Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł. Synteza białek obejmuje silnie regulowane procesy, transkrypcję i translację. Transkrypcja jest regulowana głównie przez czynniki transkrypcyjne, modyfikacje chromatyny oraz RNA regulacyjne.

Translacja jest regulowana przez czynniki inicjacyjne, szlaki sygnalizacyjne i mechanizmy stabilności RNA. Te systemy regulacyjne pozwalają komórkom utrzymywać funkcje komórkowe i skutecznie reagować na stres lub uszkodzenia. Komórki nowotworowe dysregulują syntezę białek, przejmując mechanizmy translacyjne, aby wspierać wysokie zapotrzebowanie energetyczne i niekontrolowany wzrost.

To przeprogramowanie jest wynikiem dysregulacji niemal wszystkich głównych onkogennych szlaków sygnalizacyjnych, co sprzyja przetrwaniu, proliferacji i przerzutom komórek, jednocześnie hamując szlaki śmierci komórkowej. Ponieważ ta zwiększona synteza białek jest kluczowa dla przeżycia w raku, leczenie ukierunkowane i blokujące ten proces wykazują obiecujące możliwości terapii. Aby zidentyfikować inhibitory syntezy białek, można zastosować następujący test hamowania syntezy białek – fluorescencję.

Przed rozpoczęciem eksperymentu, aby uzyskać wiarygodne wyniki, związki muszą być podawane w odpowiednim stężeniu poniżej progu toksyczności. Aby ustalić stężenie początkowe, należy przeprowadzić test cytotoksyczności w celu określenia EC 50 w związku. Jeśli nie jest to możliwe, związki zawarte w tym testie można przebadać w sposób zależny od dawki, aby określić najbardziej efektywne parametry stężenia.

Jeśli stężenie związków powoduje śmierć komórki, konieczne staje się badanie w niższych stężeniach. Ważne jest również, aby chronić barwniki przed światłem przez cały czas, gdy nie są używane. Dłuższa ekspozycja na światło prowadzi do fotobielenia, co prowadzi do pogorszenia jakości danych.

Krok 3.1: przygotować mieszankę główną A, oznaczyć rurkę wirówki jako A, następnie pipetować 598,5 mikrolitra podłoża hodowlanego i 1,5 mikrolitra białka do A. Ponownie zawiesić tę mieszaninę, aby zapewnić jednorodność poprzez pipetowanie w górę i w dół. Teraz przygotuj mieszankę główną B. Oznacz rurkę wirówki jako B, następnie pipetuj 1,5 mikrolitra białkowego znaku, 6,6 mikrolitra cykloheksimidu i 591,9 mikrolitra pośrodka hodowlanego do B. Ponownie zawiesij tę mieszaninę, aby zapewnić jednorodność poprzez pipetowanie w górę i w dół. Po pipetowaniu jednego mikrolitra substancji testowej i jednego mikrolitra nośnika do dwóch dołków, delikatnie pipetuję 99 mikrolitrów mieszanki głównej A do obu tych dołków, pipetuję pod kątem w stronę boku, aby zapobiec zakłóceniu kinetycznym komórek.

Podaj pipetą 100 mikrolitrów mieszanki B do dwóch nieoczyszczonych dołków. Pipetę podkładaj pod kątem w bok dołka, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek. Delikatnie stuknij w płytę, aby uzyskać dokładne włączenie pożądanych składników do komórek.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do dwóch godzin. Usuń podłoże z hodowli komórkowej poprzez aspirację. Przechyl płytkę i zasysaj z boku dołka zamiast w środku, aby zapobiec zakłóceniom kinetycznym komórek.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu PBS do każdego dołka i wiruj płytę w 900g przez pięć minut. Po wirowaniu pamiętaj, aby usunąć bufor PBS przez aspirację. Krok piąty: fiksacja i permeabilizacja.

Dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalacza do każdego dołku. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemnym środowisku. Następnie zasysaj komórki.

Przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu i usuń przez aspirację. Powtórz to dwa razy. Do każdego dołku dodaj 100 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego.

Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń bufor permeabilizacyjny przez aspirację. Krok szósty: reakcja białkowa i barwienie.

