28. Światowa Organizacja Zdrowia popiera te ukierunkowane metody sekwencjonowania do identyfikacji oporności na leki pierwszego i drugiego planu, zakładając, że systemy zapewnienia jakości są ustanowione oraz że wszystkie regiony docelowe są odpowiednio pokryte28.

<table><tbody><tr><td>15 mL & Rurki wiążące Lo-bining o pojemności 1,5 mL lub 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108051-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Drabina 1kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>2 mL rurki z nakrętką</td><td>Scientific Specialties Inc</td><td>P2TUB056C-0001.5ST</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szklane koraliki 2 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273627-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Bead</td><td>Beckman Colter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Deeplex Myc-TB&nbsp;</td><td>GenoScreen</td><td>20090205</td><td></td></tr><tr><td>Komora elektroforezy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet filtrujących (10 & micro; L)&nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-10-R</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet filtrujących (1000 i mikro; L)&nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-1000-R</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipety filtracyjne (20 & mikro; L)&nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-20-R</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet filtrujących (200 & micro; L)&nbsp;</td><td>Bio-Smart Scientific</td><td>FT-200-R</td><td></td></tr><tr><td>Flow-cell&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Eppendorf</td><td>5382000031</td><td></td></tr><tr><td>Macierz InstaGene</td><td>Bio-Rad</td><td>BBRD7326030</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny Rack&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Minion</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MK1B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kodowania kreskowego Native-barcode V14&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367</td><td></td></tr><tr><td>Moduł szybkiego ligowania NEBNext</td><td>NEB</td><td>E6056</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module</td><td>NEB</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleazy (NFW)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (P10, P20, P200 i P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000918-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do analizy qubitów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Zestaw Testowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33231</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Szczep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17852</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminator Universal Hood III (System Molecular Imager Gel Doc XR)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td></td></tr><tr><td>Mieszacz wirowy</td><td>Lasec</td><td>WMBB0L0E0216</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

Amplicon Sequencing using the Long-Read Sequencing Technologies

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) nadal podkreśla pilną potrzebę szybkiej, opłacalnej i przyjaznej dla użytkownika metody diagnostycznej gruźlicy (TB) oraz lekoopornej gruźlicy (DR-TB). Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS), zatwierdzone przez WHO, znacząco poprawiły wykrywanie DR-TB. Wśród nich ukierunkowane NGS (tNGS) umożliwiają ukierunkowane wykrywanie mutacji genetycznych związanych z opornością na leki, eliminując potrzebę tradycyjnej diagnostyki hodowlowej. Jeden z szeroko stosowanych testów tNGS zapewnia szybkie i kompleksowe testy podatności na leki, ale został przede wszystkim zoptymalizowany pod platformy sekwencjonowania z wysoką dokładnością. Jednak wysokie koszty tych systemów sekwencjonowania ograniczyły dostępność w krajach o niskich i średnich dochodach, szczególnie w całej Afryce. Przenośne technologie sekwencjonowania stanowią obiecującą alternatywę, oferując elastyczność i niższe wymagania infrastrukturalne. W tym badaniu DNA zostało wyekstrahowane z izolatów TB (RR-TB) opornych na ryfampicinę, amplifikowane za pomocą testu tNGS i sekwencjonowane na przenośnej platformie sekwencjonacyjnej. Te same produkty wzmacniające zostały również zsekwencjonowane na wysoko precyzyjnej platformie sekwencjonowania krótkich odczytów, aby służyć jako odniesienie. Dane z przenośnego sekwencera były przetwarzane za pomocą potoku bioinformatycznego zaprojektowanego do sekwencjonowania długiego odczytu, natomiast dane sekwencjonowania krótkiego odczytu analizowano za pomocą ugruntowanej aplikacji internetowej. Analiza wykazała, że podejście sekwencjonowania długiego odczytu skutecznie zidentyfikowało warianty związane z rezystancją wysokich częstotliwości wykrywane przez sekwencjonowanie krótkich odczytów, ale wykazywało ograniczenia w wykrywaniu wariantów niskoczęstotliwościowych.

Wybrana metoda ekstrakcji DNA została wybrana ze względu na jej efektywność i lepszą wydajność w porównaniu z innymi szybkimi metodami. Konsekwentnie generował wysokiej jakości genomowe DNA (gDNA), a integracja kroku oczyszczania opartego na koralikach pomogła zminimalizować czas przetwarzania i obniżyć koszty próbki. Osiągnięto to poprzez wyeliminowanie potrzeby dodatkowych ocen kontroli jakości, takich jak pomiary spektrofotometryczne, a fluorometria była jedynym narzędziem do ilościowania DNA. Stężenia po PCR okazały ...

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.

Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

The World Health Organization (WHO) continues to emphasize the urgent need for a rapid, cost-effective, and user-friendly diagnostic method for ...

