Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu
29 sierpnia 2025
Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.
Badam, czy przenośne sekwencjonowanie długotrwałe może dostarczać wyników odporności na leki na gruźlicę w warunkach ograniczonych zasobów z dokładnością porównywalną z metodą złotych standardów, co przyspiesza dostępną, wysokiej jakości diagnostykę gruźlicy. Wykorzystanie celowanego sekwencjonowania nowej generacji jako narzędzia diagnostycznego gruźlicy opornej na leki, oferując kompleksowy profil oporności bezpośrednio z próbki klinicznej, bez wiedzy bioinformatycznej. Nasz protokół wykorzystujący sekwencjonowanie długiego odczytu ma potencjał, by zapewnić szybszy czas realizacji, prostszy przepływ pracy niż w przypadku wykrywania oporu w czasie rzeczywistym, ułatwić kompleksową diagnostykę gruźlicy oraz usprawnić śledzenie epidemii w środowisku o ograniczonych zasobach i minimalnej infrastrukturze.
Na początek oblicz 100 nanogramów każdej próbki amplikonu w zależności od stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej probówki PCR. Aby określić całkowitą masę amplikonów w próbce, użyj podane formuły. Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 mikrolitra przy użyciu wody wolnej od nukleazy.
Delikatnie mieszaj próbki, pipetując 10 razy w górę i w dół, a następnie krótko obracaj je w mikrowirówce. Następnie do każdej próbki należy dodać 1,75 mikrolitra buforu remontującego i reakcji adenylacyjnej do końca, a następnie 0,75 mikrolitra mieszanki enzymów naprawiających i adenylacji. Po wymieszaniu i obracaniu próbek umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w 65 stopniach Celsjusza przez 30 minut.
Aby natywne ligowanie kodów kreskowych, dodaj komponenty widoczne na ekranie w nowych probówkach PCR. Delikatnie mieszaj reakcje, pipetując i krótko wirując w mikrowirówce. Następnie dodaj po jednym mikrolitrze EDTA do każdej probówki.
Następnie dokładnie wymieszaj i krótko zakręć, jak pokazano wcześniej. Włóż próbki z kodem kreskowym do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Vortex oczyszczający DNA zabiera kulki, aby całkowicie je zawiesować i dodać objętość równą 0,7 razy objętości zebranej próbki.
Wymieszaj roztwór z próbki kulki i inkubuj go na HulaMixerze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, aby przygotować dwa mililitry etanolu 80%, wymieszaj 1 600 mikrolitrów czystego etanolu z 400 mikrolitrami wody wolnej od nukleazy. Umieść tubkę na magnetycznym stojaku na pięć minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
Następnie usuń i wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki. Umyj kulki 700 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu i krótko wiruj rurkę. Po umieszczeniu rurki na magnetycznym stojaku usuń resztki etanolu.
Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaku. Ponownie zawiesij kulki w 35 mikrolitrach wody wolnej od nukleazy poprzez delikatne przetrząsanie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
Następnie przelej 35 mikrolitrów eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra do dalszego użycia. Do ligacji adapterowej wymieszaj podane składniki w rurce mikrowirówki o niskim wiążeniu o pojemności 1,5 mililitra. Krótko wiruj probówkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Zrób vortex z koralikami oczyszczającymi DNA, aby całkowicie je zawiesić. Dodaj 20 mikrolitrów kulek do tubki i delikatnie wymieszaj. Inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aby osadzić kulki i zasysać supernatant bez zakłócania granulki. Dodaj 125 mikrolitrów buforu krótkich fragmentów i delikatnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić kulki. Krótko wiruj i oddaj rurkę do magnetycznej stojaki.
Ponownie aspiruj supernatant po tym, jak kulki się rozbiją. Teraz wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 mikrolitrach buforu elucijnego, delikatnie pipetując lub stukając palcami. Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać zawartość, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby wyludzić DNA.
Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna. Następnie zasysaj 15 mikrolitrów eluatu i przelej go do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby przygotować roztwór do naprowadzania ogniwa przepływowego, dokładnie wymieszaj podane składniki.
Otwórz port zagładzający komórki przepływowej, zasysaj około 20 mikrolitrów buforu, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj 800 mikrolitrów mieszanki do środka bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby przygotować bibliotekę DNA, dokładnie wymieszaj komponenty wyświetlane na ekranie. Delikatnie podnieś korek kanału próbki komórki przepływowej, załaduj 200 mikrolitrów mieszanki do środka gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Po wymieszaniu przygotowanej biblioteki DNA należy załadować 75 mikrolitrów biblioteki kroplami do portu próbek komórek sekwencjonujących. Zamknij zakręt portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek bezpiecznie wchodzi do portu próbki, a następnie szczelnie zamknij port do próbki. Elektroforeza żelowa potwierdziła integralność amplikonu w niemal wszystkich próbkach, jednak ścieżki odpowiadające próbkom 89 i 136 wykazywały słabe lub brakujące pasma.
Próbki 89 i 136 miały niewystarczające stężenia amplikonów, co doprowadziło do ich wykluczenia z długiego odczytu sekwencjonowania. We wszystkich docelowych genach platformy długiego i krótkiego odczytu osiągnęły wysokie głębokości pokrycia, przy czym gen EIS wykazywał najwyższe wartości średnie, a gen RRS najniższą głębokość pokrycia. Pomimo szerokiego zakresu zasięgu, obie platformy utrzymały wysoki zakres pokrycia na poziomie 99,9% we wszystkich genach związanych z opornością.