Przygotuj mieszankę koktajli reakcyjnych. Dodaj 651 mikrolitrów buforu PBS do rurki wirówki. Następnie dodaj siedem mikrolitrów 100x odczynnika miedzi.

Następnie siedem mikrolitrów azydu fluorescencyjnego. Na koniec dodaj 35 mikrolitrów środka redukującego do rurki wirówki. Stosuj się dokładnie do tej kolejności przy dodawaniu odczynników, a następnie dodaj 100 mikrolitrów koktajlu reakcji do każdego dołku.

Inkubuj komórki przez 30 minut w ciemnym środowisku w temperaturze pokojowej, aby zapobiec fotobieleniu. Wiruj ogniwa w 900g przez pięć minut. Aspiruj, myj komórki, a potem ponownie aspiruj.

Przygotuj 1x rozcieńczenie całkowitego barwienia DNA i dodaj 100 mikrolitrów do każdego dołku. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemnym środowisku, aby zapobiec fotobieleniu. Wiruj płytę w 900g przez pięć minut.

Przemyj komórki 100 mikrolitrami buforu do mycia, usuwaj przez aspirację. Powtórz ten krok dwa razy. Na koniec ponownie zawiesij komórki 100 mikrolitrami schłodzonego buforu PBS, aby przygotować je do obrazowania.

Krok ósmy, obrazowanie. Włóż płytkę do czytnika płyt i ustaw powiększenie na 20x. Przeanalizuj barwienie jądra za pomocą kanału GFP o średnicy 469/525 nanometrów.

Stosuj automatyczne zginanie i autofokus, aby poprawić wyniki obrazowania. Przeanalizuj aktywną syntezę białek za pomocą kanału Texas Red o średnicy 586/647 nanometrów. Stosuj automatyczne zginanie i autofokus, aby poprawić wyniki obrazowania.

Sondy fluorescencyjne są wrażliwe na fotobielenie, czyli zjawisko, w którym promieniowanie z naświetleniem powoduje utratę fluoroforów ich właściwości fluorescencyjnych. Barwniki powinny być zawsze chronione przed światłem, gdy nie są używane. Dodatkowo należy ograniczyć liczbę skanów w każdej studni i czasie pod napromieniowanym światłem.

Długotrwała ekspozycja na światło prowadzi do fotobielenia, co ostatecznie prowadzi do pogorszenia jakości danych. Spójrzmy na reprezentatywne wyniki. Żywe komórki tutaj są widoczne na zielono, a aktywna synteza białek jest oznaczona czerwienią.

Znany inhibitor syntezy białek cykloheksymid powoduje znaczny spadek syntezy białek, co widać na rysunku 1B. W porównaniu do negatywnego DMSO z rysunku 1A, emituje się mniej czerwonego światła fluorescencyjnego. Leczenie związkiem 1, jak pokazano na rysunku 1C, skutkowało albo odłączeniem komórek, albo śmiercią komórek. Dlatego nie możemy wysuwać żadnych jednoznacznych twierdzeń dotyczących aktywności hamującej syntezę białek.

Wymaga to dalszych badań dawkowo-odpowiedzi, aby ustalić, czy hamuje syntezę białek przy niższych stężeniach. Związek drugi wykazuje umiarkowane hamowanie syntezy białek, jak pokazano na rysunku 1D. Ten test fluorometryczny jest cennym narzędziem badawczym i dostępną metodą biologii chemicznej do kształcenia studentów studiów licencjackich.

Dzięki zapewnieniu dostępnego, wydajnego protokołu z minimalnym przetwarzaniem danych, zapewnia studentom praktyczne doświadczenie oraz nowoczesne techniki odkrywania leków oraz przyspiesza proces odkrywania leków. Protokół wykorzystuje fluorescencyjne podłoże oraz zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej do systematycznego wykrywania i mierzenia właściwości hamujących związków naturalnych produktów jeden i dwa. Stosując cykloheksimid jako inhibitor referencyjny, oba produkty naturalne wykazywały różne poziomy hamowania syntezy białek.

Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na nowe inhibitory syntezy białek, takie podejście wyposaża studentów licencjackich w znaczące możliwości badawcze, jednocześnie przyczyniając się do postępu w terapii onkologicznej.