Badam, czy przenośne sekwencjonowanie długotrwałe może dostarczać wyników odporności na leki na gruźlicę w warunkach ograniczonych zasobów z dokładnością porównywalną z metodą złotych standardów, co przyspiesza dostępną, wysokiej jakości diagnostykę gruźlicy. Wykorzystanie celowanego sekwencjonowania nowej generacji jako narzędzia diagnostycznego gruźlicy opornej na leki, oferując kompleksowy profil oporności bezpośrednio z próbki klinicznej, bez wiedzy bioinformatycznej. Nasz protokół wykorzystujący sekwencjonowanie długiego odczytu ma potencjał, by zapewnić szybszy czas realizacji, prostszy przepływ pracy niż w przypadku wykrywania oporu w czasie rzeczywistym, ułatwić kompleksową diagnostykę gruźlicy oraz usprawnić śledzenie epidemii w środowisku o ograniczonych zasobach i minimalnej infrastrukturze.Na początek oblicz 100 nanogramów każdej próbki amplikonu w zależności od stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej probówki PCR. Aby określić całkowitą masę amplikonów w próbce, użyj podane formuły. Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 mikrolitra przy użyciu wody wolnej od nukleazy.Delikatnie mieszaj próbki, pipetując 10 razy w górę i w dół, a następnie krótko obracaj je w mikrowirówce. Następnie do każdej próbki należy dodać 1,75 mikrolitra buforu remontującego i reakcji adenylacyjnej do końca, a następnie 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów naprawiających i adenylacji. Po wymieszaniu i obracaniu próbek umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w 65 stopniach Celsjusza przez 30 minut.Aby natywne ligowanie kodów kreskowych, dodaj komponenty widoczne na ekranie w nowych probówkach PCR. Delikatnie mieszaj reakcje, pipetując i krótko wirując w mikrowirówce. Następnie dodaj po jednym mikrolitrze EDTA do każdej probówki.Następnie dokładnie wymieszaj i krótko zakręć, jak pokazano wcześniej. Włóż próbki z kodem kreskowym do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Vortex oczyszczający DNA zabiera kulki, aby całkowicie je zawiesować i dodać objętość równą 0,7 razy objętości zebranej próbki.Wymieszaj roztwór z próbki kulki i inkubuj go na HulaMixerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, aby przygotować dwa mililitry etanolu 80%, wymieszaj 1 600 mikrolitrów czystego etanolu z 400 mikrolitrami wody wolnej od nukleazy. Umieść tubkę na magnetycznym stojaku na pięć minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.Następnie usuń i wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki. Umyj kulki 700 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu i krótko wiruj rurkę. Po umieszczeniu rurki na magnetycznym stojaku usuń resztki etanolu.Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaku. Ponownie zawiesij kulki w 35 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy poprzez delikatne przetrząsanie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.Następnie przelej 35 mikrolitrów eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do dalszego użycia. Do ligacji adapterowej wymieszaj podane składniki w rurce mikrowirówki o niskim wiążeniu o pojemności 1,5 mililitra. Krótko wiruj probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Zrób vortex z koralikami oczyszczającymi DNA, aby całkowicie je zawiesić. Dodaj 20 mikrolitrów kulek do tubki i delikatnie wymieszaj. Inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aby osadzić kulki i zasysać supernatant bez zakłócania granulki. Dodaj 125 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów i delikatnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić kulki. Krótko wiruj i oddaj rurkę do magnetycznej stojaki.Ponownie aspiruj supernatant po tym, jak kulki się rozbiją. Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 mikrolitrach buforu elucijnego, delikatnie pipetując lub stukając palcami. Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać zawartość, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyludzić DNA.Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna. Następnie zasysaj 15 mikrolitrów eluatu i przelej go do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby przygotować roztwór do naprowadzania ogniwa przepływowego, dokładnie wymieszaj podane składniki.Otwórz port zagładzający komórki przepływowej, zasysaj około 20 mikrolitrów buforu, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj 800 mikrolitrów mieszanki do środka bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby przygotować bibliotekę DNA, dokładnie wymieszaj komponenty wyświetlane na ekranie. Delikatnie podnieś korek kanału próbki komórki przepływowej, załaduj 200 mikrolitrów mieszanki do środka gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Po wymieszaniu przygotowanej biblioteki DNA należy załadować 75 mikrolitrów biblioteki kroplami do portu próbek komórek sekwencjonujących. Zamknij zakręt portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek bezpiecznie wchodzi do portu próbki, a następnie szczelnie zamknij port do próbki. Elektroforeza żelowa potwierdziła integralność amplikonu w niemal wszystkich próbkach, jednak ścieżki odpowiadające próbkom 89 i 136 wykazywały słabe lub brakujące pasma.Próbki 89 i 136 miały niewystarczające stężenia amplikonów, co doprowadziło do ich wykluczenia z długiego odczytu sekwencjonowania. We wszystkich docelowych genach platformy długiego i krótkiego odczytu osiągnęły wysokie głębokości pokrycia, przy czym gen EIS wykazywał najwyższe wartości średnie, a gen RRS najniższą głębokość pokrycia. Pomimo szerokiego zakresu zasięgu, obie platformy utrzymały wysoki zakres pokrycia na poziomie 99,9% we wszystkich genach związanych z opornością.Warianty oporności na leki dla ethambutolu, fluorochinolonów, kanamycyny, amikacyny i kapreomycyny wykryto z 100% zgodnością na platformach sekwencjonowania krótkich i długich odczytów. Nie stwierdzono mutacji związanych z opornością dla linezolidu, bedaquiliny i klofaziminy przy użyciu żadnego z metod sekwencjonowania. Wykrywanie oporności na streptomycynę wykazało niższą zgodność między platformami, z jedynie 71,43% zgody.Czułość wykrywania kluczowych genów rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA i pncA wahała się od 89,47% do 96,77% na różnych platformach.

amplicon-sequencing-using-the-long-read-sequencing-technologies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.

Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Poznaj sekwencjonowanie długiego odczytu do diagnostyki gruźlicy odpornej na leki w warunkach ograniczonych zasobów. Ta metoda zapewnia szybkie i dokładne wyniki bez zaawansowanej bioinformatyki.

Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

Przeglądaj więcej filmów