Warianty oporności na leki dla ethambutolu, fluorochinolonów, kanamycyny, amikacyny i kapreomycyny wykryto z 100% zgodnością na platformach sekwencjonowania krótkich i długich odczytów. Nie stwierdzono mutacji związanych z opornością dla linezolidu, bedaquiliny i klofaziminy przy użyciu żadnego z metod sekwencjonowania. Wykrywanie oporności na streptomycynę wykazało niższą zgodność między platformami, z jedynie 71,43% zgody.
Czułość wykrywania kluczowych genów rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA i pncA wahała się od 89,47% do 96,77% na różnych platformach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje zastosowanie przenośnego sekwencjonowania długich odczytów w celu określenia wrażliwości na leki w przypadku gruźlicy (TB) w warunkach ograniczonych zasobów. Protokół ma na celu zapewnienie dokładnych wyników porównywalnych z metodami uznawanymi za złoty standard, co zwiększa dostępność diagnostyki gruźlicy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Genomika
- Choroby zakaźne
Wstęp
- Gruźlica lekooporna stanowi istotne globalne wyzwanie dla zdrowia publicznego.
- Tradycyjne metody diagnostyczne mogą być ograniczone w regionach z deficytem zasobów.
- Sekwencjonowanie długich odczytów oferuje potencjalne zalety w zakresie dokładności i czasu uzyskania wyników.
- Wiedza z zakresu bioinformatyki często stanowi barierę dla skutecznej diagnostyki.
Cel badania
- Ocena skuteczności sekwencjonowania długich odczytów w diagnostyce gruźlicy.
- Opracowanie kompleksowego profilu oporności na podstawie próbek klinicznych.
- Uproszczenie procesu wykrywania oporności na leki.
Zastosowane metody
- Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji 18 regionów oporności na leki.
- Wykorzystanie potoku bioinformatycznego specyficznego dla gruźlicy.
- Przygotowanie próbek obejmujące precyzyjny pomiar amplikonów.
- Dostosowanie objętości próbek w celu uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania.
Główne wyniki
- Sekwencjonowanie długich odczytów wykazało dokładność porównywalną ze złotymi standardami.
- Osiągnięto krótszy czas oczekiwania na wyniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Protokół ten ułatwił kompleksową diagnostykę TB.
- Możliwe było usprawnione śledzenie ognisk zachorowań w środowiskach o ograniczonych zasobach.
Wnioski
- Przenośne sekwencjonowanie długich odczytów może usprawnić diagnostykę gruźlicy w warunkach ograniczonych zasobów.
- Metoda ta zmniejsza zapotrzebowanie na szeroką wiedzę z zakresu bioinformatyki.
- Podejście to ma potencjał, aby przekształcić strategie zarządzania i kontroli gruźlicy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przenośne sekwencjonowanie amplikonów o długich odczytach umożliwia szybką i kompleksową detekcję mutacji lekooporności w gruźlicy bezpośrednio z próbek klinicznych, wypełniając krytyczne luki diagnostyczne w regionach o ograniczonych zasobach. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną profilowania oporności i przyspiesza uzyskiwanie praktycznych informacji niezbędnych do zarządzania portfelem chorób zakaźnych. Jego wdrożenie może zminimalizować ryzyko związane z wczesnymi decyzjami diagnostycznymi oraz rozszerzyć dostęp do wysokiej jakości testów molekularnych w różnych regionach geograficznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę wariantów genetycznych związanych z opornością w izolattach klinicznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną mechanizmów oporności w celu priorytetyzacji celów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzanie powiązań między wariantem a lekiem.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze markerów oporności do rozwoju diagnostyki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane panele amplikonów dla przepływów pracy w wysokoprzepustowym screeningu oporności.
- Dostarcza ilościowe dane o częstotliwości wariantów w celu określenia progów czułości testu.
- Wspiera powtarzalną detekcję wysokoczęstotliwościowych mutacji oporności w różnych platformach.
- Umożliwia skalowalne wdrożenie przenośnego sekwencjonowania dla testów zdecentralizowanych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia uzgodnienie wykrywania wariantów oporności ze strategiami translacyjnymi dotyczącymi biomarkerów w programach walki z chorobami zakaźnymi.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkrycia markerów oporności do przedklinicznej walidacji testów diagnostycznych.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko w celu rozwoju kandydatów na testy diagnostyczne celowane w gruźlicę lekooporną.
- Wspiera śledzenie ognisk zachorowań i nadzór epidemiologiczny w środowiskach badań translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sekwencjonowania łączy wczesną fazę odkryć, opracowywanie testów oraz badania translacyjne, umożliwiając szybkie profilowanie oporności w warunkach terenowych oraz wspierając rozwój narzędzi diagnostycznych w oparciu o analizę danych.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza mechanizmy oporności i zależności między wariantami a lekami w próbkach klinicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wykrywanie wariantów w celu optymalizacji testów.
- Analityka: Generuje dane o wysokim pokryciu, zgodne między platformami, dla genów związanych z opornością.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i nadzór nad ogniskami zakażeń w procesach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje przenośną, skalowalną możliwość sekwencjonowania, którą można dostosować do wielu celów związanych z chorobami zakaźnymi.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w określaniu profili oporności i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza wymagania infrastrukturalne i umożliwia szybkie, zdecentralizowane testowanie.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go w zakresie opracowywania i wdrażania diagnostyki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów diagnostycznych dla patogenów lekoopornych w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu amplikonów i realizacji przepływu pracy sekwencjonowania.
- Wymaga dostępu do przenośnej aparatury do sekwencjonowania długich odczytów oraz potoków bioinformatycznych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie obsługi próbek i analizy danych.
- Konieczne jest dostosowanie protokołów do zmiennej jakości próbek i wydajności amplikonów.
- Wykrywanie wariantów o niskiej częstotliwości może być ograniczone w porównaniu z platformami do sekwencjonowania krótkich odczytów o wysokiej dokładności.
